双特异性抗体制备方法进展
双特异性抗体的制备流程
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在开始双特异性抗体的制备之前，有一系列的准备工作需要完成。
双抗体夹心法原理
双抗体夹心法原理双抗体夹心法，也称为双特异性抗体结合（bispecific antibody sandwich method），是一种生物医学研究和临床应用中常用的技术手段。
它利用双特异性抗体能够同时结合两个不同抗原的特性，实现对细胞表面的目标分子的高效识别和定位。
本文将介绍双抗体夹心法的原理及其应用。
一、双抗体夹心法的原理概述双抗体夹心法原理基于单克隆抗体的特异性识别和结合，利用两个不同的单克隆抗体分别与两个不同的抗原结合，形成一个夹心结构，从而实现对目标分子的高效定位。
双抗体夹心法相较于传统的单克隆抗体法具有更强的特异性和高效性。
二、双抗体夹心法的工作原理双抗体夹心法的工作原理可以概括为以下几个步骤：1.制备双特异性抗体：首先，需要根据目标分子的特性和结构，设计并合成具有双特异性的抗体（例如，IgG1/2抗体）。
这种抗体一般由两个单克隆抗体的结合部分构成，通过基因工程技术将两个单克隆抗体的DNA片段融合，形成一个新的融合抗体。
2.融合抗体的表达和纯化：将融合抗体的DNA片段导入到特定的表达宿主细胞中，通过培养和表达，使融合抗体得以表达出来。
随后，通过一系列的纯化步骤，如离心、层析、过滤等，得到纯化的融合抗体。
3.双抗体的结合与识别：将纯化的融合抗体与目标分子进行混合，并保持一定的时间，使融合抗体与目标分子发生特异性结合。
由于融合抗体具有两个抗原结合部分，可同时与两个不同的目标分子结合，从而形成一个夹心结构。
4.检测体系的建立：为了定量检测目标分子的存在量，需要建立相应的检测体系。
一般常见的检测体系有酶联免疫吸附测定法（ELISA）、放射性测定法（RIA）等。
通过这些检测方法，可以快速、准确地测定融合抗体与目标分子的结合情况。
三、双抗体夹心法的应用双抗体夹心法由于其高效性和特异性，在生物医学研究和临床应用中得到广泛的应用。
以下是一些常见的应用领域：1.肿瘤治疗：利用双抗体夹心法的特点，可以设计并合成具有双靶向功能的抗体药物，如具有同时识别肿瘤细胞和免疫细胞的抗体。
提高双特异性抗体生产和质量的策略
提⾼双特异性抗体⽣产和质量的策略2020-06-12 12:49：双特异性抗体可以同时靶向两种不同的抗原，其结构多样性的快速发展产⽣了⼤量新摘要摘要：颖的双特异性抗体⽀架，并提供了巨⼤的功能多样性。
⽬前医药研发中最常⽤的两种形式的双特异性抗体是基于单链可变⽚段（ scFv ）的抗体（⽆Fc⽚段）和全长IgG样不对称抗体。
与传统的单克隆抗体不同，双特异性抗体的数量，质量和稳定性等都阻碍了其更⼴泛的临床应⽤。
其在设计，⽣产和质量⽅⾯的最新类型，描述了其在研设计，⽣产和质量⽅⾯的最新研这两种主要的双特异性抗体抗体类型，描述了本⽂基于本⽂基于这两种主要的双特异性和性能提升的策略。
究进展进展和性能提升的策略1.抗体概述1.1抗体的肿瘤治疗机理：通过靶向在肿瘤细胞上过度表达或独特表达的表⾯抗原，单克隆抗体已成功⽤作癌症治机理疗剂。
基于抗体的癌症免疫疗法的功效主要涉及以下两个因素：（ 1 ）阻断或结合因⼦激活的细胞死亡，或通过抑制癌症细胞信号通路的激活以导致肿瘤细胞死亡。
例如，曲妥珠单抗靶向乳腺癌和胃癌细胞中的 HER2 受体，以抑制其增殖和存活，西妥昔单抗抑制结肠直肠癌和肺癌中的表⽪⽣长因⼦受体（ EGFR ）;（2）通过免疫细胞上的Fc受体（FcR）与抗体的Fc⽚段结合产⽣的免疫效应⼦功能诱导肿瘤靶细胞死亡，如F ig .1b 所⽰的抗体依赖性细胞毒性（ADCC ），补体依赖性细胞毒性（CDC）和抗体依赖性细胞吞噬作⽤（ADCP）。
缺陷：传统抗体治疗的⼀个主要缺点是肿瘤的渗透率和保留率低。
许多针对肿瘤特异性抗原的缺陷治疗性 mAb ⼤多保留在⾎液循环中，通常只有 20 %的给药剂量与实体瘤的表⾯蛋⽩相互作⽤。
此外，⼤多数 mAb 起到阻⽌⽣长因⼦与其受体结合的作⽤，但是通常由于患者的免疫应答不⾜（尤其是重新激活 T 细胞以破坏肿瘤）⽽⽆法诱导肿瘤的凋亡。
1.2基本结构双特异性抗体：双特异性抗体可以同时靶向两种不同的抗原，例如同时结合肿瘤细胞受体和募双特异性抗体集细胞毒性免疫细胞。
