免疫荧光抗体检测技术

实验七免疫荧光抗体检测技术

一、目的要求

通过本实验，了解和掌握直接免疫荧光和间接免疫荧光染色的原理和方法，并能应用于疾病的诊断和抗原抗体的分析。

二、实验原理

用化学或物理的方法将荧光素标记到抗体或抗原上，这种标记荧光素的抗体或抗原仍然能与相应抗原或抗体发生特异性结合。通过已知的荧光抗体或抗原，检测样本中相应的抗原或抗体，从而进行疾病的诊断和对抗原抗体的分析。

间接免疫荧光试验

三、实验材料

感染鸡马立克病病毒（MDV）的细胞培养物，抗MDV特异性单克隆抗体BA4;丙酮-乙醇（6:4，V/V）固定液，盖玻片，FITC标记的抗小鼠IgG荧光抗体，0.01mol/L PBS(pH 7.2)，蒸馏水，载玻片（洁净无油）；1000ml 烧杯，磁棒，磁力搅拌器，200μL移液器，吸水纸，镊子等。

四、实验方法

1.细胞片的制备与固定将消毒并处理过的盖玻片放于细胞培养瓶（皿）中，按常规操作，制备鸡胚成纤维细胞，并培养于细胞培养瓶（皿）中，待细胞生长成单层后，接种CVI988/Rispens疫苗株。48—72h后，直接收获盖片，用PBS洗涤1次，再以-20℃预冷的丙酮-乙醇（6:4，V/V）固定液固定5min，空气干燥，置密封容器于-20℃保存备用。如用96孔或24孔细胞培养板培养的细胞，可弃去培养液，用PBS洗涤1次，然后固定，固定方法同上。

2.抗体染色

⑴将接种并固定的MDV病毒的盖玻片，用PBS洗涤1次，置架上。取未接种MD病毒的盖玻片，同上用PBS洗涤1次，置架上，作为阴性对照。盖玻片上滴加10μL—20μL工作浓度的单克隆抗体，96孔细胞培养板加入50μL/孔工作浓度的单克隆抗体。37℃水浴孵育30—45min。

⑵盖玻片在PBS（Ph7.4,0.01mol/L）中用磁力搅拌器洗涤5—10min，如用96孔细胞培养板检测，则加入PBS 200μL/孔，洗涤3—4次。

⑶取出盖片置架上，滴加工作浓度的荧光抗体（FITC标记的抗小鼠IgG的抗体）。37℃孵

育30—45min。同上洗涤。取出盖玻片，用甘油PBS封存于干净玻片上。在荧光显微镜下观察。

3.结果判定

⑴阳性结果：可见特异性亮绿色荧光，荧光呈现出MDV特有的病毒斑。

⑵阴性结果：无可见的荧光出现。

直接免疫荧光实验

三、实验材料

987P阳性大肠杆菌培养物，用FITC标记的抗987P特异性单克隆抗体丙酮-乙醇（6：4，V/V）固定液；盖玻片，0.01mol/L PBS(pH7.2)，蒸馏水，载玻片（洁净无油），1000ml 烧杯，磁棒，磁力搅拌器，200μl移液器，吸水纸，镊子等。

四、实验方法

1.细菌涂片的制备将10μL大肠杆菌悬液（1*108个/ml）涂抹在7mm*21mm盖玻片上，自然干燥后，用-20℃预冷的丙酮固定5min，空气中自然干燥后，于-20℃保存备用。

2.抗体染色

⑴将固定的大肠杆菌盖玻片，用PBS洗涤1次后，置架上；987P阴性大肠杆菌固定的盖玻片，同上用PBS洗涤1次后，置架上，作为阴性对照；盖玻片上滴加10~20μl工作浓度的FITC标记的抗987P特异性单克隆，37℃水浴孵育30-45min。

⑵盖玻片在PBS（Ph7.4,0.01mol/L）中用磁力搅拌器洗涤5—10min，取出盖片，用甘油BS封存于干净玻片上，在荧光显微镜下观察。

3.结果判定

⑴阳性结果：细菌表面的菌毛可见特异性亮绿色荧光。

⑵阴性结果：无可见的特异性荧光出现。

附：主要试剂的配制

⑴0.1mol/L磷酸缓冲液（Ph7.4）贮存液：称取Na2HPO4·12H2O 28.94g，KH2PO4 2.61g，加蒸馏水至1000ml。应用时取上述贮存液100ml，加入NaCL 8.5g，加蒸馏水至1000ml，即为0.01mol/L PBS （Ph7.4）。

⑵缓冲甘油

Sol.I ：甘油（A.R.）9份+ PBS 1份。

Sol.II：称取甘氨酸0.42g，Na OH 0.021g，NaCL 0.51g，NaN3 0.03g，加蒸馏水至100ml。