药物的体外抗菌试验 第十九章
合集下载
抗菌药物的体外抑菌及体内抗菌实验
《生物工程综合实验平台》——《抗菌药物的体外抑菌及体内抗菌实验》专业班级：学号：姓名：小组成员：实验日期：5月27日-5月30日微生物综合实验抗菌药物的体外抑菌及体内抗菌实验班级16级生物技术1、2班姓名学号座位号实验日程安排抗菌药物的体外抑菌及体内抗菌实验一、实验原理抗菌药物一般是指具有抑菌或杀菌活性的药物，包括各种抗生素、磺胺类、咪唑类、硝基咪唑类、喹诺酮类等化学合成药物。
由细菌、放线菌、真菌等微生物经培养而得到的某些产物，或用化学半合成法制造的相同或类似的物质，也可化学全合成。
抗菌药物在一定浓度下对病原体有抑制和杀灭作用。
药物的体外抑菌实验，是指在体外测定药物抑制或杀灭细菌能力的实验。
它是常用抗菌实验的方法，其中最常用的方法有系列稀释法和琼脂扩散法。
稀释法有液体培养基连续稀释法和固体稀释法（斜面法）两种，这两种方法都可以用来测定药物的最小抑菌浓度（MIC）：是指该药物能抑制细菌生长的最低浓度，通常用ug/ml或U/ml表示。
其结果判断方法为凡无肉眼可见细菌生长的药物最低浓度即为该菌的最小抑菌浓度（MIC）。
琼脂扩散法是将抗菌药物加至接种试验菌的平板表面，抗菌药物在琼脂胶内向四周自由扩散，其浓度随扩散距离增大而降低。
在药物一定的扩散距离内，由于药物的抗菌效应，试验菌不能生长，此无菌生长的范围称为抑菌圈。
抑菌圈的大小与药物的抑菌效应成正比。
琼脂扩散法常有纸片法、管碟法、打洞法和挖沟法。
一般药敏实验常采用纸片法，我们可以根据抑菌圈的大小，来判断菌种对药物的敏感性，是敏感，中度敏感还是耐药。
世界卫生组织规定了抗菌药物的敏感性评定标准，在标准实验条件下根据抑菌圈的大小来判断，如：药物的体内抗菌实验又称为动物实验治疗试验或保护力试验。
当抗菌药物进入机体后，其效力的发挥要受体内各种因素的影响。
如血液及组织内的蛋白质或磷脂、浓汁内的核酸均与药物结合，降低药物的活性；坏死组织内的酸性环境也能影响药物的活性。
药物制剂的微生物学检验
2. 活菌计数法
将定量的试验菌加入到一定浓度的定量药物中， 作用一定时间后，取样进行活菌数计数，从存活的微 生物数量计算出药物对试验菌的致死率，从而判断药 物的杀菌能力。
活菌计数一般是将定量的药物与试验菌作用后混 合液稀释后，混入琼脂培养基做成平板，培养后数平 板上形成的菌落数，由于一个菌落是由一个细菌繁殖 而来的，所以可以用菌数乘以稀释倍数，计算出混合 液中存活的细菌数。或者也可以用微孔滤膜过滤药物 与试验菌的混合液，洗净药液，将滤膜放在平板上培 养后数菌落数。
▪ 聚山梨酸培养基：用于油剂药品的无菌检查 ➢ 照需氧菌、厌氧菌培养基及真菌培养基处方及制
法，每 1000ml培养基中各加10ml聚山梨酸-80， 摇匀后，分装，灭菌。
至于干燥纸片的制备方法：选用吸水力强而且质 地均匀的滤纸，用打洞机制成6mm直径的圆纸片， 120℃干燥灭菌2小时。然后把配制好的各种适宜 浓度的抗生素溶液，每100张纸片加入0.5ml药液， 使它均匀浸润，放在无菌平皿中，37℃，使它干 燥，分装小瓶中，封口，4℃保存。如果是β－内 酰胺类抗生素还要放在-20℃保存。这就制成了干 燥的含药液的纸片。
真菌培养基（改良马丁培养基）
胨
酵母浸出粉
葡萄糖
磷酸氢二钾(K2HPO4) 硫酸镁(MgSO4·7H2O) 蒸馏水
5g 2g 20g 1g
0.5g 1000ml
选择性培养基
▪ 对氨基苯甲酸(PABA)培养基：用于磺胺类药物的 无菌检查
➢ 照需氧菌、厌氧菌培养基及真菌培养基处方及制 法，各加对氨基苯甲酸0.125g，溶解后，摇匀，分 装，灭菌。
除此之外还有管碟法、直接滴加法和挖沟法：适用于 测试一种药物对几种细菌的抗菌作用。方法是先制备普通 琼脂平板，并在平板上挖直沟，在沟内滴加药液，在沟侧 接种细菌。经过培养以后观察家细菌生长的情况。我们可 以根据沟和细菌间的抑菌距离的长短，来判断该药物对这 些细菌的抗菌能力。
体外抗菌实验-18
是以石炭酸为标准，在规定的试验条件下， 是以石炭酸为标准，在规定的试验条件下，作用 一定时间， 一定时间，将待测的化学消毒剂与石炭酸对伤寒沙门 菌或金黄色葡萄球菌的杀菌效力相比较， 菌或金黄色葡萄球菌的杀菌效力相比较， 所得杀菌 效力的比值。 效力的比值。
棋盘格法
是由于在试验时， 是由于在试验时，含两种不同浓度 药物的试管排列呈棋盘状而得名， 药物的试管排列呈棋盘状而得名， 用以 评价两种药物同时用不同浓度进行联合 试验时的抗菌活性。 试验时的抗菌活性。
琼脂扩散法agar diffusion test 琼脂扩散法
是利用药物可以在琼脂培养基中扩散， 是利用药物可以在琼脂培养基中扩散，在药 物有效浓度的范围内形成抑菌圈或抑菌距离， 物有效浓度的范围内形成抑菌圈或抑菌距离，以 抑菌圈直径或抑菌距离的大小来评价药物抗菌作 用强弱。 用强弱。 inhibition zones 1、滤纸片法 、 适用于新药的初筛试验。 适用于新药的初筛试验。 2．打孔法 ． 适于药物血浓度的监测。 适于药物血浓度的监测。 3．挖沟法 ． 适用于在一个平板上试验一种药物对几种试验 菌的抗菌作用。 菌的抗菌作用。
• 方法： 方法：
取一定量的供试品药物以无菌生理盐水按比 例进行系列稀释， 例进行系列稀释，加入定量的稀释液于无菌平皿 再加入一定量的已熔化的、温度在55 中，再加入一定量的已熔化的、温度在 ℃左 右的琼脂培养基混匀，凝固后于37 培养24— 右的琼脂培养基混匀，凝固后于 ℃培养 48h,计数平板内菌落数。一般取菌落数在 计数平板内菌落数。 计数平板内菌落数 一般取菌落数在30— 300之间的平板进行计数，然后乘以稀释倍数即 之间的平板进行计数 之间的平板进行计数， 可得每毫克或每毫升供试药物中的活菌数。 可得每毫克或每毫升供试药物中的活菌数。
棋盘格法
是由于在试验时， 是由于在试验时，含两种不同浓度 药物的试管排列呈棋盘状而得名， 药物的试管排列呈棋盘状而得名， 用以 评价两种药物同时用不同浓度进行联合 试验时的抗菌活性。 试验时的抗菌活性。
琼脂扩散法agar diffusion test 琼脂扩散法
是利用药物可以在琼脂培养基中扩散， 是利用药物可以在琼脂培养基中扩散，在药 物有效浓度的范围内形成抑菌圈或抑菌距离， 物有效浓度的范围内形成抑菌圈或抑菌距离，以 抑菌圈直径或抑菌距离的大小来评价药物抗菌作 用强弱。 用强弱。 inhibition zones 1、滤纸片法 、 适用于新药的初筛试验。 适用于新药的初筛试验。 2．打孔法 ． 适于药物血浓度的监测。 适于药物血浓度的监测。 3．挖沟法 ． 适用于在一个平板上试验一种药物对几种试验 菌的抗菌作用。 菌的抗菌作用。
• 方法： 方法：
