检测口蹄疫血清抗体的方法
O型口蹄疫免疫效果抗体监测方法比较
６ ，０ ％相 关 ． 度一 致 原 因可 能是 正 ０ １０ 高
向 问 接 血 试 验 结 果 判 定 存 在 人 员 主 观 偏 差 ； 或 是 不 同 的 试 剂 所 含 的抗 原 病 毒 蛋 白 不 同 出 现 所 监 测 抗 体 中 的 一 部 分 是 针
明 书 进 行 ９ 孔 酶 标 板 检 测 按 １份 样 本 ６ ０
２ 年第４）７ ０ （３ 第期 １ ２ 卷
表 １ １ Ｏ号 样 本 抗 体 效 价 范 围 １
布局。 抗体 效价 范 围从 １ １ （ 孔 ） ： ８ ３ 到最 高
１ １ ２ （０ ） 记 录 方 式 为 最 大 稀 释 倍 ： ０ ４ １孔 。 数孔 数
Ｏ型 口蹄 疫 是 世 界上 危 害最 严 重 的畜 禽传 染病 之 一 ， 感 染所 有 的偶 蹄 动 物 ． 养 殖业 构 成 严 重威 胁 ． 对 可造 成 严 重 的经 济损 失和 国 际畜产 品 贸易 的负 面影 响。 业部 将其 农
Ｅ ＩＡ试剂 盒 ， ＬＳ 均为 中 国农 业科 学 院兰 州兽 医研究 所生 产 。 １１ 试验样本 ： ．． ２ 随机从某养殖场采集牛血清６ ｆ 。 Ｏ￣ 被采样 牛 ｆ 于采样前８ｄ 分别免疫Ｏ 亚Ｉ 口蹄疫联价疫苗两次。 Ａ２ｄ 型一 型
’ 文 章 编 号 ：０ ４ ５ ９ （０ ２ ０ － ０ ４ ０ １ ０ － ０ ０ ２ １ ）７ ０ ０ — ２ 型 口蹄 疫 液 相 阻 断 Ｅ Ｓ 试 剂 盒 、亚 Ｉ 口蹄 疫 液 相 阻 断 ＬＡ 型
关 键 词 ： 型 口蹄 疫 ； 测 方 法 ； 向 间接 血 凝 ； 相 阻 断 Ｅ ＩＡ ｏ 监 正 液 ＬＳ 文 献 标 识 码 ： Ｂ
口蹄疫病毒O型、A型抗体管式化学发光免疫分析检测方法
ICS 11.220 B 41团体标准T/CVMA X25—2019口蹄疫病毒O 型、A 型抗体管式化学发光免疫分析检测方法Tubular Chemiluminescence Immunoassay For Detecting Antibodies OfFoot and Mouth Virus(FMDV) Tipe O 、A2019 - XX - XX 发布2019 - XX - XX 实施中国兽医协会C V M A前 言本标准按 GB/T 1.1-2009给出的规则起草。
本标准由中国兽医协会提出并归口。
本标准起草单位：中国农业科学院兰州兽医研究所，中国动物疫病预防控制中心本标准主要起草人：林密、包艳芳、孙雨、蒋韬、马军武、何继军、王传彬，陈夏辉、郭建宏、宋晓晖，刘湘涛、杨林、李峰松、李昕、孙燕燕、杨光、贺华丽中国兽医协会C V M A引 言口蹄疫（Food-and-Mouth Disease,FMD ）是一种由口蹄疫病毒（Food-and-Mouth Disease Virus,FMDV ）引起的偶蹄动物共患烈性传染病，被世界动物卫生组织（Office International Des Epizooties,OIE ）列为法定报告病之一；《国家中长期动物疫病防治规划（2012—2020年）》（国办发〔2012〕31号）中，将口蹄疫（A 型、亚洲I 型、O 型）列为优先防治的5种动物疫病之一；其易感动物种类多，传播迅速，可造成大量动物感染死亡，该病的流行严重危害我国养殖业发展，影响相关动物及动物产品的国际贸易，给我国相关产业造成了巨大损失。
口蹄疫病毒在分类上属于小RNA 病毒科（Picornaviridae ），口蹄疫病毒属，总共有7个血清型，在我国流行的主要有O 型、A 型和Asia1型，其中2009年后主要流行毒株为O 型 Mya-98 毒株、A 型 Sea-97 毒株，防控形势依然严峻。
三种猪O型口蹄疫免疫抗体检测方法的比较
即样 品 Ｏ ６ ０ ｍ 值 ≥０４时 判 为 阳性 ． Ｄ ３ｎ ． 为 免 疫 合 格 ：样 品 Ｏ ６ ０ ｍ 值 ＜ － Ｄ ３ｎ ０４时
判为阴性。
２ 结 果
差异不显著 （＞ ． ） Ｐ ０ ５ ，且 具 有 良好 的 ０
相 关性
份 ，分离 血清 ，一 ０ 冰箱 冻 存 。 ２℃
让 兔 子在 中午 高 温 期 间 少 活 动 多休 息 。
５ 供 应 充足 饮 水 高 温 期 间要 满 足清 洁饮 水 的供 应 。还
王敏生 华 玉新 一 江苏省 金湖县塔 集中 心畜牧兽 医站 １ １ １ ）
可 以 自制 清 凉 的植 物饮 料 ｉ 兔 子 饮 用 ： 卜
（ ） 西瓜 皮 汤 ： 西 瓜 皮 洗 净 ｌ千 克 ， １ 水 ５干 克 ，煮 开 后 放 凉 饮用 ：
时 即 可 发 生 红 细 胞 凝 集 现 象 。 可 检 测
正 向 间接 血凝 （ Ａ）试 验 、阻 断 Ｉ Ｈ
夹 心 ＥＵＳ 和 间 接 Ｅ Ａ 按 生 产 厂 家 Ａ ＵＳ
说 明 书进 行 操 作 。
１２２・ 疫 判 定 标 准 ．－ 免
测 方 法 的 相 关 性 和 特 点 ，本 试 验 选 用
附 表
３ 讨 论
１２１ 检 测 方法 ．．
正 向 间接 血凝 是 当 前最 为快 速 、 简 便 和 经 济 的 检 测 血 清 方 法 １。 是 将 ２ ｌ 灭 活 的 各 型 病 毒 致 敏 绵 羊 红 细 胞 制 备 的 诊 断 试 剂 ， 当 其 遇 到 相 应 型 的 血 清
４ 科 学 饲 养
饲养管理 ｌ
早 上 要 喂 得早 ，晚 上要 喂得 迟 ，中 午
检测口蹄疫病毒抗原的方法
检测口蹄疫病毒抗原的方法（一）口蹄疫反向被动红细胞凝集试验（反向被动血凝）红细胞膜具有吸附抗原或抗体的特性，将提纯的口蹄疫抗体（IgG）在pH4.0醋酸缓冲液中致敏绵羊红细胞，当这种被致敏的红细胞（即红细胞表面均带有口蹄疫抗体），遇到相应的口蹄疫病毒抗原时，便产生抗原抗体的特异性反应，从而使红细胞发生肉眼可见的凝集现象。
该法快速、简便、准确、可同步鉴定出口蹄疫毒型和鉴别口蹄疫、猪水泡病病原。
