高三生物二轮专题复习 重点题型6 如何选择限制性核酸内切酶
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(3)根据 BamHⅠ和 BclⅠ的酶切位点，BamHⅠ酶切的 DNA 末端与 BclⅠ酶切的 DNA 末
端连接，连接部位的
6
个碱基对序列为T A
GATC CTAG
C G GC
GATC CTAG
TA，与两种酶的酶切位点均
不同。(4)根据 BamHⅠ、BclⅠ和 Sau3AⅠ的酶切位点，Sau3AⅠ在质粒上有三个酶切位
6
(3)若BamHⅠ酶切的DNA末端与BclⅠ酶切的DNA末端连接，连接部位的6个碱基对序 列为________，对于该部位，这两种酶________(填“都能”“都不能”或“只有一种 能”)切开。 (4)若用Sau3AⅠ切图1质粒最多可能获得________种大小不同的DNA片段。
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解析 (1)选择的限制酶应在目的基因两端存在识别位点，但若选BamHⅠ和 HindⅢ切割，则会破坏质粒中的两个抗性基因 ，不利于后期的筛选，且 BamHⅠ可能使质粒中启动子丢失，因此只能选BclⅠ和HindⅢ。酶切后的载 体和目的基因片段，通过DNA连接酶作用后获得重组质粒。为了扩增重组质 粒，需将其转入氯化钙处理的大肠杆菌。(2)为了筛选出转入了重组质粒的大 肠杆菌，根据质粒上的抗性基因，应在筛选平板培养基中添加四环素。PCR 技术要求两种引物分别和目的基因的两条单链结合，沿相反的方向合成子链。
重点题型6 如何选择限制性核酸内切酶
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【规律方法】
2
1.根据目的基因两端的限制性核酸内切酶切点确定限制性核酸内切酶的种类 (1)应选择切点位于目的基因两端的限制性核酸内切酶，如图甲可选择PstⅠ。 (2)不能选择切点位于目的基因内部的限制性核酸内切酶，如图甲不能选择SmaⅠ。 (3)为避免目的基因和质粒的自身环化和随意连接，也可使用不同的限制性核酸内切 酶切割目的基因和质粒，如图甲也可选择用PstⅠ和EcoRⅠ两种限制性核酸内切酶 (但要确保质粒上也有这两种酶的切点)。
3
2.根据质粒的特点确定限制性核酸内切酶的种类 (1)所选限制性核酸内切酶要与切割目的基因的限制性核酸内切酶相一致，以确保具 有相同的粘性末端。 (2)质粒作为载体必须具备标记基因(如四环素抗性基因)等，所以所选择的限制性核 酸内切酶尽量不要破坏这些结构，如图乙中限制性核酸内切酶SmaⅠ会破坏标记基 因；如果所选酶的切点不是一个，则切割重组后可能丢失某些片段，若丢失的片段 含复制起点区，则切割重组后的片段进入受体细胞后不能自主复制。
点，完全酶切可得到三种片段记为 A、B、C，若部分位点被切开，可得到 AB、AC、BC、
ABC 四种片段，所以用 Sau3AⅠ切图 1 质粒最多可能获得 7 种大小不同的 DNA 片段。
答 案 (1)BclⅠ 和 HindⅢ DNA 连 接
T (3)A
GATC CTAG
C G GC
GATC CTAG
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(1)根据图1，在获得目的基因时，应使用限制酶________(PvuⅠ /EcoRⅠ)进行切割。 可 以 选 择 图 2 中 的 质 粒 ________(A/B) 作 为 目 的 基 因 的 载 体 ， 理 由 是 _____________________________________________________________________。 (2)图3表示基因工程中将重组DNA分子导入受体细胞的过程，该步骤采用的技术方法 是________，通常选择________作为受体细胞。 (3)获得含目的基因的细胞后，该细胞需要进行________。然后再进行移植，通常移植 最适宜的时期是发育到________(A.2细胞胚胎 B.4细胞胚胎 C.早期囊胚 D.原肠 胚)。再经分娩产仔就可以获得“巨型小鼠”。
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【技能提升】 1.下表是几种限制酶识别序列及其切割位点，图1、图2中标注了相关限制酶的酶切位
点，其中切割位点相同的酶不重复标注。请回答下列问题：
限制酶
BamHⅠ
BclⅠ
Sau3AⅠ
HindⅢ
识别序列及 切割位点
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(1)用图中质粒和目的基因构建重组质粒，应选用________两种限制酶切割，酶切后的 载体和目的基因片段，通过________酶作用后获得重组质粒。为了扩增重组质粒，需 将其转入用________处理的大肠杆菌。 (2)为了筛选出转入了重组质粒的大肠杆菌，应在筛选平板培养基中添加________，平 板上长出的菌落，常用PCR鉴定，所用的引物组成为图2中________。
11
答案 (1)Pvu Ⅰ A 选择质粒A，其复制原点则不会被限制酶切割，复制原点序列 保持完整(在用切割目的基因的限制酶切割质粒B时，其复制原点会被限制酶切割，从 而影响重组质粒的自主复制) (2)显微注射法 受精卵 (3)胚胎体外培养 C
12
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A T
都不能Байду номын сангаас
(4)7
氯化钙
(2) 四 环 素
引物甲和引物丙
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2.科学家用转基因方法培育“巨型小鼠”。图1为含大鼠生长激素基因的DNA及限制酶 切割位点示意图；图2为含有相应标记基因和限制酶切割位点的质粒示意图，其中 nptⅡ为卡那霉素抗性基因，Tc为四环素抗性基因，lacZ为蓝色显色基因，复制原点 是质粒上必需的一段复制起始的序列，与重组质粒的自主复制有关。图3是转基因过 程中的一个步骤。
(3)根据 BamHⅠ和 BclⅠ的酶切位点，BamHⅠ酶切的 DNA 末端与 BclⅠ酶切的 DNA 末
端连接，连接部位的