取一定量的供试品药物以无菌生理盐水按比 例进行系列稀释， 例进行系列稀释，加入定量的稀释液于无菌平皿 再加入一定量的已熔化的、温度在55 中，再加入一定量的已熔化的、温度在 ℃左 右的琼脂培养基混匀，凝固后于37 培养24— 右的琼脂培养基混匀，凝固后于 ℃培养 48h,计数平板内菌落数。一般取菌落数在 计数平板内菌落数。 计数平板内菌落数 一般取菌落数在30— 300之间的平板进行计数，然后乘以稀释倍数即 之间的平板进行计数 之间的平板进行计数， 可得每毫克或每毫升供试药物中的活菌数。 可得每毫克或每毫升供试药物中的活菌数。
第十九章药物的体外抗菌试验
抑菌圈的大小反映待测菌对该药物的敏感程度并与 该待测菌的最低抑菌浓度（MIC）呈负相关，即抑菌圈 越大，最低抑菌浓度就越小。
最低抑菌浓度（MIC）：指抗菌药物能够抑制细菌生长 所需要的最低浓度，单位是ug/ml或u/ml。
如庆大霉素对铜绿假单胞菌的MIC为1.56ug/ml，青 霉素G的MIC>128ug/ml，由此可判定庆大霉素对铜绿 假单胞菌的抑菌效力大于青霉素。
5、影响结果的因素
（1）培养基：除在M－H培养基上无法生长的细菌外，一 般都固定使用M－H培养基。
（2）抗菌药物：原则上采用标准粉剂，不用口服药物，配 好的原液应在有效期内使用。
（3）结果观察：应在12－18小时之间。培养时间过长，轻 度抑制的细菌可重新生长；或抗菌活性降低，甚至消失， 从而使MIC值增高。
（3）接种菌液的准备：从纯培养的平板上挑取形态相同 的4－5个菌落，接种于 3－5mlM－H液体培养基内， 35℃培养4－6小时，营养要求高的则培养过夜，然后校 正菌液浓度至0. 5麦氏比浊标准，再用M－H液体培养基 作1：200稀释，并在15分钟内接种。
3、试验步骤
（1）排列10－15支试管，除第1支外，各管加入M－H液 体培养基1ml。
（三）实验步骤
（1）菌液接种：用灭菌过的棉拭蘸取已制备的菌液涂抹 在M－H平板培养基的表面，均匀涂抹3次，每涂一次，平 板应转动60度，最后将棉拭绕平板内缘涂沫一圈，盖上平 皿盖，放置室温干燥数分钟。
（2）药物纸片的贴放：以无菌镊子取各种抗菌药物纸 片，贴放于已接种过试验菌的平板培养基表面，纸片贴后 不能再移动，因为有些药物可立即扩散。各纸片中心间距 不小于24mm，距平板边缘不小于15mm。直径为90mm的 平板可贴放6张纸片。贴后15分钟内倒置35℃培养箱16－ 18小时后阅读结果。
thweek药学实验四药物的体外抗菌试验
。
结果观察与记录
观察抑菌圈
通过观察抑菌圈的大小，初步判断药物的抗菌 效果。
数据记录
详细记录实验过程中的数据，如菌种名称、药 物名称、稀释比例、抑菌圈大小等。
结果分析
根据记录的数据，进行结果分析，计算药物的抑菌率或最小抑菌浓度等指标。
04
数据分析与结论
数据整理与处理
数据收集
收集实验过程中获得的药物抗菌数据，包括不同 药物浓度下的抑菌圈直径、细菌生长曲线等。
展望未来研究方向
根据实验结果和数据分析，展知
实验操作注意事项
实验前应仔细阅读相关文 献，了解实验原理、操作 步骤及注意事项。
在实验过程中，应保持实 验室整洁，避免交叉污染。
确保实验操作符合实验室 安全规定，遵循正确的操 作流程。
实验结束后，应按照实验 室规定正确处理废弃物。
纸片扩散法
将含有不同浓度抗菌药物的纸片贴在接种了细菌的琼脂平板上，观察 抑菌圈的大小，判断药物的抗菌效果。
时间-杀菌曲线法
记录抗菌药物在不同时间对细菌数量的影响，了解药物的杀菌速率和 杀菌效果。
了解抗菌药物的作用机制
大环内酯类
主要抑制细菌蛋白质的合成。
氨基糖苷类
与细菌核糖体结合，抑制蛋白 质合成。
thweek药学实验四药物的 体外抗菌试验
目录
• 实验目的 • 实验原理 • 实验步骤 • 数据分析与结论 • 实验注意事项与安全须知
01
实验目的
理解药物体外抗菌试验的原理
药物体外抗菌试验是指在体外条件下，通过实验室方法测试抗菌药物对病原微生 物的抑制或杀灭作用。其原理基于药物对微生物细胞膜、细胞壁、核酸或蛋白质 等生物大分子的影响，从而干扰或破坏微生物的正常生长和繁殖。
结果观察与记录
观察抑菌圈
通过观察抑菌圈的大小，初步判断药物的抗菌 效果。
数据记录
详细记录实验过程中的数据，如菌种名称、药 物名称、稀释比例、抑菌圈大小等。
结果分析
根据记录的数据，进行结果分析，计算药物的抑菌率或最小抑菌浓度等指标。
04
数据分析与结论
数据整理与处理
数据收集
收集实验过程中获得的药物抗菌数据，包括不同 药物浓度下的抑菌圈直径、细菌生长曲线等。
展望未来研究方向
根据实验结果和数据分析，展知
实验操作注意事项
实验前应仔细阅读相关文 献，了解实验原理、操作 步骤及注意事项。
在实验过程中，应保持实 验室整洁，避免交叉污染。
确保实验操作符合实验室 安全规定，遵循正确的操 作流程。
实验结束后，应按照实验 室规定正确处理废弃物。
纸片扩散法
将含有不同浓度抗菌药物的纸片贴在接种了细菌的琼脂平板上，观察 抑菌圈的大小，判断药物的抗菌效果。
时间-杀菌曲线法
记录抗菌药物在不同时间对细菌数量的影响，了解药物的杀菌速率和 杀菌效果。
了解抗菌药物的作用机制
大环内酯类
主要抑制细菌蛋白质的合成。
氨基糖苷类
与细菌核糖体结合，抑制蛋白 质合成。
thweek药学实验四药物的 体外抗菌试验
目录
• 实验目的 • 实验原理 • 实验步骤 • 数据分析与结论 • 实验注意事项与安全须知
01
实验目的
理解药物体外抗菌试验的原理
药物体外抗菌试验是指在体外条件下，通过实验室方法测试抗菌药物对病原微生 物的抑制或杀灭作用。其原理基于药物对微生物细胞膜、细胞壁、核酸或蛋白质 等生物大分子的影响，从而干扰或破坏微生物的正常生长和繁殖。
7药物的体外抗菌活性 抗生素效价测定
• Calculation method by formulae
W=(SH +UH) – (SL + UL)
V=(UH +UL) – (SH + SL)
θ= D×antilog(IV/W)
• Calculation method by figures
Notes：效价以百分数表示
• 4. 培养及观察
Procedures
Results and reports 记录MIC值
Strains
1
64
32
Drug concentration（μg/ml） 16 8 4 2 1
0.5
0
MIC (μg/ml)
2
3 4 5 6 7 8
+ + -
+ + -
+ -
+ -
+ +
+ +
+ + +
+ +
+ + + +
MIC≤0.5
MIC＞64 操作有误
MIC=8
注意：计算MIC值时，抗生素的量被 稀释了10倍，注意换算！
二、抗生素效价测定（p288）
Biological Assay of Antibiotics
• 抗生素效价分析：一般用芽孢杆菌，采用微生物
学方法测定，包括稀释法，比浊法和琼脂扩散法
系列浓度稀释
平板倍比稀释法
• 1. 药物倍比稀释（左氧氟沙星/罗红霉素）：
0、10、20、40、80、160ug/ml； • 2. 制备平板制备：稀释的药物1ml + 琼脂糖培养 基9ml，混匀，混合物制备平板； • 3. 菌液点样：用接种环点取菌液（四株大肠杆菌