1．试验材料V型96孔130o血凝滴定板、玻璃吸管（1毫升、5毫升规格）、玻璃中试管（内径15毫米，长度100毫米）、试管架、微量振荡器、微量移液器、塑料咀、玻璃板（与血凝板大小一致）、口蹄疫O、A、C、Asia-I 型、SVD（猪水泡病）反向被动血凝诊断试剂及其配套用的口蹄疫各型、猪水泡病阳性抗原、阴性抗原、稀释液、待检抗原。
２．试验方法（１）稀释待检抗原取中试管8支，横列于试管架上，每管各加入稀释液1 毫升，取待检抗原1毫升加入第1管混匀后从中取出1毫升加入第2管，混匀后取1毫升加入第3管……直至第8管，此时待检抗原的稀释度依次为1：6、1：12、1：24、1：48、1：96、1：192、1：384、1：768。
（２）稀释阴性抗原取中试管1支用记号笔标明“阴抗”字样，加入稀释液390微升，加入阴性抗原10微升，充分混匀，此时阴性抗原的稀释度为1：40。
（３）稀释阳性抗原取中试管20支，横列于管架标明“阳抗”字样，每排4支，（O型4支、A型4支、C型4支、Asia-1型4支、SVD4支）。
每种阳抗第1管，加稀释液4.7毫升，第2~4管各加稀释液0.5毫升。
取O型阳性抗原0.1毫升(100微升)加入第1排的第1管中混匀后取出0.5毫升，加入第1排的第2管并充分混匀，取出0.5毫升加入第1排的第3管混匀后取出0.5毫升加入第1排的第4管并混匀。
其他阳性抗原均按上法稀释，注意每稀释一种阳抗必须更换1支吸管，切勿混杂以免影响反应的特异性。
猪亚洲l型口蹄疫免疫抗体检测与分析
猪亚洲l型口蹄疫免疫抗体检测与分析作者：邵胜勇来源：《畜牧兽医科学》 2018年第4期猪亚洲I型口蹄疫免疫抗体检测与分析邵胜勇（北京市顺义区动物疫病预防控制中心，北京 101300）摘要：口蹄疫是世界动物卫生组织(OIE)规定的A类烈性动物传染病，我国列为一类动物传染病。
口蹄疫共有7种血清型，亚洲I型是其中一种。
目前，国内还没有对猪亚洲I型口蹄疫进行强制免疫，我们通过2015-2017年对13958头猪进行亚洲I型口蹄疫免疫抗体的检测，旨在对本地区猪群通过免疫口蹄疫O型-亚I型疫苗产生的抗体进行监测，掌握群体免疫抗体水平，评价免疫疫苗的有效性，并对免疫效果进行总结，对生产中发现的问题进行分析，提出解决的对策。
方法为：猪群在免疫口蹄疫O型-亚洲I型二价灭活疫苗28d至4个月之间，免疫次数从一免至五免，采集猪血清，以亚洲I型口蹄疫抗体液相阻断ELISA检测试剂盒，定量检测样品抗体水品。
通过分析检测数据，得出如下结论：猪亚洲I型口蹄疫免疫抗体阳性率和抗体水平总体不高，但具备较好的保护力；商品猪免疫抗体阳性率和抗体水平均高于种猪；免疫抗体阳性率随免疫次数增加呈逐渐上升趋势，但四免后阳性率下降，到五免时则再次上升。
通过检测免疫抗体，分析其变化特征及规律，为猪亚洲I型口蹄疫的防控、研究及免疫提供依据。
关键词：口蹄疫；亚洲I型；免疫抗体；检测中图分类号：S858.28 文献标识码：B doi：10.3969/j.issn.2096-3637.2018.04.0021 方法1.1 疫苗疫苗均为口蹄疫O型-亚洲I型二价灭活疫苗，中牧实业股份有限公司兰州生药厂生产。
1.2 疫苗免疫及样品采集由于实际生产中不对猪进行亚洲I型口蹄疫单独免疫，因此免疫程序均按照口蹄疫O型-亚洲I型二价灭活疫苗的免疫程序进行免疫，即仔猪30日龄时首免，1个月后二免，之后每4个月免疫1次。
所检测血清样品均为免疫后28天至4个月以内的样品，免疫次数从一免至五免。
口蹄疫液相ELISA抗体检测试剂盒加样操作说明
口蹄疫新液相抗体检测试剂盒加样操作说明一、检测10份样本1、如图所示，A1-A10加175ul的洗涤液（1×PBST），A11、A12、B12加100ul的洗涤液（1×PBST），B1-B11、C1-C11、D1-D11、E1-E11、F1-F11、G1-G11、H1-H11加100ul的洗涤液（1×PBST）。
2、A1-A10加25ul的待检血清，A11加100ul的阳性对照，A12加100ul的阴性对照，用排枪吹打混匀（每孔吹打6-7次），待检血清1-10列以100ul的量从A到H连续2倍稀释；阳性对照第11列以100ul的量从A到H连续2倍稀释；阴性对照第12列以100ul的量从A到B连续2倍稀释。
3、各孔稀释比例为，如图所示：4、转板，从血清稀释板转到包被板的对应孔，每孔50ul。
再加稀释后的病毒抗原，1-11列各加入50ul，A12、B12各加入50ul，E12、F12、G12、H12各加入100ul。
5、加样完毕后，每孔的最终量均为100ul，待检血清、阳性对照、阴性对照的稀释度翻倍，如图所示：二、检测20份样本1、如图所示，A1-A10、E1-E10加175ul的洗涤液（1×PBST），A11、E11、A12、B12加100ul 的洗涤液（1×PBST），B1-B11、C1-C11、D1-D11、F1-F11、G1-G11、H1-H11加100ul的洗涤液（1×PBST）。
2、A1-A10、E1-E10加25ul的待检血清，A11加100ul的阳性对照，A12加100ul的阴性对照，用排枪吹打混匀（每孔吹打6-7次），待检血清1-10列以100ul的量从A到D、从E到H连续2倍稀释；阳性对照第11列以100ul的量从A到H连续2倍稀释；阴性对照第12列以100ul的量从A到B连续2倍稀释。
3、各孔稀释比例为，如图所示：4、转板，从血清稀释板转到包被板的对应孔，每孔50ul。
简述口蹄疫免疫抗体监测的方法及意义
一、检测方法特异性抗体检测在疫病诊断、传染病流行病学调查及评价疫苗免疫效果评价具有重要的参考意义。
现阶段，抗体检测的方法较多，除传统的沉淀反应，凝集试验，补体结合试验外，标记免疫测定已成为主要的免疫抗体测定技术(如酶联免疫测定、放射免疫测定、荧光免疫测定、发光免疫测定等)，而酶联免疫测定是目前应用最为广泛的方法之一。