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个碱基对序列为T A
GATC CTAG
C G GC
GATC CTAG
TA，与两种酶的酶切位点均
不同。(4)根据 BamHⅠ、BclⅠ和 Sau3AⅠ的酶切位点，Sau3AⅠ在质粒上有三个酶切位
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(3)若BamHⅠ酶切的DNA末端与BclⅠ酶切的DNA末端连接，连接部位的6个碱基对序 列为________，对于该部位，这两种酶________(填“都能”“都不能”或“只有一种 能”)切开。 (4)若用Sau3AⅠ切图1质粒最多可能获得________种大小不同的DNA片段。
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解析 (1)选择的限制酶应在目的基因两端存在识别位点，但若选BamHⅠ和 HindⅢ切割，则会破坏质粒中的两个抗性基因 ，不利于后期的筛选，且 BamHⅠ可能使质粒中启动子丢失，因此只能选BclⅠ和HindⅢ。酶切后的载 体和目的基因片段，通过DNA连接酶作用后获得重组质粒。为了扩增重组质 粒，需将其转入氯化钙处理的大肠杆菌。(2)为了筛选出转入了重组质粒的大 肠杆菌，根据质粒上的抗性基因，应在筛选平板培养基中添加四环素。PCR 技术要求两种引物分别和目的基因的两条单链结合，沿相反的方向合成子链。
重点题型6 如何选择限制性核酸内切酶
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【规律方法】
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1.根据目的基因两端的限制性核酸内切酶切点确定限制性核酸内切酶的种类 (1)应选择切点位于目的基因两端的限制性核酸内切酶，如图甲可选择PstⅠ。 (2)不能选择切点位于目的基因内部的限制性核酸内切酶，如图甲不能选择SmaⅠ。 (3)为避免目的基因和质粒的自身环化和随意连接，也可使用不同的限制性核酸内切 酶切割目的基因和质粒，如图甲也可选择用PstⅠ和EcoRⅠ两种限制性核酸内切酶 (但要确保质粒上也有这两种酶的切点)。
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2.根据质粒的特点确定限制性核酸内切酶的种类 (1)所选限制性核酸内切酶要与切割目的基因的限制性核酸内切酶相一致，以确保具 有相同的粘性末端。 (2)质粒作为载体必须具备标记基因(如四环素抗性基因)等，所以所选择的限制性核 酸内切酶尽量不要破坏这些结构，如图乙中限制性核酸内切酶SmaⅠ会破坏标记基 因；如果所选酶的切点不是一个，则切割重组后可能丢失某些片段，若丢失的片段 含复制起点区，则切割重组后的片段进入受体细胞后不能自主复制。
点，完全酶切可得到三种片段记为 A、B、C，若部分位点被切开，可得到 AB、AC、BC、
ABC 四种片段，所以用 Sau3AⅠ切图 1 质粒最多可能获得 7 种大小不同的 DNA 片段。
答 案 (1)BclⅠ 和 HindⅢ DNA 连 接
T (3)A
GATC CTAG
C G GC
GATC CTAG
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(1)根据图1，在获得目的基因时，应使用限制酶________(PvuⅠ /EcoRⅠ)进行切割。 可 以 选 择 图 2 中 的 质 粒 ________(A/B) 作 为 目 的 基 因 的 载 体 ， 理 由 是 _____________________________________________________________________。 (2)图3表示基因工程中将重组DNA分子导入受体细胞的过程，该步骤采用的技术方法 是________，通常选择________作为受体细胞。 (3)获得含目的基因的细胞后，该细胞需要进行________。然后再进行移植，通常移植 最适宜的时期是发育到________(A.2细胞胚胎 B.4细胞胚胎 C.早期囊胚 D.原肠 胚)。再经分娩产仔就可以获得“巨型小鼠”。
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【技能提升】 1.下表是几种限制酶识别序列及其切割位点，图1、图2中标注了相关限制酶的酶切位
点，其中切割位点相同的酶不重复标注。请回答下列问题：
限制酶
BamHⅠ
BclⅠ
Sau3AⅠ
HindⅢ
识别序列及 切割位点
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(1)用图中质粒和目的基因构建重组质粒，应选用________两种限制酶切割，酶切后的 载体和目的基因片段，通过________酶作用后获得重组质粒。为了扩增重组质粒，需 将其转入用________处理的大肠杆菌。 (2)为了筛选出转入了重组质粒的大肠杆菌，应在筛选平板培养基中添加________，平 板上长出的菌落，常用PCR鉴定，所用的引物组成为图2中________。
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答案 (1)Pvu Ⅰ A 选择质粒A，其复制原点则不会被限制酶切割，复制原点序列 保持完整(在用切割目的基因的限制酶切割质粒B时，其复制原点会被限制酶切割，从 而影响重组质粒的自主复制) (2)显微注射法 受精卵 (3)胚胎体外培养 C
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A T
都不能Байду номын сангаас
(4)7
氯化钙
(2) 四 环 素
引物甲和引物丙
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2.科学家用转基因方法培育“巨型小鼠”。图1为含大鼠生长激素基因的DNA及限制酶 切割位点示意图；图2为含有相应标记基因和限制酶切割位点的质粒示意图，其中 nptⅡ为卡那霉素抗性基因，Tc为四环素抗性基因，lacZ为蓝色显色基因，复制原点 是质粒上必需的一段复制起始的序列，与重组质粒的自主复制有关。图3是转基因过 程中的一个步骤。