药物的体外抗菌试验-第十九章
药物的体外抗菌试验-第十九章第十九章药物的体外抗菌试验教学要求.（一）掌握常用的体外抑菌试验（连续稀释法、琼脂扩散法）。
.（二）熟悉杀菌试验（最低杀菌浓度、最低致死浓度的含义及测定的方法，活菌计数法，石碳酸系数测定法）；联合抗菌试验（纸条试验、梯度平板纸条试验、棋盘格法），协同、拮抗、无关、累加的概念。
.（三）了解体外抗菌试验的影响因素。
第一节常用的体外抑菌试验一、药物的体外抗菌试验.又称药敏试验，主要用于筛选抗菌药物或测定细菌对药物的敏感性。
.最低抑菌浓度（MIC）：指药物完全抑制某种微生物生长的最低浓度。
.优点：方法简便、需时短、用药量少，不需要动物。
.缺点：不能根据体外试验结果肯定或否定一个药物的抗菌作用。
试验菌.细菌、霉菌和酵母菌常用.标准菌株：来自专门机构，我国是卫生部生物制品检定所菌种保藏中心提供。
.临床分离株：经形态、生化及血清学等方面鉴定。
不得有杂菌污染，不宜用传代多次的菌种，最好是重新活化的。
控制培养时间。
.接种菌量的多少的计算培养基.根据试验菌的营养要求进行选择.培养基质量控制供试药物.药物的浓度和总量要精确配制.供试药物用适宜溶剂溶解并稀释至所需浓度，难溶药物加助溶剂。
.中草药或某些生药原粉的样品，应先提取，再浓缩至所需浓度对照试验.试验菌对照：在无药情况下，应能在培养基内正常生长.已知药物对照：已知抗菌药对标准的敏感菌株应出现预期的抗菌效应，对已知的抗药菌应不出现抗菌效应。
.溶剂及稀释剂对照：抗菌药物配制时所用的溶剂及稀释剂应无抗菌作用（一）连续稀释法.方法：液体法和固体法。
.用于测定药物的最低抑菌浓度（MIC）和最低杀菌浓度（MBC）。
.抑菌：药物可抑制微生物生长繁殖，但不杀死它，在药物除去后，微生物又可恢复生长.杀菌：药物能杀死微生物，当药物去除后，微生物不再继续生长。
1、液体培养基稀释法.方法：两倍稀释法.步骤：液体培养基稀释药物成系列递减的浓度每管加入一定量试验菌24-48小时后肉眼观察试管浑浊情况，记录能抑制细菌生长的最低浓度（MIC）将未见细菌生长的各试管内的培养液（各吸取0.1ml）移种到新鲜的琼脂培养基上重新长出细菌的只具有抑菌作用，无菌生长（菌落数﹤5个）具有杀菌作用，记录最低杀菌浓度（MBC）。
药物的体外抗菌试验药物制剂的微生物学检查
三、耐药性的控制
1 、避免耐药菌传播（医院） 2 、合理用药 （1）抗生素可不用尽量不用，使用时应足量。 （2）合理联合用药 3、 抗耐药菌新抗生素的寻找，如酶抑制剂抗生 素等。 4 、耐药机制的研究—耐药规律寻找，有助于合 理用药。
四、耐药性和青霉素酶的测定
1 、耐药性—药敏试验 2 、青霉素酶 耐药菌接平板培养 →加含青霉素的淀粉 → 加I2出现透明圈（eg.金葡菌产酶 株）。
医疗用抗生素的特点
差异毒力大 生物活性强、有不同抗菌谱 不易使病原菌产生耐药性 毒副作用小，不易引起超敏反应 半衰期长，生物利用度高
抗生素的分类 抗生素产生菌的分离和筛选 抗生素的制备 抗生素的生物合成 抗生素的主要作用机制 抗药性 抗生素的单位及效价测定
（1）按化学结构分类
ß-内酰胺类—青霉素、头孢菌素等 四环类—四环素、土霉素、金霉素 氨基糖苷类—链霉素、卡那霉素、庆大霉素 大环内酯类—红霉素、螺旋霉素、麦迪霉素 多肽类—多黏菌素、杆菌肽等 多烯类—制霉菌素、两性霉素B、万古霉素 苯羟基胺类—氯霉素 蒽环类—柔红霉素、阿霉素 环桥类—利福霉素 其他
平板倍比稀释法
目前抗生素的临床前研究一般采用此法。平板倍比稀释法是 根据药物在琼脂培养基中扩散的原理，将细菌接种在含有不 同浓度抗生素的平板上恒温培养16~18小时，可抑制细菌生长 的最低药物浓度为最低抑菌浓度（MIC），可杀灭细菌的最低 药物浓度为最低杀菌浓度（MBC）。MIC或MBC值愈小，则药 物的抑菌或杀菌作用愈强。
磺胺类耐药菌株合成了对磺胺不敏感的二氢叶酸合 成酶，而引起耐药。 （靶位的改变）
喹诺酮类耐药菌的gyrA(gyrase)基因突变，DNA螺 旋酶A亚单位的变化，对该类药物不敏感。其中， gyrase（DNA旋转酶）为一种类型的拓扑异构酶， 引入负超螺旋至闭环双链DNA中。 （靶位的改变）
高级药理学 体外抗菌活性试验
体 外 抗 菌 活 性 试 验
三、比浊法
2. 步骤 将检品液也稀释成1~3种不同浓度， 种不同浓度， 将检品液也稀释成 种不同浓度 加入肉汤菌液培养基中。 加入肉汤菌液培养基中。 将全部试管移至37℃ 将全部试管移至 ℃恒温水浴箱 中约3~4h，待细菌充分生长后取 中约 ， 用光电比色计测定其透光度， 出，用光电比色计测定其透光度， 根据同浓度的读数求出平均值， 根据同浓度的读数求出平均值， 然后绘出标准曲线。 然后绘出标准曲线。 将检品管同样求出平均值， 将检品管同样求出平均值，根据 标准曲线即可求出被检品的效价。 标准曲线即可求出被检品的效价。
体 外 抗 菌 活 性 试 验
三、比浊法
2. 步骤 将标准药液稀释成不同稀释度 1:10,1:15,1:20,1:30,1:40。然后于 。 大小相同的试管内加入8.8mL肉 大小相同的试管内加入 肉 汤培养基， 汤培养基，同时接种试验菌液 0.2mL。取上述已稀释好的标准 。 稀释液1mL加入肉汤菌液试管中。 加入肉汤菌液试管中。 稀释液 加入肉汤菌液试管中 此时的稀释倍数为 1:100,1:150,1:200,1:300,1:400
无细菌生长的一管为最低抑菌浓度 （MIC）。 ）。
一、稀释法
稀 释 法
(二)固体稀释法 二 固体稀释法 2. 平皿稀释法 取平皿13只 加入不同浓度的药液 取平皿 只,加入不同浓度的药液 各1mL,第1~12平皿各加融化的普 第 平皿各加融化的普 通琼脂培养基9.0mL，第13平皿作 通琼脂培养基 ， 平皿作 为对照不加药，加入10mL培养基， 培养基， 为对照不加药，加入 培养基 均匀摇动使其与药液合一。 均匀摇动使其与药液合一。待琼 脂凝固、表面干燥后接种试验菌。 脂凝固、表面干燥后接种试验菌。 培养24~48h，观察结果，求出 置37 ℃培养 ，观察结果，
药物体外抗菌试验
实验六
主 要 内 容
教师讲解 1组/2人
4人/组
药物体外抗菌试验
MIC及MBC的测定 药敏试验——纸片法（大肠/金葡） 药物的细菌和霉菌总数测定
体外抗菌试验
：能抑制测试菌生长的最低药物浓度即为 连续稀释法（MIC） MIC。 ：能杀死测试菌的最低药物浓度即为MBC。
琼脂扩散法（K-B纸片法）
药物的细菌和霉菌总数测定
为什么要检定药品中的细菌和 真菌总数 ？ 细菌菌落总数（ Colony Form Unit，简写CFU ），指每克 或每毫升待检药品内含有的活 菌总数。
如何做口服药物中细菌总数的测定？
(1)
无菌操作取供试药品1 g或1mL，取10 mL无菌生理盐水，在无菌研钵中加入药 品和少量pH7.0无菌氯化钠–蛋白胨缓冲 液，将药品研碎，再将剩余的pH7.0无菌 氯化钠–蛋白胨缓冲液全部倒入并研匀， 制成的均匀1：10（ 10-1 ）供试液。