1.中和抗体中和抗体是当病原微生物侵入机体时产生的相应的抗体。
病原微生物入侵细胞时需要依赖病原体自身表达的特定分子与细胞上的受体结合，才能感染细胞，并进一步扩增。
中和抗体是B淋巴细胞产生的某些抗体，中和抗体的作用机制是改变病毒表面构型，阻止病毒吸附于易感细胞，使病毒不能穿入胞内进行增殖；病毒与中和抗体形成的免疫复合物，易被巨噬细胞吞噬清除；有包膜的病毒表面抗原与中和抗体结合后，激活补体，可导致病毒的溶解。
病毒中和试验是世界动物卫生组织推荐的标准方法，抗体与口蹄疫病毒特异性中和作用使病毒失丧失感染力，需要培养病毒敏感细胞；所需的病毒必须为活病毒，具有感染性。
2、结构蛋白抗体在原则上来说，只要是异己蛋白质进入机体，就会被免疫系统识别，然后产生相应抗体。
灭活疫苗的本质是一种抗原，只不过它通过改造已经没有了病毒的毒性。
当疫苗注入到机体之后，由于病毒抗原含有多种不同的蛋白，因此机体会产生不同的抗体。
然而，并非所有的结构抗体都有抗病毒的作用。
中华人民共和国农业农村部规定的口蹄疫免疫抗体评价的方法分别为液相阻断E L I S A抗体检测试验、正向间接血凝试验、V P1结构蛋白抗体检测试验。
2.1液相阻断ELISA抗体检测试验（国际贸易指定法）我国目前采取以免疫为主的综合防控措施进行口蹄疫防控，免疫抗体检测是衡量疫苗免疫效果的重要指标。
目前,国际粮农组织（FAO）和世界动物卫生组织推荐液相阻断ELISA来对口蹄疫免疫效果进行评价。
硏究表明口蹄疫液相阻断ELISA抗体检测技术具有良好的敏感性、快速诊断性和可重复性,与攻毒保护有很好的相关性,现被广泛应用于口蹄疫免疫抗体水平的监测。
猪口蹄疫病毒(FMDV)Elisa试剂盒说明书
猪口蹄疫病毒(FMDV)Elisa试剂盒说明书本试剂盒仅供研究使用。
检测范围： 96T15ng/L – 480ng/L使用目的：本试剂盒用于测定猪血清、血浆及相关液体样本中口蹄疫病毒(FMDV)含量。
猪口蹄疫病毒(FMDV)Elisa试剂盒说明书实验原理本试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中猪口蹄疫病毒(FMDV)水平。
用纯化的猪口蹄疫病毒(FMDV)抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入口蹄疫病毒(FMDV)，再与HRP标记的口蹄疫病毒(FMDV)抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物TMB显色。
TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。
颜色的深浅和样品中的口蹄疫病毒(FMDV)呈正相关。
用酶标仪在450nm波长下测定吸光度(OD值)，通过标准曲线计算样品中猪口蹄疫病毒(FMDV)浓度。
试剂盒组成1 30倍浓缩洗涤液20ml×1瓶 7 终止液6ml×1瓶2 酶标试剂6ml×1瓶 8 标准品(960ng/L) 0.5ml×1瓶3 酶标包被板 12孔×8条 9 标准品稀释液1.5ml×1瓶4 样品稀释液6ml×1瓶 10 说明书 1份5 显色剂A液6ml×1瓶 11 封板膜 2张6 显色剂B液6ml×1/瓶 12 密封袋 1个标本要求1．标本采集后尽早进行提取，提取按相关文献进行，提取后应尽快进行实验。
若不能马上进行试验，可将标本放于-20℃保存，但应避免反复冻融2．不能检测含NaN3的样品，因NaN3抑制辣根过氧化物酶的(HRP)活性。
操作步骤1. 标准品的稀释：本试剂盒提供原倍标准品一支，用户可按照下列图表在小试管中进行稀释。
480 ng/L 5号标准品 150μl的原倍标准品加入150μl标准品稀释液240 ng/L 4号标准品 150μl的5号标准品加入150μl标准品稀释液120ng/L 3号标准品 150μl的4号标准品加入150μl标准品稀释液60 ng/L 2号标准品 150μl的3号标准品加入150μl标准品稀释液30 ng/L 1号标准品 150μl的2号标准品加入150μl标准品稀释液2. 加样：分别设空白孔(空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同)、标准孔、待测样品孔。
口蹄疫A型抗体检测试剂盒(酶联免疫法) 使用说明书
口蹄疫A型抗体检测试剂盒（酶联免疫法）使用说明书【产品名称】通用名：口蹄疫A型抗体检测试剂盒（酶联免疫法）英文名：Test Kit for Antibodies to Foot and Mouth Disease Virus A（ELISA）【包装规格】×2/盒96T×1/盒、96T、96T×5/盒【预期用途】口蹄疫是由口蹄疫病毒（Foot and Mouth Disease Virus，FMDV）引起的偶蹄动物的一种急性、热性、高度接触性传染病，其特征为口腔黏膜、蹄部、乳房皮肤发生水泡和烂斑。
本试剂用于检测牛、羊、猪血清中口蹄疫A型抗体，可用于口蹄疫A型疫苗免疫效果评价。
【原理】本试剂盒由预包被口蹄疫A型抗体的酶标板、抗体工作液、抗原液、酶标记物及其他配套试剂组成，应用阻断酶联免疫法（ELISA）原理检测牛、羊、猪血清样本中口蹄疫A型抗体。
实验时将稀释的样本与抗原液同时加入酶标板中孵育，样本中的抗体与酶标板上的抗体竞争抗原，阻断抗原与板的结合；经洗涤后，再加抗体工作液孵育；经洗涤后加入酶标记物孵育；再经洗涤除去未结合的酶标记物，在孔中加底物液，与酶标结合物反应形成蓝色产物，显色深浅与样品中的特异性抗体含量成负相关；加入终止液终止反应后，产物变为黄色；用酶标仪在450nm波长测定各反应孔中的吸光值，即可知样品是否含有口蹄疫A型抗体。
【试剂盒组成】【储存及有效期】2～8℃保存，有效期12个月。
包被板开封后请于2～8℃避光保存，避免受潮。
使用期限为2个月。
【适用仪器】含450nm、630nm波长的酶标仪，37℃恒温设备，可调微量移液器。
【样品准备】1.取动物全血按常规方法制备血清，要求血清清亮，无溶血、无污染。
样品1周内可于2～8℃保存，长期需置-20℃保存。
2.用工作洗涤液将待检牛、羊先按32倍稀释（如5μl 血清加入155μl 工作洗涤液中，混匀），待检猪血清按16倍稀释（如5μl 血清加入75μl 洗涤液中，混匀），阴、阳性对照不用稀释。
口蹄疫监测诊断作业指导书
口蹄疫监测诊断作业指导书一、口蹄疫病毒VP1结构蛋白抗体检测酶联免疫吸附试验1.适用范围用于检测猪、牛、羊血清中的口蹄疫病毒VPI结构蛋白抗体，与猪、牛、羊口蹄疫病毒非结构蛋白抗体酶联免疫吸附试验诊断试剂盒联合使用，可区分口蹄疫病毒感染动物及疫苗免疫动物。
检测猪血清应用猪口蹄疫病毒VP1结构蛋白抗体酶联免疫吸附试验诊断试剂盒；检测牛、羊血清应用牛、羊口蹄疫病毒VP1结构蛋白抗体酶联免疫吸附试验诊断试剂盒。
2.检测试剂口蹄疫病毒VP1抗原包被板、样品稀释液、酶结合物、阴性对照、VP1阳性对照、酶结合物稀释液、TMB底物A液、TMB底物B液、终止液（l.OMHZSO。
）、浓缩洗涤液、稀释板、一次性封板膜、微孔定位标签。
3.检测步骤3.1使用前将试剂盒恢复到室温，避免阳光直射或放置在30℃以上的环境中。
3.2取出试剂盒中的样品稀释液。
A1、B1两孔作为阴性对照，Cl、D1两孔作为阳性对照孔，其余孔作检测孔，每孔一个样品。
3.3在稀释板的各孔中加200样品稀释液。
在相应各孔中分别加入10此对照血清或被检血清样品。
用加样器重复吹吸数次。
稀释每个样品时必须使用不同的吸头。
3.4取出抗原包被板。
3.5分别从稀释板上取稀释后的对照血清和被检血清各100此，加至抗原包被板的相应孔中，加益或封膜后，置37士2℃下孵育60士5分钟。
3.6洗涤工作液配制：按需要量，用去产离子水或双蒸水将洗涤液作25倍稀释。
3.7用洗涤工作液洗涤抗原包被板，每孔300吨，洗涤6次，拍干。
3.8酶结合物工作液配制：用酶结合物稀释液将酶结合物作100倍稀释，现配现用。
3.9每孔加入100此酶结合物工作液，加盖或封膜后，置37±2℃下孵育30±2分钟。
3.10重复3.7。
3.11TMB底物工作液配制：将TMB底物B液和TMB底物A液等量混合，现配现用。
3.12每孔加入100此底物工作液，加盖或封膜后，置37±2℃下孵育15±1分钟。
口蹄疫O 型抗体ELISA 检测血清稀释方法优化比较
资金项目：山东省农科院农业科技创新工程项目“畜禽重要疫病防控关键技术（CXGC2016B14）”；山东省现代农业产业技术体系生猪创新团队项目（SDAIT-08-17）。
作者简介：李玲（1983—），女，助理研究员,硕士，研究方向为畜禽疫病防控与生物制品研发。
*通讯作者口蹄疫O型抗体ELISA检测血清稀释方法优化比较李玲1,魏凤2,郝胜楠3,吕素芳2,李峰2*（1.山东绿都生物科技有限公司山东滨州256600;2.山东省滨州畜牧兽医研究院山东滨州;3.东营市河口区畜牧业发展服务中心山东东营257200）试验选择液相阻断ELISA检测试剂盒，对20份血清样品检测口蹄疫O型抗体。
试验比较了1:8起始稀释8个梯度，1:16起始稀释4个梯度，1:32起始稀释4个梯度，1:64起始稀释4个梯度4种方法抗体效价测定结果，其阳性率分别为70%、65%、70%、70%，组间差异不显著。
提出了针对不同检测需求，合理选择血清稀释方法的建议，有助于指导临床应用。
蹄疫；O型抗体；血清；稀释方法口蹄疫（FMD）具有传染性强、传播速度快、感染动物种类多等特点[1]，世界动物卫生组织(OIE)将其列为必须报告的动物疫病，我国将其列为一类动物疫病。
我国制定实施了“国家口蹄疫防治计划”（2016—2020年），对O型口蹄疫，采取分阶段、分区域控制策略[2]。
2020年国家动物疫病强制免疫计划，要求口蹄疫的群体免疫密度应常年保持在90%以上,免疫抗体合格率全年保持在70%以上[3]。
此外，农业农村部明确对跨省调运乳用种用动物需依据“口蹄疫防治技术规范”等开展口蹄疫抗体检测[4]。
因此，牛、羊、猪口蹄疫抗体检测已成为基层常规检测项目，其中以液相阻断ELISA方法应用较多，李小明等[5]研究表明该方法灵敏性和特异性高，重复性好，结果判定科学且不受检验人员主观性影响。
我们在该方法检测口蹄疫O型抗体时，选择不同的血清稀释方法，并就其结果差异性进行了比较，旨在根据检测对象与检测目的，选择合适的血清稀释方法，实现提高检测效率、节约实验室资源的目的。
口蹄疫血清抗体阴性实验牛筛选方法的探讨
中国动物保健2024.02实践案例摘要：牛口蹄疫疫苗属于国家强制免疫疫苗，牛口蹄疫产品的动物检验是反映该批次产品是否安全有效的重要评判依据。
口蹄疫阴性实验牛筛选的速度决定着该批次产品是否能快速投入市场。
本实验使用口蹄疫抗体胶体金检测技术对实验牛进行阴阳性初筛，然后用口蹄疫抗体液相阻断ELSIA 技术对阴性动物进行复核确认，可以实现快速筛选抗体阴性实验牛，完成口蹄疫疫苗动物实验评估。
关键词：口蹄疫抗体胶体金、液相阻断ELSIA口蹄疫血清抗体阴性实验牛筛选方法的探讨张常锁1，曹剑1，陈君1，刘强德1，张金凤1，王马军1，吕鲁杰2，贺笋*（1.天康生物制药有限公司乌鲁木齐830011；2.北京标驰泽惠生物科技有限公司北京102629）收稿日期：2023-04-17作者简介：张常锁（1981—），男，内蒙古赤峰人，本科，主要从事动物病原实验室管理工作，E-mail ：zhangchangsuo@ 。
*通信作者：E-mail ：*******************口蹄疫疫苗属于国家强制免疫疫苗，国家和WOAH 均规定了相应的检测方法[1]，有些方法操作程序较为复杂，耗时较长。
目前国内牛群免疫范围较广，普免力度大。
在牛、羊口蹄疫疫苗的动物评估过程中，主要使用液相阻断ELSIA 方法筛选口蹄疫血清抗体≤23的实验牛[2-6]。