MIC及MBC的测定
MBC
不含药的平板
纸片法的原理
K-B纸片法
无菌吸管少量菌液滴加于平板 培养基（MHA）中央（2滴）； 涂布棒将菌液涂开； 做好标记；镊子夹取相应药物 纸片贴于含菌平板表面； 37℃培养箱内倒置培养24h； 测量抑菌圈直径（3次取平均 值）,并对照NCCLS的解释标准 （105页）来判断试验菌的药 敏性。
如何做口服药物中细菌总数的测定？
(4)计算每个平板上生长的菌落数，选菌 落数小于300之间的平板计算，菌落数乘 以稀释倍数，求得每克或每毫升供试品 中所含的菌落总数。
注意
1 无菌操作。 2 不同稀释剂不可使用同一吸管。 3倾倒培养基时温度不宜过高。 4培养时培养基要倒置。 5 做阴性对照。
主 要 内 容
教师讲解 1组/2人
4人/组
药物体外抗菌试验
MIC及MBC的测定 药敏试验——纸片法（大肠/金葡） 药物的细菌和霉菌总数测定
体外抗菌试验
：能抑制测试菌生长的最低药物浓度即为 连续稀释法（MIC） MIC。 ：能杀死测试菌的最低药物浓度即为MBC。
琼脂扩散法（K-B纸片法）
药物的细菌和霉菌总数测定
为什么要检定药品中的细菌和 真菌总数 ？ 细菌菌落总数（ Colony Form Unit，简写CFU ），指每克 或每毫升待检药品内含有的活 菌总数。
如何做口服药物中细菌总数的测定？
(1)
无菌操作取供试药品1 g或1mL，取10 mL无菌生理盐水，在无菌研钵中加入药 品和少量pH7.0无菌氯化钠–蛋白胨缓冲 液，将药品研碎，再将剩余的pH7.0无菌 氯化钠–蛋白胨缓冲液全部倒入并研匀， 制成的均匀1：10（ 10-1 ）供试液。
MIC及MBC的测定
MBC
不含药的平板
纸片法的原理
K-B纸片法
无菌吸管少量菌液滴加于平板 培养基（MHA）中央（2滴）； 涂布棒将菌液涂开； 做好标记；镊子夹取相应药物 纸片贴于含菌平板表面； 37℃培养箱内倒置培养24h； 测量抑菌圈直径（3次取平均 值）,并对照NCCLS的解释标准 （105页）来判断试验菌的药 敏性。
如何做口服药物中细菌总数的测定？
(4)计算每个平板上生长的菌落数，选菌 落数小于300之间的平板计算，菌落数乘 以稀释倍数，求得每克或每毫升供试品 中所含的菌落总数。
注意
1 无菌操作。 2 不同稀释剂不可使用同一吸管。 3倾倒培养基时温度不宜过高。 4培养时培养基要倒置。 5 做阴性对照。
体外抗菌药物抑菌试验(亦称细菌对药物的敏感试验-简称药...
❖ 敏感(S)：表示细菌可被常规剂量的药物在体内达到 的浓度所抑制或杀灭。
❖ 中度敏感(MS)：表示细菌可被该药物大剂量的浓度 所抑制或在药物生理性浓集的部位被抑制。
只有少数药物可报告中度敏感，如氨苄青霉素测肠 球菌。
❖ 中介度(1)：是为防止因技术因素失控导致结果误差 而设置的“缓冲域”因其临床意义难以确定，故不 应向临床医师报告。而应重做稀释法根据MIC结果 做出判断。
优缺点
❖ 稀释法是直接定量地检测抗菌药物在体 外对病原菌的抑制或杀灭浓度，有利于 临床根据MIC、药物代谢等拟定合理的 治疗方案，是目前厌氧菌的最佳测定方 法，琼脂稀释法还易于发现污染或耐药 突变菌。稀释法是新药开发，体外药敏 试验常用的经典参照标准，但操作相对 比较烦琐。
❖ 标准菌株的抑菌圈应落在表中所示的预期范 围内。如果超出该范围，应视为失控，须及 时查找原因，予以纠正。
❖ 培养基的质量、药敏纸片的质量、接种菌量、 试验操作质量、孵育条件、抑菌圈测量工具 的精度、质控菌株的药敏特性等均能影响结 果的准确性。
（二）肉汤稀释法 及琼脂稀释法
❖ 原理 是用水解酪蛋白肉汤(MH)或水解酪 蛋白琼脂（MHA）培养基作为稀释剂。 按《美国委员会临床实验室标准》作分 步倍比稀释抗菌药物，定量加入被检菌 株。经培养后观察抗菌药物的最小抑菌 浓度(MIC)和最低杀菌浓度(MBC)。
❖ 根据本国国情，卫生部临床检验中心还制订了关于 临床微生物实验室室内质控要求。临床具体工作须 参照遵守。
❖ 原理 是将定量抗菌药物纸片贴在涂有细菌的 琼脂平板上，抗菌药物在琼脂内向四周扩散， 其浓度逐渐递减，使纸片周围的敏感细菌受 到抑制生长，形成抑菌圈，测量抑菌圈的直 径来判定细菌对药物的敏感程度。此法简单 易行、价格便宜、药物选择灵活，适用对生 长快的细菌进行药敏试验。
7药物的体外抗菌活性 抗生素效价测定
+ -
+ -
+ +
+ +
+ + +
+ +
+ + + +
MIC≤0.5
MIC＞64 操作有误
MIC=8
注意：计算MIC值时，抗生素的量被 稀释了10倍，注意换算！
二、抗生素效价测定（p288）
Biological Assay of Antibiotics
• 抗生素效价分析：一般用芽孢杆菌，采用微生物
实验内容
一、药物的体外抗菌实验（p277）
二、抗生素效价测定（p288）
一、药物的体外抗菌实验（p277）
• 琼脂扩散渗透法（滤纸法，已做）。
• 系列浓度稀释法，测定药物的MIC。
概 念
• MIC: 最低抑菌浓度, 药物能够抑制微生物
生长的最低浓度；mg/ml或ug/ml为单位。
• MBC: 最低杀菌浓度，能杀灭微生物生长
• Calculation method by formulae
W=(SH +UH) – (SL + UL)
V=(UH +UL) – (SH + SL)
θ= D×antilog(IVFra bibliotekW)• Calculation method by figures
Notes：效价以百分数表示
学方法测定，包括稀释法，比浊法和琼脂扩散法
• 琼脂扩散法-管蝶法 (Cylinder plate method)：
灵敏度高、能直接显示出抗生素的抗菌活性。
已列入药典。
琼脂扩散法-管蝶法
• 一剂量法、二剂量法（常用）、三剂量法
体外抗菌实验PPT精选文档
第二十章 药物的体外抗菌试验
1
药物的体外抗菌试验
药物的体外抗菌试验是在体外测定微 生物对药物敏感程度的试验，
已广泛地应用于科研、生产和临床。如抗菌 药物的筛选、提取过程中的追踪、抗菌谱的定、 药物含量的测定、药物血浓度测定、指导临床用 药的药敏试验等。
抗菌试验包括抑荫试验和杀菌试验。
抑菌：即抑制微生物的生长繁殖，但不能杀死微 生物，在药物除去后微生物又能生长. 杀菌：即能杀死微 生物，当药物除去后，微生 物也不能再生长繁殖。
2
第一节 常用的体外抑菌试验
连续稀释法：
可用于测定药物的最低抑菌浓度(MIC)和最低杀 菌浓度(MBC)。可以用液体培养基，也可用固体培 养基。
1．液体培养基连续稀释法 2．固体培养基连续稀释法
分平板法和斜面 法。
3
琼脂扩散法：
是利用药物可以在琼脂培养基中扩散，在药 物有效浓度的范围内形成抑菌圈或抑菌距离，以 抑菌圈直径或抑菌距离的大小来评价药物抗菌作 用强弱。
7
第三节 联合抗菌试验