目前国内口蹄疫疫苗生产厂家通常以厂区为中心，购买辐射周边几百公里内的实验牛并运回实验基地，再采集血清用液相阻断ELSIA 方法进行大范围筛选。
这种方法筛选实验牛阴性率不足15%，筛选时间长、成本高，浪费人力、物力。
利用综合筛选方法，技术人员可先在田间使用胶体金对牛进行口蹄疫抗体初筛[7-8]，初筛呈阴性的牛转运回实验基地后，再进行ELISA 复核筛选。
既可以快速完成动物评估，又降低了筛选成本。
1材料1.1血清待检田间牛血清500份。
1.2检测试剂盒1）口蹄疫胶体金试剂盒由北京标驰泽惠生物科技有限公司生产，O 型批号为106210415A ，A 型批号为107181123。
口蹄疫病毒非结构蛋白(NSP)抗体检测试验
口蹄疫病毒非结构蛋白（NSP）抗体检测试验一、介绍：口蹄疫（FMD）是由口蹄疫病毒（FMDV）引起的急性、热性高度接触性传染病，主要侵害偶蹄兽，一旦发病，将会引起严重的经济损失。
口蹄疫病毒属于微核糖核酸病毒科口蹄疫病毒属，目前已知共有7种血清型，即O型、A型、C型、SAT1、SAT2、SAT3和亚洲1型。
口蹄疫病毒（FMDV）非结构蛋白（NSP）特异性抗体的存在，通常用来证明宿主体内口蹄疫病毒已经感染或正在感染，非结构蛋白与结构蛋白不一样，没有血清型区分。
国际兽医局（OIE）规定的非结构蛋白血清学检测方法为EITB和ELISA。
韩国金诺VDPro FMDV 非结构蛋白（NSP）抗体检测试剂盒，是用阻断ELISA，重组FMDV NSP蛋白包被，过氧化物酶标记的单克隆抗体，来检测血清中非结构蛋白抗体是否存在。
适用对象包括猪、牛、山羊以及绵羊等。
二、试剂盒组成：三、注意事项：1、使用之前请仔细阅读操作说明；2、试剂盒储存条件：2-8℃；四、实验前准备：1、洗液10倍稀释：如20ml洗液，加入180ml去离子水混匀，备用。
2、TMB底物：使用前恢复到室温，因为低温可能导致不显色。
五、操作步骤：1、使用前将试剂盒所有组件恢复到室温（25±3℃），取出抗原包被板；2、标记好样品、阳性对照和阴性对照（对照各做两孔），每孔加入样品稀释液80μl，然后加入样品血清、阳性对照、阴性对照各20μl后进行震荡混匀；3、室温孵育60分钟；4、洗板：每孔加入洗涤液300μl，洗涤3次，最后在吸水纸上拍干；5、每孔加入100μl酶标抗体，室温孵育60分钟；6、重复步骤4，洗涤3次；7、每孔加入TMB底物反应液100μl，室温暗处放置15分钟。
六、读数：每孔加入50μl终止液，在酶标仪450nm波长处读数。
七、结果判定：1、实验有效性判定阴性对照OD值≥0.6阳性对照OD值≤0.32、计算方法3、判定标准SN值＞0.60 判为阴性；SN值≤0.60 判为阳性。
检测口蹄疫血清抗体的方法
检测口蹄疫血清抗体的方法〔一〕口蹄疫正向间接红细胞凝集试验〔间接血凝试验〕该试验是以口蹄疫O、A、C、Asia-1型病毒和猪水泡病病毒的细胞培养物〔细胞毒〕经PEG浓缩，蔗糖密度梯度超离后纯化的病毒抗原分别致敏戊二醛鞣酸处理的绵羊红细胞，而制成的血凝抗原，用于快速检测动物血清中的口蹄疫和猪水泡病特异抗体水平。
该法简易、快速、特异、直观、是当前测抗的实用方法。
1．试验材料 V型96孔110。
医用血凝滴定板、玻璃板〔与血凝板大小相同〕、微量移液器〔10~100微升〕、塑料咀、微量振荡器、1毫升/5毫升刻度玻璃吸管、玻璃中试管〔内径1.5毫米，长度100毫米〕、铝质试管架〔40孔〕、口蹄疫各型和猪水泡正向间接血凝诊断液、口蹄疫O、A、C、Asia-1型阳性血清、SVD阳性血清、阴性血清、稀释液。
2．试验方法根据试验目的可分为用于鉴别诊断；用于监测疫苗接种动物的抗体水平的检测方法。
（1）疫苗接种动物抗体水平监测方法接种何种疫苗就使用何种正向血凝诊断液。
①稀释待检血清在血凝板上1~8孔各加稀释液50微升，取待检血清50微升参加第1孔，混匀后从中取出50微升参加第2孔，混匀后从中取出50微升参加第3孔……直至第8孔混匀后从该孔取出50微升丢弃，保持每孔50微升的剂量。
此时1~8孔的血清稀释度依次为1：2、1：4、1：8、1：16；1：32、1：64、1：128、1：256。
②稀释阴性对照血清取中试管1支加稀释液1.5毫升，再加阴性血清0.1毫升，充分摇匀阴性血清的稀释度即为1：16。
③稀释阳性对照血清取中试管5支，第1管加稀释液3.1毫升，第2~5管分别加稀释液0.5毫升，取阳性血清0.1毫升参加第1管混匀后从中取出0.5毫升，参加第2管混匀后从中取出0.5毫升，参加第3管……直至第5管，此时各管阳性血清的稀释度低次为1：32、1：64、1：128、1：256、1：512。
④滴加对照孔取1：16稀释的阴性血清50微升参加血凝板的第10孔；取1：500稀释的阳性血清50微升参加第11孔；取稀释液50微升参加第12孔。
云南牛口蹄疫和布氏杆菌病血清学监测及防控措施分析
云南牛口蹄疫和布氏杆菌病血清学监测及防控措施分析摘要：本文对云南牛口蹄疫与布氏杆菌病血清学检测结果进行分析，并在这个的基层上提出可行有效的防控对策。
共收集云南省牛疫病控制实验室体系下2个综合试验站和3个区域推广站各示范场共计300份样本。
检测方法为口蹄疫A 型、亚洲Ⅰ型、O型免疫抗体相阻断酶联免疫吸附法，其中口蹄疫O型抗体阳性共244份，阳性率为81.33（244/300）；亚洲Ⅰ型抗体阳性共264份，阳性率为88.00%（264/300），A型抗体阳性共105份，阳性率为35.00%（105/300）。
使用口蹄疫3ABC抗体共检测阳性样品8份，阳性率为2.67%（8/300）。
采用IDEXX牛布氏杆菌抗体检测布氏杆菌抗体阳性样品2份，阳性率为0.67%（2/300）。
结合监测结果制定针对性防控措施，以提高疫病防控水平。
关键词：牛口蹄疫；布氏杆菌；病原血清学监测；防控措施云南地处我国西南边陲，气候条件独特，奶牛养殖区主要位于热带、亚热带及温带等不同气候带，受到生态环境影响，牛疫病发病风险较高。
除此之外，由于云南省跟多个东南亚的国家领土接壤，边境线非常长，存在较高的疫病引入风险。
其中口蹄疫又是非常常见的跨境动物类传染疾病，一旦发生以及流行就会引起非常严重的经济损失。
布氏杆菌病则是常见的人畜共患病之一，近年来发病率逐年提高。
因此加强对牛口蹄疫及布氏杆菌的监测十分必要。
本文收集云南省牛疫病控制实验室体系下综合实验组及区域推广站共200份样本，进行病原血清学监测，分析感染情况，在此基础上制定疫病防控对策。
1.材料及方法1.材料收集云南省牛疫病控制实验室体系下2个综合试验站和3个区域推广站各示范场共计300份样本，包括230份奶水牛血清样本及70份奶牛血清样本。
采用口蹄疫免疫抗体检测试剂盒及布氏杆菌病检测试剂盒，主要为口蹄疫液相阻断ELISA检测试剂盒、A型抗体液相ELISA检测试剂盒；亚洲Ⅰ型口蹄疫液相阻断ELISA检测试剂盒；O型口蹄疫抗体液相ELISA检测试剂盒；3ABC抗体检测试剂盒；牛羊布氏杆菌病抗体检测试剂盒采用IDEXX生产的检测试剂盒。
检测口蹄疫血清抗体的方法
检测口蹄疫血清抗体的方法（一）口蹄疫正向间接红细胞凝集试验（间接血凝试验）该试验是以口蹄疫O、A、C、Asia-1型病毒和猪水泡病病毒的细胞培养物（细胞毒）经PEG浓缩，蔗糖密度梯度超离后纯化的病毒抗原分别致敏戊二醛鞣酸处理的绵羊红细胞，而制成的血凝抗原，用于快速检测动物血清中的口蹄疫和猪水泡病特异抗体水平。
该法简易、快速、特异、直观、是当前测抗的实用方法。
1．试验材料V型96孔110。
医用血凝滴定板、玻璃板（与血凝板大小相同）、微量移液器（10~100微升）、塑料咀、微量振荡器、1毫升/5毫升刻度玻璃吸管、玻璃中试管（内径毫米，长度100毫米）、铝质试管架（40孔）、口蹄疫各型和猪水泡正向间接血凝诊断液、口蹄疫O、A、C、Asia-1型阳性血清、SVD阳性血清、阴性血清、稀释液。
2．试验方法根据试验目的可分为用于鉴别诊断；用于监测疫苗接种动物的抗体水平的检测方法。
（1）疫苗接种动物抗体水平监测方法接种何种疫苗就使用何种正向血凝诊断液。
①稀释待检血清在血凝板上1~8孔各加稀释液50微升，取待检血清50微升加入第1孔，混匀后从中取出50微升加入第2孔，混匀后从中取出50微升加入第3孔……直至第8孔混匀后从该孔取出50微升丢弃，保持每孔50微升的剂量。
此时1~8孔的血清稀释度依次为1：2、1：4、1：8、1：16；1：32、1：64、1：128、1：256。
②稀释阴性对照血清取中试管1支加稀释液毫升，再加阴性血清毫升，充分摇匀阴性血清的稀释度即为1：16。
③稀释阳性对照血清取中试管5支，第1管加稀释液毫升，第2~5管分别加稀释液毫升，取阳性血清毫升加入第1管混匀后从中取出毫升，加入第2管混匀后从中取出毫升，加入第3管……直至第5管，此时各管阳性血清的稀释度低次为1：32、1：64、1：128、1：256、1：512。
④滴加对照孔取1：16稀释的阴性血清50微升加入血凝板的第10孔；取1：500稀释的阳性血清50微升加入第11孔；取稀释液50微升加入第12孔。
实验操作指南
实验操作指南一、亚洲I型口蹄疫抗体检测液相阻断ELISA（LB-ELISA）试验液相阻断ELISA主要用于检测抗体。
应用于两个方面的目的：⑴检测FMD病毒感染，广泛用于国际贸易中；⑵监测免疫抗体，评价FMD疫苗免疫效力，也就是疫苗免疫动物的抗强毒攻击能力。
1、反应原理预先滴定好的固定量病毒抗原与被检血清首先在液相中反应，然后将抗原抗体复合物转移到包被了FMD型特异性抗体的ELISA板中，没有完全被血清抗体阻断的病毒抗原被ELISA板中的抗体捕获，亦与随后加入的豚鼠搞血清中的抗体结合，再通过兔抗豚鼠IgG酶结合物和底物溶液显色。
按试验孔呈现的颜色与抗原对照（未加血清）孔呈现颜色相比较判定结果。
抗体滴定以能阻断50%病毒抗原的血清稀释度表示。
2、主要试剂与耗材⑴主要试剂①捕获抗体：口蹄疫146S兔抗血清②检测抗体：口蹄疫病毒146S豚鼠抗血清③酶结合物：兔抗豚鼠IgG-辣根过氧化物酶结合物④病毒抗原及病毒对照抗原：用BEI灭活的病毒细胞培养物⑤标准阳性血清和阴性血清⑥底物溶液：邻苯二胺（OPD）/H2O2溶液（具体配制溶化后，再加2片OPD片剂，充分溶解，分装成5 ml或10 ml/瓶，避光-20度保存。
用前避光溶化，临用时每10 ml上述溶液加100ul配备的3%的双氧水）⑦终止液：1.25mol/LH2SO4⑧缓冲液包被缓冲液：0.05MNa2CO3/NaHCO3，PH9.6稀释液：0.05%（V/V）Tween-20加入0.01MPBS，PH7.4（PBST）豚鼠抗血清稀释液：5%脱脂奶粉-PBST洗涤液：0.01MPBST，PH7.4⑵主要仪器材料①ELISA板：96孔平底聚苯乙烯ELISA板。
②抗原抗体反应板：96孔U形夜工聚丙微量板。
③移液器：0.5-20ul，5-40 ul，50-200 ul，200-2000 ul可调节移液器各一把，8道或12道移液器一把，移液槽5-6个，各配套移液枪尖若干。
口蹄疫诊断技术规程
口蹄疫诊断技术规程（NY／SY150-2000 )1．范围本规程规定了口蹄疫正向间接血凝试验、屠宰品中口蹄疫病毒检测试验及口蹄疫病毒RT - PCR检测试验。
正向间接血凝试验适用于口蹄疫疫苗接种血清抗体水平监测、流行病学调查和进出口动物检疫；口蹄疫病毒检测试验和RT - PCR检测试验适用于猪的屠宰品中的口蹄疫病毒检测。
2．正向间接血凝试验2.1试剂2.1.1纯化灭活口蹄疫病毒致敏醛化蹂酸化绵羊红细胞，标准阳性、阴性血清，由中国农业科学院兰州兽医研究所生产。
2.1.2稀释液，配制方法见附录A。
2．2操作方法2.2.1待检血清的灭活将待检血清放人56℃水浴中灭活30分钟。
2.2.2待检血清的稀释用稀释液将待检血清稀释成1：4，1：8，1：16，1：32，1：64，1：128，1：256，1：512等8个稀释度。