在药学上作中，常需检查两种抗菌药物 在联合应用时的相互作用以及抗菌药物与不 同pH值或不同离子溶液的相互影响。如加强 药物抗菌作用的为协同(synergism)；减弱药 物作用的为拮抗(antagonism)；相互无影响的 为无关(indjfference)；作用为二者之和的为累 加(addition)。
8
纸条试验
即在已接种试验菌的平板表面垂直放置两条各浸有 一种药液的滤纸条，培养后根据抑菌区的加强、减弱或 无影响来判断它们在联合应用时的效应。
梯度平板纸条试验
需先制备含药的梯度平板。将试验菌悬液涂布于 平板表面，取滤纸条浸透另一待检药液，按梯度平板 中药物浓度递减的方向置于平板表面。培养后，如该 待检药液对平板内的药物有加强作用，则可见沿纸条 两边的抑菌区被扩大。
1
药物的体外抗菌试验
药物的体外抗菌试验是在体外测定微 生物对药物敏感程度的试验，
已广泛地应用于科研、生产和临床。如抗菌 药物的筛选、提取过程中的追踪、抗菌谱的定、 药物含量的测定、药物血浓度测定、指导临床用 药的药敏试验等。
抗菌试验包括抑荫试验和杀菌试验。
抑菌：即抑制微生物的生长繁殖，但不能杀死微 生物，在药物除去后微生物又能生长. 杀菌：即能杀死微 生物，当药物除去后，微生 物也不能再生长繁殖。
2
第一节 常用的体外抑菌试验
连续稀释法：
可用于测定药物的最低抑菌浓度(MIC)和最低杀 菌浓度(MBC)。可以用液体培养基，也可用固体培 养基。
1．液体培养基连续稀释法 2．固体培养基连续稀释法
分平板法和斜面 法。
3
琼脂扩散法：
是利用药物可以在琼脂培养基中扩散，在药 物有效浓度的范围内形成抑菌圈或抑菌距离，以 抑菌圈直径或抑菌距离的大小来评价药物抗菌作 用强弱。
7
第三节 联合抗菌试验
在药学上作中，常需检查两种抗菌药物 在联合应用时的相互作用以及抗菌药物与不 同pH值或不同离子溶液的相互影响。如加强 药物抗菌作用的为协同(synergism)；减弱药 物作用的为拮抗(antagonism)；相互无影响的 为无关(indjfference)；作用为二者之和的为累 加(addition)。
8
纸条试验
即在已接种试验菌的平板表面垂直放置两条各浸有 一种药液的滤纸条，培养后根据抑菌区的加强、减弱或 无影响来判断它们在联合应用时的效应。
梯度平板纸条试验
需先制备含药的梯度平板。将试验菌悬液涂布于 平板表面，取滤纸条浸透另一待检药液，按梯度平板 中药物浓度递减的方向置于平板表面。培养后，如该 待检药液对平板内的药物有加强作用，则可见沿纸条 两边的抑菌区被扩大。
抗菌试验
2．培养基
根据试验菌的营养需要进行选择，应能使试验菌生长良 好。培养基的质量须加控制。
3．供试药物 药物的浓度和总量直接影响抗菌试验的结果，需精确配制。
4．对照试验
为准确判断结果，试验中必须有各种对照试验与抗菌试 验同时进行。 试验菌对照：在无药情况下，应能在培养基内正常生长。 已知药物对照：已知抗菌药对标准的敏感菌株应出现预期 的抗菌效应，对已知的抗药菌应不出现抗菌效应。
药物的微生物学测定
抗菌效力的测定 药品卫生质量的检查
Байду номын сангаас
药物含量测定
第一节 体外抑菌试验
检查药物的抗菌效能 体内试验 体外试验 广泛应用
一、常用的体外抗菌试验（antimicrobial test in vitro）
主要用于筛选抗菌药物或测定细菌对药物的敏感性，所以 也称药敏试验，常用最低抑菌浓度（MIC）表示，是指药 物完全抑制某种微生物生长的最低浓度。 试验大多在玻璃器皿中进行，优点是方法简便、需时短、 用药量少，不需要动物。 但是没有体内复杂的因素参与，故体内和体外抗菌试验结 果有时会不一致。
第十九章药物的抗菌试验抗菌效力的测定药品卫生质量的检查药物含量测定药物含量测定药物的微生物学测定第一节体外抑菌试验体内试验体外试验检查药物的抗菌效能广泛应用主要用于筛选抗菌药物或测定细菌对药物的敏感性所以也称药敏试验常用最低抑菌浓度mic表示是指药物完全抑制某种微生物生长的最低浓度
第十九章 药物的抗菌试验
（一）琼脂扩散法（agar difussion test） 利用药物可以在琼脂培养基中扩散的原理，基本方法是将 试验菌加入琼脂培养基，混合倾注平板（或用Ｌ棒使试验 菌均匀分布），然后加药于含菌平板上，培养18~24小时后， 根据抑菌圈或抑菌范围大小初步判断抑菌作用的强弱。
实验4药物体外抗菌试验PPT课件
考虑药物浓度的影响
在解读结果时，需要考虑药物浓度对抑菌效果的影响。一般来说，药物浓度越高，抑菌效 果越好。因此，在比较不同药物或不同浓度时，需要确保实验条件的一致性。
结合临床实际
在解读结果时，需要结合临床实际考虑药物的抗菌效果。例如，对于某些临床常见细菌， 如果实验结果显示药物具有较好的抗菌作用，那么该药物可能对治疗该细菌感染具有一定 的应用价值。
头孢菌素类
具有广谱抗菌作用，对革 兰氏阳性菌和阴性菌均有 较强抗菌活性。
碳青霉烯类
具有非常强的抗菌作用， 对大多数细菌均有较好的 抗菌效果。
大环内酯类
红霉素
主要对革兰氏阳性菌有抗菌作用 ，对部分革兰氏阴性菌和支原体 也有效。
阿奇霉素
具有广谱抗菌作用，对革兰氏阳 性菌、革兰氏阴性菌和支原体均 有较好抗菌效果。
避免不良反应
联合用药可能会增加不良反应的风险，因此应谨 慎选择药物组合。
THANKS FOR WATCHING
感谢您的观看
稀释法
总结词
稀释法是通过连续稀释抗菌药物浓度， 观察细菌生长情况，从而判断细菌对 抗菌药物的敏感程度。
详细描述
稀释法是将抗菌药物稀释成不同浓度， 然后将不同浓度的抗菌药物与细菌混 合培养。通过观察细菌的生长情况， 可以判断细菌对抗菌药物的敏感程度。
E-test法
总结词
E-test法是一种基于纸片扩散法的改良方法，通过在平板上涂布抗菌药物的纤维棒，测量抑菌圈的大小判断细菌 对抗菌药物的敏感程度。
测定药物能够抑制细菌生长的最低浓 度，是衡量药物抗菌效果的重要指标。 MIC值越低，说明药物抗菌效果越好。
细菌生长情况
观察细菌在药物作用下的生长情况， 可以评估药物的抗菌效果。如果细菌 生长受到明显抑制，说明药物具有较 好的抗菌作用。
在解读结果时，需要考虑药物浓度对抑菌效果的影响。一般来说，药物浓度越高，抑菌效 果越好。因此，在比较不同药物或不同浓度时，需要确保实验条件的一致性。
结合临床实际
在解读结果时，需要结合临床实际考虑药物的抗菌效果。例如，对于某些临床常见细菌， 如果实验结果显示药物具有较好的抗菌作用，那么该药物可能对治疗该细菌感染具有一定 的应用价值。
头孢菌素类
具有广谱抗菌作用，对革 兰氏阳性菌和阴性菌均有 较强抗菌活性。
碳青霉烯类
具有非常强的抗菌作用， 对大多数细菌均有较好的 抗菌效果。
大环内酯类
红霉素
主要对革兰氏阳性菌有抗菌作用 ，对部分革兰氏阴性菌和支原体 也有效。
阿奇霉素
具有广谱抗菌作用，对革兰氏阳 性菌、革兰氏阴性菌和支原体均 有较好抗菌效果。
避免不良反应
联合用药可能会增加不良反应的风险，因此应谨 慎选择药物组合。
THANKS FOR WATCHING
感谢您的观看
稀释法
总结词