2.2.3阴、阳性血清的稀释用稀释液将阴性对照血清稀释成1:16，将阳性对照血清稀释成1：51202.2.4加样在干净的V型96孔110°血凝板的第1～8孔加各稀释度待检血清50μ1，第10孔加1：16的阴性对照血清50μ1，第11孔加口蹄疫O型阳性对照血清（1:512) 50μ1；第12孔加稀释液50μ1（空白对照孔）。
第1～8孔和10～12孔加口蹄疫诊断液，每孔25μl。
如用液体诊断液，只需摇匀便可加样。
若用冻干诊断液，则需提前7～10天加人稀释液（每瓶5m1 )浸泡（在4～6℃下），方可使用。
2.2.5振荡混匀加样完毕后，立即将血凝板置于微量振荡器上，振荡1分钟，取下放在白纸上，观察血球应均匀悬浮，不得沉淀，否则应继续振荡。
2.2.6静置振荡混匀后，取下血凝板并盖上大小适中的玻璃板，防止水分蒸发，室温下静置1.5～2小时，或次日判定结果。
2.3结果判定2.3.1先观察对照孔，第10孔（阴性血清对照孔）、第12孔（稀释液对照孔）应无凝集现象，呈小圆点状（一）。
％以上的血球产生凝集，即（＋＋）50孔（阳性血清对照孔）应有11第2.3.2．（阳性反应）。
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检测口蹄疫血清抗体的方法（一）口蹄疫正向间接红细胞凝集试验（间接血凝试验）该试验是以口蹄疫O、A、C、Asia-1型病毒和猪水泡病病毒的细胞培养物（细胞毒）经PEG浓缩，蔗糖密度梯度超离后纯化的病毒抗原分别致敏戊二醛鞣酸处理的绵羊红细胞，而制成的血凝抗原，用于快速检测动物血清中的口蹄疫和猪水泡病特异抗体水平。
该法简易、快速、特异、直观、是当前测抗的实用方法。
1．试验材料V型96孔110。
医用血凝滴定板、玻璃板（与血凝板大小相同）、微量移液器（10~100微升）、塑料咀、微量振荡器、1毫升/5毫升刻度玻璃吸管、玻璃中试管（内径毫米，长度100毫米）、铝质试管架（40孔）、口蹄疫各型和猪水泡正向间接血凝诊断液、口蹄疫O、A、C、Asia-1型阳性血清、SVD阳性血清、阴性血清、稀释液。
2．试验方法根据试验目的可分为用于鉴别诊断；用于监测疫苗接种动物的抗体水平的检测方法。
（1）疫苗接种动物抗体水平监测方法接种何种疫苗就使用何种正向血凝诊断液。
①稀释待检血清在血凝板上1~8孔各加稀释液50微升，取待检血清50微升加入第1孔，混匀后从中取出50微升加入第2孔，混匀后从中取出50微升加入第3孔……直至第8孔混匀后从该孔取出50微升丢弃，保持每孔50微升的剂量。
此时1~8孔的血清稀释度依次为1：2、1：4、1：8、1：16；1：32、1：64、1：128、1：256。
②稀释阴性对照血清取中试管1支加稀释液毫升，再加阴性血清毫升，充分摇匀阴性血清的稀释度即为1：16。
③稀释阳性对照血清取中试管5支，第1管加稀释液毫升，第2~5管分别加稀释液毫升，取阳性血清毫升加入第1管混匀后从中取出毫升，加入第2管混匀后从中取出毫升，加入第3管……直至第5管，此时各管阳性血清的稀释度低次为1：32、1：64、1：128、1：256、1：512。
④滴加对照孔取1：16稀释的阴性血清50微升加入血凝板的第10孔；取1：500稀释的阳性血清50微升加入第11孔；取稀释液50微升加入第12孔。
⑤滴加正向血凝诊断液取正向血凝诊断液充分摇匀（瓶底应无血球沉淀），每孔各加25微升后立即置微量振荡器上振荡1分钟，取下血凝板放在白纸上观察每孔中的血球是否均匀（孔底应无血球沉淀）。
如仍有部分孔底出现血球沉积，应继续振荡直至完全混匀为止。
⑥静置将血凝板放在室温下（15~30℃）静置2h后判定检测结果，若结果不清晰或来不及判定，也可放置第2天判定。
⑦判定标准先观察10~12孔（对照孔），第10孔为阴性血清对照，应无红细胞凝集现象，红细胞全部沉入孔底，形成小园点或仅有25%红细胞有凝集（“+”的凝集）；第11孔为阳性血清对照，应出现“++”以上的凝集（50%以上的红细胞发生凝集），证明该批正向诊断液的效价达到1：512为合格；第12孔为稀释液对照，红细胞也应全部沉入孔底或只有“+”的凝集。
在上述对照合格的前提下，观察待检血清各孔，以出现“++”凝集的待检血清最大稀释度为其抗体效价。
例如检测接种口蹄疫O型灭活疫苗的猪群免疫水平时，某份血清1-7孔出现“++”或“++”以上（+++~#）凝集而第8孔仅有“+”凝集，判定该份血清中的O型抗体效价为1：128。
经实验室测定，口蹄疫O型灭活疫苗的免疫猪群血清中O型抗体效价达到1：128及其以上时，猪群可耐受20个O型强毒发病量的人工感染。
（2）用于鉴别诊断的正向间接血凝试验①稀释待检血清取中试管8支列于试管架上，第1管加稀释液毫升，第2~8管各加稀释液毫升，取待检血清毫升加入第1管混匀后从中取出毫升加入第2管……直至第8管，待检血清的稀释度依次为1:4、1：8、1：16、1：32、1：64、1：128、1：256、1：512。
②稀释阴性对照血清取中试管1支加稀释液毫升，再加阴性血清毫升,即成1：16。
③稀释阳性对照血清取中试管5支，列于管架上，每管加稀释液毫升阳血，依次用记号笔标明O、A、C、Asia型和SVD阳血，分别取这5种阳性血清10微升加入相应的试管中（注意每加一种阳性血清，必须单独使用一根吸管），盖上橡胶塞充分摇匀，阳性血清的稀释度即成1：500。
④滴加待检血清和对照血清取第8管待检血清加入血凝板上的1~5排第8孔，取7管血清加入1~5排的第7孔，取第6管血清加入1~5排的第6孔……直至第1孔，每孔50微升。
取阴性血清（1：16稀释度）加入1~5排的第10孔，每孔50微升。
取1：500稀释的阳性血清加入1~5排的第11孔，每孔50微升。
取稀释液加入1~5排的第12孔，每孔50微升。
⑤滴加正向间接血凝抗原（正向诊断液）第1排1~8孔和10~12孔加O型血凝抗原，每孔25微升。
第二排1~8孔和10~12孔加A型血凝抗原，每孔25微升。