稀释法是通过连续稀释抗菌药物浓度， 观察细菌生长情况，从而判断细菌对 抗菌药物的敏感程度。
详细描述
稀释法是将抗菌药物稀释成不同浓度， 然后将不同浓度的抗菌药物与细菌混 合培养。通过观察细菌的生长情况， 可以判断细菌对抗菌药物的敏感程度。
E-test法
总结词
E-test法是一种基于纸片扩散法的改良方法，通过在平板上涂布抗菌药物的纤维棒，测量抑菌圈的大小判断细菌 对抗菌药物的敏感程度。
测定药物能够抑制细菌生长的最低浓 度，是衡量药物抗菌效果的重要指标。 MIC值越低，说明药物抗菌效果越好。
细菌生长情况
观察细菌在药物作用下的生长情况， 可以评估药物的抗菌效果。如果细菌 生长受到明显抑制，说明药物具有较 好的抗菌作用。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
.用于细菌和酵母菌的药敏试验
1、滤纸片法
含药物的滤纸片含菌平板抑菌圈37℃培养
K-B法
.基本原理：滤纸片法，但需用统一的培养
基、菌液浓度、纸片质量、纸片含药量以
及其他试验条件。
.结果判断：卡尺精确量取，根据抑菌圈注入药液代替滤纸片含菌平板药液
.将待检药物先以合适的液体培养基在试管内进行连续稀释，每管内再加入一定量的试验菌液，培养后可得该药物的MIC，取MIC终点以上未长菌的各管培养液，分别移种于另一无菌平板上，培养后凡平板上无菌生长的药物最低浓度即为该药物的MBC（或MLC）。
图
20-1液体培养基连续稀释
法
.进行实验时，在药物连续稀释后，每管内加
自高浓度（
+）至低浓度（
-）依次递减。
.将实验菌悬液涂布于平板表面，
.取滤纸条浸透另一待检药液，按梯度平板中药物
浓度递减的方向置于平板表面。
.培养后，如待检药液对平板的药物有加强作用，
则可见纸条两端的抑菌区被扩大。
三、棋盘格法
.含两种不同浓度药物的试管或平板排列呈棋盘状
而得名。
.方法：分别测定联合药物各自对被检菌的
3、管碟法
.小管（玻璃管、铝管、钢管）放于含菌平
板上，小管内加入药液，根据抑菌圈直径
判断抗菌效力。含菌平板小管药液
4、挖沟法
.于无菌平板上挖沟取出琼脂条，沟内加入药液，然后在沟两旁接种几种试验菌。
.适用于一药多菌的测定。
ABC
1
2
3
4
5
药液细菌菌苔
接种的细菌
琼脂扩散法特点
.优点：简单、快速、可同时进行多样品或多菌株的研究。
入定量实验活菌液（105-106细菌/ml）。培
养后从肉眼观察无菌生长的试管内各取培养
液0.1ml或0.01ml涂布于平板上测定存活菌
数，以使99.9%微生物致死的药物最低浓度
为MLC，即在一定条件下，存活的菌数不多
于原始接种数的0.1%。
二、活菌计数
（viable counting method）
三、苯酚系数测定法
（phenol coefficient）
.又称酚系数法，是以苯酚为标准，在规定的实验条件下，作用一定时间，将待测的化学消毒剂与苯酚对伤寒沙门菌或金黄色葡萄球菌的杀菌效力相比较，所得杀菌效力的比值。
.苯酚系数是了解消毒剂杀菌效力的一种方法。
.苯酚系数=消毒剂的杀菌稀释度/苯酚的杀菌稀释度苯酚系数大于或等于2为合格。
第一节
常用的体外抑菌试验
一、药物的体外抗菌试验
.又称药敏试验，主要用于筛选抗菌药物或测定细菌对药物的敏感性。
.最低抑菌浓度（MIC）：指药物完全抑制某种微生物生长的最低浓度。
.优点：方法简便、需时短、用药量少，不需要动物。
.缺点：不能根据体外试验结果肯定或否定一个药物的抗菌作用。试验菌
.细菌、霉菌和酵母菌常用
.中草药或某些生药原粉的样品，应先提取，再浓缩至所需浓度对照试验
.试验菌对照：在无药情况下，应能在培养基内正常生长
.已知药物对照：已知抗菌药对标准的敏感菌株应出现预期的抗菌效应，对已知的抗药菌应不出现抗菌效应。
.溶剂及稀释剂对照：抗菌药物配制时所用的溶剂及稀释剂应无抗菌作用
（一）连续稀释法
.方法：液体法和固体法。
所谓FIC指数，指二药各自的FIC之和，即FIC指数= FIC（A）+ FIC（B）
FIC指数与联合抗菌效应
FIC指数＜0.75协同作用
FIC指数0.75-1累加作用
FIC指数1-2无关作用
FIC指数＞2拮抗作用
FIC指数越小，则联合抗菌作用越强。
四、药物的体内抗菌试验
.在体外测定药物抗菌作用的同时，需进一步了解药物对试验感染动物是否有疗效，以确定体内抗菌效果。
液体棋盘稀释法的药物浓度编排
部分抑菌浓度FIC也称联合抑菌分数，指某一药在联合前后所测得的MIC
比值，可根据FIC指数来评价两抗菌药物联合作用时所
产生的效果。
如二待测药为A、B，则
A药与B药联合试验时A药的MIC；FIC（A）= A药单独试验时的MIC
B药与A药联合试验时B药的MIC；FIC（B）= B药单独试验时的MIC
色深、澄明度差的样品的抗菌作用测定。
.优点：在一组平板中测定多种试验菌的MIC，不受药物颜色及浑浊度的影响；容易发现污染菌。
.缺点：不易进行再培养而确定MBC。
.（2）斜面法
.方法：不同浓度的药物混入培养基中制成斜面，于斜面上接种一定量的试验菌，观察其MIC值。
.用途：用于需长时间培养的试验菌（如TB）或避免孢子飞扬污染环境的霉菌。
.方法：将临床分离致病菌注入动物体内或感染外伤部位，，使动物感染发病或死亡，选用能引起小鼠全部死亡的最小菌悬液浓度即最小致死量（MLD）作为感染量；感染后再用欲测药物以不同剂量或不同给药途径进行治疗，同时试验对照组以生理盐水代替药物进行给药。
第四节
体外抗菌试验的影响因素
1、试验菌
.应用标准菌株。标准菌株来自专门的供应机构。
第十九章
药物的体外抗菌试验
教学要求
.（一）掌握常用的体外抑菌试验（连续稀释法、琼脂扩散法）。
.（二）熟悉杀菌试验（最低杀菌浓度、最低致死浓度的含义及测定的方法，活菌计数法，石碳酸系数测定法）；联合抗菌试验（纸条试验、梯度平板纸条试验、棋盘格法），协同、拮抗、无关、累加的概念。
.（三）了解体外抗菌试验的影响因素。
.优点：不受药物颜色及浑浊度的影响；容易发现污染菌。
.缺点：不易进行再培养而确定MBC。
（二）琼脂扩散法
.定性试验
.基本方法：利用药物可以在琼脂培养基中扩散的原理，将试验菌加入琼脂培养基，混合倾注平板或用L棒使试验菌均匀分布，然后加药于含菌平板，培养18-24小时后，根据抑菌圈或抑菌范围大小初步判断抑菌作用的强弱。
感，甲药对乙药发生切割状
拮抗现象
细菌对甲、乙两药均敏感
，乙药使甲药的抑菌环呈
扁圆形
三、梯度平板纸条试验
（paper strip-gradient plate test）
.含药的梯度平板的制备:
.先将琼脂培养基倒入平皿，平皿斜置待凝，再将
平板放置水平，加入含抗菌药物的琼脂培养基。
在重叠的双层平板中含有梯度浓度的抗菌药物，
.缺点：粗糙、重复性差、干扰因素较多，只用于抗菌药物的初筛。
第二节杀菌试验
一、最低杀菌浓度或最低致死浓度的测定
.最低杀菌浓度：指该药物能杀死细菌的最低浓度。
从对微生物广义而言，也可称之为最低致死浓度（
MLC）。
.
MBC（或MLC）的含义也可定义为:在一定条件下，使绝大多数微生物被杀死，但允许有最少量微生物存活的药物最低浓度。
.用于测定药物的最低抑菌浓度（MIC）和最低杀菌浓度（MBC）。
.抑菌：药物可抑制微生物生长繁殖，但不杀死它，在药物除去后，微生物又可恢复生长
.杀菌：药物能杀死微生物，当药物去除后，微生物不再继续生长。
1、液体培养基稀释法
.方法：两倍稀释法
.步骤：
液体培养基稀释药物成系列递减的浓度每
管加入一定量试验菌24-48小时后肉眼观察试管浑浊情况，记录能抑制细菌生长的最低浓度（MIC）将未见细菌生长的各试管内的培养液（各吸取0.1ml）移种到新鲜的琼脂培养基上重新长出细菌的只具有抑菌作用，无菌生长（菌落数﹤5个）具有杀菌作用，记录最低杀菌浓度（MBC）。
.我国由北京卫生部生物制品检定所菌种保藏中心供应。
.在特定条件下，有时需用临床新分离菌株。
.试验菌加以合理的保藏，使用前应加以纯化及必要的生物学特征鉴定。
2、培养基
.质量需加以控制；
.原料、成品的外观及性能应符合要求，经无菌检查合格后使用。
3、抗菌药物
.药物的浓度和总量直接影响抗菌试验的结果，需要精确配制；
苯酚系数法还有以下缺点
ü1)有机物存在时消毒剂失去活性;
ü2)消毒剂可能对组织有毒性;
ü3)随温度变化而影响测定结果
;
ü4)只适用于同类消毒剂的杀菌效力测
定,对非酚类、季铵盐及不稳定的次氯
酸盐等均不能给予正确评价.
第三节
联合抗菌试验
.抗菌药物联合应用的效果有四种：
.协同作用：加强药物抗菌作用
.拮抗作用：减弱药物抗菌作用
105CFU/ml。
.一定间隔时间内将试验管充分混合后取样并稀释，用平板法进行活菌计数，绘制活菌数的对数-时间曲线。
2、固体培养基稀释法
.（1）平板法
.方法：系列浓度的药物混入琼脂平板，用微量加样
器或多点接种仪接种试验菌。
.用途：用于各种药物的抗菌活性测定及新抗菌药物
的筛选。特别适合于非酵母样的真菌药敏试验及颜
.是在一定浓度的定量药物内加入定量的实验菌，作用一定时间后，取样进行活菌计数，从存活的微生物数计算出药物对微生物的致死率。
方法
.取实验菌与药物作用后的混合液，经稀释后取定量混入琼脂培养基，倾注成平板。培养后计数长出的菌落数或菌落形成单位（CFU）。再乘以稀释倍数，即可得药物稀释后每毫升内存活的细菌数或CFU。
2）已知药物对照：已知的抗菌药物对标准的敏感菌株应出现预期的抗菌效应，对已知的抗药菌应不出现抗菌效应。
3）溶剂及稀释液对照：抗菌药物配制时所用的溶剂及稀释液应无抗菌作用。
小结
1、体外抑菌试验（连续稀释法、琼脂扩散法）。
2、杀菌试验（最低杀菌浓度or最低致死浓度的含义及测定的方法，活菌计数法，石碳酸系数测定法）；联合抗菌试验（纸条试验、梯度平板纸条试验、棋盘格法），协同、拮抗、无关、累加的概念。
.累加作用：作用为两者之和
.无关作用：相互无影响
.常用方法：棋盘稀释法和琼脂扩散纸片法
1、滤纸片法
含药物的滤纸片含菌平板抑菌圈37℃培养
K-B法
.基本原理：滤纸片法，但需用统一的培养
基、菌液浓度、纸片质量、纸片含药量以
及其他试验条件。
.结果判断：卡尺精确量取，根据抑菌圈注入药液代替滤纸片含菌平板药液
.将待检药物先以合适的液体培养基在试管内进行连续稀释，每管内再加入一定量的试验菌液，培养后可得该药物的MIC，取MIC终点以上未长菌的各管培养液，分别移种于另一无菌平板上，培养后凡平板上无菌生长的药物最低浓度即为该药物的MBC（或MLC）。
图
20-1液体培养基连续稀释
法
.进行实验时，在药物连续稀释后，每管内加
自高浓度（
+）至低浓度（
-）依次递减。
.将实验菌悬液涂布于平板表面，
.取滤纸条浸透另一待检药液，按梯度平板中药物
浓度递减的方向置于平板表面。
.培养后，如待检药液对平板的药物有加强作用，
则可见纸条两端的抑菌区被扩大。
三、棋盘格法
.含两种不同浓度药物的试管或平板排列呈棋盘状
而得名。
.方法：分别测定联合药物各自对被检菌的
3、管碟法
.小管（玻璃管、铝管、钢管）放于含菌平
板上，小管内加入药液，根据抑菌圈直径
判断抗菌效力。含菌平板小管药液
4、挖沟法
.于无菌平板上挖沟取出琼脂条，沟内加入药液，然后在沟两旁接种几种试验菌。
.适用于一药多菌的测定。
ABC
1
2
3
4
5
药液细菌菌苔
接种的细菌
琼脂扩散法特点
.优点：简单、快速、可同时进行多样品或多菌株的研究。
入定量实验活菌液（105-106细菌/ml）。培
养后从肉眼观察无菌生长的试管内各取培养
液0.1ml或0.01ml涂布于平板上测定存活菌
数，以使99.9%微生物致死的药物最低浓度
为MLC，即在一定条件下，存活的菌数不多
于原始接种数的0.1%。
二、活菌计数
（viable counting method）
三、苯酚系数测定法
（phenol coefficient）
.又称酚系数法，是以苯酚为标准，在规定的实验条件下，作用一定时间，将待测的化学消毒剂与苯酚对伤寒沙门菌或金黄色葡萄球菌的杀菌效力相比较，所得杀菌效力的比值。
.苯酚系数是了解消毒剂杀菌效力的一种方法。
.苯酚系数=消毒剂的杀菌稀释度/苯酚的杀菌稀释度苯酚系数大于或等于2为合格。
第一节
常用的体外抑菌试验
一、药物的体外抗菌试验
.又称药敏试验，主要用于筛选抗菌药物或测定细菌对药物的敏感性。
.最低抑菌浓度（MIC）：指药物完全抑制某种微生物生长的最低浓度。
.优点：方法简便、需时短、用药量少，不需要动物。
.缺点：不能根据体外试验结果肯定或否定一个药物的抗菌作用。试验菌
.细菌、霉菌和酵母菌常用
.中草药或某些生药原粉的样品，应先提取，再浓缩至所需浓度对照试验
.试验菌对照：在无药情况下，应能在培养基内正常生长
.已知药物对照：已知抗菌药对标准的敏感菌株应出现预期的抗菌效应，对已知的抗药菌应不出现抗菌效应。
.溶剂及稀释剂对照：抗菌药物配制时所用的溶剂及稀释剂应无抗菌作用
（一）连续稀释法
.方法：液体法和固体法。