第三排1~8孔和10~12孔加C型血凝抗原，每孔25微升。
第四排1~8孔和10~12孔加Asia-1型血凝抗原，每孔25微升。
第五排1~8孔和10~12孔加SVD 血凝抗原，每孔25微升。
加毕抗原后立即将血凝板置于微量振荡器上中速振荡1分钟，使抗体和抗原充分混匀，各孔不应有红细胞沉淀。
⑥静置从振荡器上取下血凝板，放在试验台上，盖上玻板，室温（15~30℃）静置2小时，判定结果，若结果不清晰或来不及判定，也可放置第2天判定。
⑦判定标准先仔细观察每排的10~12孔，10孔为阴性血清对照，12孔为稀释液对照，这2孔均应无凝集现象，或仅出现“+”的凝集。
11孔为口蹄疫4个型和猪水泡病1：500稀释的阳性血清对照，应出现“++”~ “+++”的凝集，证明所使用的5种血凝抗原试剂合格。
在对照孔符合上述标准的前提下，观察1~5排的第1~8孔，某排1~8孔，出现“#”~“++”的凝集，其余4排仅在1~3孔出现“++”~“+”的凝集，便可判定该份待检血清为阳性，其型别与所加的血凝抗原的型别相同。
例出第1排的1~3孔出现“#”凝集，第4-5孔出现“+++”凝集，第6孔出现“++”凝集，第7孔出现“+”凝集，第8孔无凝集（“—”），判定该份待检血清为口蹄疫O型，表明血清中存在O型抗体其效价为1：128。
如果该份血清采自口蹄疫O型疫苗免疫过的动物，就不能判定究竟是自然感染产生的抗体，还是接种过疫苗产生的抗体。
因为本法尚不能区分感染性抗体和免疫性抗体。
为此，欲使本法用于鉴别诊断，采血时必须要弄清该批动物是否接种过口蹄疫或猪水泡病疫苗。
⑧注意事项A．严重溶血和污染的血清样品不宜检测，以免产生非特异反应。
B．勿用90o和130o血凝板，以免误判。
C．有时会出现“前带”现象，即第1~2孔红细胞沉淀而在第3~4孔又出现凝集，这是由于抗原抗体比例失调所致，不影响结果的判定。
D．血清必须是来自康复动物，至少是发病后10天的血清，否则不易检出。
注：稀释液配方如下：Na2HPO4·12H2O (磷酸氢二钠) 35.8克Na2H2PO4·2H2O （磷酸二氢钠) 1.56克NaCl （氯化钠）8.5克NaN3（迭氮钠） 1.0克加双蒸水或去离子水至1 000毫升，15磅高压灭菌20分钟，冷却后取出980毫升加正常兔血清20毫升即成，置4℃冰箱贮存备用。
该配方适用于正向间接血凝试验和反向被动血凝试验，也适用于猪瘟间接血凝试验。
正向间接血凝抗原及其配套试剂由中国农科院兰州兽医研究所口蹄疫综防研究组提供。
（二）口蹄疫中和试验病毒或毒素与相应抗体结合后，能使其失去对易感动物的致病力或对细胞的感染力，称为中和试验，中和试验不仅可在易感的实验动物体内进行，亦可在细胞培养或鸡胚中进行。
1．细胞中和试验一般采用固定病毒稀释血清法，该法须在无菌条件下操作，亦须细胞适应毒。
（1）取两列无菌试管，第一列为正常血清对照组，第二列为待检血清中和组。
先在二列试管中的第1管加含有%水解乳蛋白的汉克氏液（乳白液）3毫升；第2~6管各加乳白液2毫升。
（2）取正常血清1毫升加入第一列的第1管，取待检血清1毫升加入第二列的第1管，混匀后，以同法对倍稀释，1~6管的正常和待检血清稀释度依次为1：4、1：8、1：16、1：32、1：64、1：128。
（3）二列试管中的1~6管分别加入200TCID50细胞适应毒2毫升充分摇匀，置37℃水浴中保温60分钟。
（4）取各稀释度的血清分别接种3瓶长满单层的细胞，倾去旧的细胞营养液，每瓶接种1毫升，置37℃恒温箱内静置培养3天，每日镜检一次并详细记录细胞病变情况。
（5）细胞培养3天后判定结果，正常血清对照组的细胞应全部出现病变；中和组的血清1：8以上无细胞病变，判为阳性。
1：8的血清出现细胞病变则判为阴性，该法特异性强，结果可靠，但要求无菌设备和培养细胞的条件，操作繁琐，基层难以应用。
2．乳鼠中和试验5~7日龄小白鼠对人工接种口蹄疫病毒易感染，产生特征性症状和规律性死亡。
因此利用这一特性进行乳鼠中和试验。
操作步骤如下：（1）将待检血清用生理盐水或的0.1M PBS稀释成1：4、1：8、1：16、1：32、1：64，分别与等量的10-3口蹄疫乳鼠适应毒混合，37℃水浴保温60分钟。
（2）每次试验应设阴性血清（1：8）与10-3病毒的混合液作为病毒对照；已知阳性血清与10-3病毒的混合液作为阳性对照，处理方法同（1）步骤。
（3）每一稀释度血清中和组分别于颈背皮下接种5~7日龄乳鼠4只，对照组接种2只，毫升/只，由母鼠哺乳，观察5天判定结果。
（4）判定标准先检查对照鼠，阴性对照鼠应于48小时内病死；阳性对照鼠应健活。
待检血清任何一组的乳鼠健活或仅死二只，判定该份血清为阳性。
以能保护50%接种乳鼠免遭病毒感染的血清最大稀释度为乳鼠中和效价。
该法特异性强，结果可靠，简单易行，基层可采用。
但存在需时较长，乳鼠易被母鼠所吃或咬死，敏感性低等缺点。
（三）口蹄疫乳鼠保护试验待检血清稀释成1：5，接种乳鼠后12小时或24小时，用10-3病毒攻毒，同时设阴性血清和已知阳性血清（均为1：5稀释）作为对照。
观察5天后判定结果。
在阴性和阳性血清对照成立的前提下，待检血清组的乳鼠健活，判定该份血清为阳性，反之，则判为阴性。
该法多用于定性检测，一般不作为定量检测手段。
（四）口蹄疫琼脂扩散试验抗原抗体在琼脂凝胶中，各以其固有的扩散系数扩散，当二者相遇时，在比例适当处发生结合而形成肉眼可见的沉淀带。
操作步骤如下：1．称取琼脂糖或琼胶素1 克,迭氮钠1克，氯化钠0.85克加的0.01M PBS 100毫升。
置沸水中煮熔化或15磅高压10分钟。
趁热倾入平皿中，厚度3~4毫米。
2. 琼脂冷却凝固后，用打孔器打成中央一孔周围6孔的梅花形孔；中央孔径4~5毫米，周围孔径3毫米与中央孔的孔距3~4毫米。
3.中央孔加已知型别的浓缩抗原，四周孔加不同稀释度的待检血清和阴性、阳性对照血清（1：2稀释），静置扩散1小时。