所谓FIC指数，指二药各自的FIC之和，即FIC指数= FIC（A）+ FIC（B）
FIC指数与联合抗菌效应
FIC指数＜0.75协同作用
FIC指数0.75-1累加作用
FIC指数1-2无关作用
FIC指数＞2拮抗作用
FIC指数越小，则联合抗菌作用越强。
四、药物的体内抗菌试验
.在体外测定药物抗菌作用的同时，需进一步了解药物对试验感染动物是否有疗效，以确定体内抗菌效果。
液体棋盘稀释法的药物浓度编排
部分抑菌浓度FIC也称联合抑菌分数，指某一药在联合前后所测得的MIC
比值，可根据FIC指数来评价两抗菌药物联合作用时所
产生的效果。
如二待测药为A、B，则
A药与B药联合试验时A药的MIC；FIC（A）= A药单独试验时的MIC
B药与A药联合试验时B药的MIC；FIC（B）= B药单独试验时的MIC
色深、澄明度差的样品的抗菌作用测定。
.优点：在一组平板中测定多种试验菌的MIC，不受药物颜色及浑浊度的影响；容易发现污染菌。
.缺点：不易进行再培养而确定MBC。
.（2）斜面法
.方法：不同浓度的药物混入培养基中制成斜面，于斜面上接种一定量的试验菌，观察其MIC值。
.用途：用于需长时间培养的试验菌（如TB）或避免孢子飞扬污染环境的霉菌。
.方法：将临床分离致病菌注入动物体内或感染外伤部位，，使动物感染发病或死亡，选用能引起小鼠全部死亡的最小菌悬液浓度即最小致死量（MLD）作为感染量；感染后再用欲测药物以不同剂量或不同给药途径进行治疗，同时试验对照组以生理盐水代替药物进行给药。
第四节
体外抗菌试验的影响因素
1、试验菌
.应用标准菌株。标准菌株来自专门的供应机构。
第十九章
药物的体外抗菌试验
教学要求
.（一）掌握常用的体外抑菌试验（连续稀释法、琼脂扩散法）。
.（二）熟悉杀菌试验（最低杀菌浓度、最低致死浓度的含义及测定的方法，活菌计数法，石碳酸系数测定法）；联合抗菌试验（纸条试验、梯度平板纸条试验、棋盘格法），协同、拮抗、无关、累加的概念。
.（三）了解体外抗菌试验的影响因素。
.优点：不受药物颜色及浑浊度的影响；容易发现污染菌。
.缺点：不易进行再培养而确定MBC。
（二）琼脂扩散法
.定性试验
.基本方法：利用药物可以在琼脂培养基中扩散的原理，将试验菌加入琼脂培养基，混合倾注平板或用L棒使试验菌均匀分布，然后加药于含菌平板，培养18-24小时后，根据抑菌圈或抑菌范围大小初步判断抑菌作用的强弱。
感，甲药对乙药发生切割状
拮抗现象
细菌对甲、乙两药均敏感
，乙药使甲药的抑菌环呈
扁圆形
三、梯度平板纸条试验
（paper strip-gradient plate test）
.含药的梯度平板的制备:
.先将琼脂培养基倒入平皿，平皿斜置待凝，再将
平板放置水平，加入含抗菌药物的琼脂培养基。
在重叠的双层平板中含有梯度浓度的抗菌药物，
.缺点：粗糙、重复性差、干扰因素较多，只用于抗菌药物的初筛。
第二节杀菌试验
一、最低杀菌浓度或最低致死浓度的测定
.最低杀菌浓度：指该药物能杀死细菌的最低浓度。
从对微生物广义而言，也可称之为最低致死浓度（
MLC）。
.
MBC（或MLC）的含义也可定义为:在一定条件下，使绝大多数微生物被杀死，但允许有最少量微生物存活的药物最低浓度。
.用于测定药物的最低抑菌浓度（MIC）和最低杀菌浓度（MBC）。
.抑菌：药物可抑制微生物生长繁殖，但不杀死它，在药物除去后，微生物又可恢复生长
.杀菌：药物能杀死微生物，当药物去除后，微生物不再继续生长。
1、液体培养基稀释法
.方法：两倍稀释法
.步骤：
液体培养基稀释药物成系列递减的浓度每
管加入一定量试验菌24-48小时后肉眼观察试管浑浊情况，记录能抑制细菌生长的最低浓度（MIC）将未见细菌生长的各试管内的培养液（各吸取0.1ml）移种到新鲜的琼脂培养基上重新长出细菌的只具有抑菌作用，无菌生长（菌落数﹤5个）具有杀菌作用，记录最低杀菌浓度（MBC）。
.我国由北京卫生部生物制品检定所菌种保藏中心供应。
.在特定条件下，有时需用临床新分离菌株。
.试验菌加以合理的保藏，使用前应加以纯化及必要的生物学特征鉴定。
2、培养基
.质量需加以控制；
.原料、成品的外观及性能应符合要求，经无菌检查合格后使用。
3、抗菌药物
.药物的浓度和总量直接影响抗菌试验的结果，需要精确配制；
苯酚系数法还有以下缺点
ü1)有机物存在时消毒剂失去活性;
ü2)消毒剂可能对组织有毒性;
ü3)随温度变化而影响测定结果
;
ü4)只适用于同类消毒剂的杀菌效力测
定,对非酚类、季铵盐及不稳定的次氯
酸盐等均不能给予正确评价.
第三节
联合抗菌试验
.抗菌药物联合应用的效果有四种：
.协同作用：加强药物抗菌作用
.拮抗作用：减弱药物抗菌作用
105CFU/ml。
.一定间隔时间内将试验管充分混合后取样并稀释，用平板法进行活菌计数，绘制活菌数的对数-时间曲线。
2、固体培养基稀释法
.（1）平板法
.方法：系列浓度的药物混入琼脂平板，用微量加样
器或多点接种仪接种试验菌。
.用途：用于各种药物的抗菌活性测定及新抗菌药物
的筛选。特别适合于非酵母样的真菌药敏试验及颜
.是在一定浓度的定量药物内加入定量的实验菌，作用一定时间后，取样进行活菌计数，从存活的微生物数计算出药物对微生物的致死率。
方法
.取实验菌与药物作用后的混合液，经稀释后取定量混入琼脂培养基，倾注成平板。培养后计数长出的菌落数或菌落形成单位（CFU）。再乘以稀释倍数，即可得药物稀释后每毫升内存活的细菌数或CFU。
2）已知药物对照：已知的抗菌药物对标准的敏感菌株应出现预期的抗菌效应，对已知的抗药菌应不出现抗菌效应。
3）溶剂及稀释液对照：抗菌药物配制时所用的溶剂及稀释液应无抗菌作用。
小结
1、体外抑菌试验（连续稀释法、琼脂扩散法）。
2、杀菌试验（最低杀菌浓度or最低致死浓度的含义及测定的方法，活菌计数法，石碳酸系数测定法）；联合抗菌试验（纸条试验、梯度平板纸条试验、棋盘格法），协同、拮抗、无关、累加的概念。
.累加作用：作用为两者之和
.无关作用：相互无影响
.常用方法：棋盘稀释法和琼脂扩散纸片法