双特异性抗体发展历程、开发进展及市场规模分析
Genentech, Roche, Chugai Regeneron Roche Genmab
IGM Biosciences Xencor
CD3
CD20
CD3
CD20
CD3
CD20
CD3
CD20
CD3
CD20
CD3
CD20
是
Phase III 尚未招募
双抗发展历史、趋势和开发进展
1
双抗发展历史
2
全球药企积极布局双抗，在研项目数量逐年增长
• 近十年来，全球每年新开的双抗临床试验数量逐年增加，目前正处于双抗药物研发的快速发展阶段。不完全统计，目前全球131个双抗 药物处于国际多中心临床阶段。
• 从适应症来看，目前处于临床阶段的药物，88%布局肿瘤领域，其中实体肿瘤占比59%，血液瘤占比29%；其次是自体免疫疾病，占比8%； 从靶向的细胞类型上来看，细胞毒性效应细胞重定向抗体占比过半数（详见后面双抗目录）；从是否有Fc段来看，78%是有Fc段的双抗。
靶点1
CD3 CD3 CD3 CD3 CD3 CD3
靶点2 是否含Fc段 临床进展 状态
BCMA BCMA BCMA BCMA BCMA BCMA
是
Phase II 招募中
是
Phase I/II 招募中
否
Phase I 招募完成
是
Phase I 招募中
是
Phase I 招募中
是
Phase I 招募中
是
Phase I 招募中 CD123阳性血液瘤 NCT02730312
肿瘤靶向免疫调节抗体
产品
双特异性抗体的研制方法及其在奶牛乳腺炎治疗中的应用
．
． ．
特 异性 抗 体 的 产 量 和 质 量 。 目前 已有 一 些 Ｂ 一些 采 用 化学 偶 联 制 ｓ
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异性抗体 最 为 常见 。抗 中性 粒 细胞／ 黄 色 度较差 金
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临ｔ 中 ｃ３ 竺 ： 其 以 Ｄ／兰进 ｂ阶 床 ） ｚ 试 ￣ ￣ ， 抗
关键词 ： 双特异 性抗 体 ； 临床应 用 ； 奶牛 乳腺 炎
双 特异 抗 体 （ ｉ ｅｉｃａ ｔ ｏ ｙ Ｂ Ａｂ ￣ ｂｓ ｃ ｉ ｎｉ ｄ ， ｓ ） ｐ ｆ ｂ
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两种 不 同的抗 原结 合 ， 具 有 不 同的 结 合 活 性 而 发 将 完整 的抗 体分 子或 其功 能性 片段 Ｆ ｂ在 体外 通过 即 ａ
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即双 特 异 基 因 工 程 抗 体 。 目
葡 萄球 茵的 试验 结果 表 明 ， 双特 异 性 抗体 对 们去研制新型 ＢＡ ｂ
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中性粒细胞 体外抗金 黄 色葡 萄球 茵具 有 明显 前 抗 肿瘤 的双特异 基 因工 程抗 体 已经有 多种 类 型 ， 的导 向作 用 ， 对 中性 粒 细胞 的免 疫功 能具 主要有 ＢＩＧ Ｆ（ ｂ 。 体 片 段 、 ｉｂ ｄ 且 ｓ ｇ ａ）抗 ｄａ ｏ ｙ和 ｒｉ一 ｎｎ 有诱导性 。
半抗体组装成双特异抗体的方法
半抗体组装成双特异抗体的方法引言：抗体是免疫系统中一类重要的蛋白质分子，能够识别并结合特定的抗原分子，发挥抗原的清除和免疫调节等功能。
近年来，研究人员发展出一种新型的抗体工程技术，即利用半抗体组装的方法制备双特异抗体。
本文将介绍半抗体组装成双特异抗体的原理、方法和应用。
一、半抗体的定义和特点半抗体是指由两个不同的单克隆抗体的抗原结合部分组装而成的抗体分子。
与传统的完整抗体相比，半抗体具有以下特点：1. 半抗体只包含一个单克隆抗体的重链和轻链，抗原结合部分与该单克隆抗体相同；2. 半抗体的另一端没有抗原结合部分，因此无法与抗原结合，具有较低的亲和力和稳定性；3. 半抗体具有较小的分子量，能够更好地渗透到组织和细胞内，增强药物的作用效果。
二、半抗体组装成双特异抗体的原理半抗体组装成双特异抗体的原理是通过连接剂将两个不同的半抗体分子连接在一起，形成具有双特异性的抗体分子。
连接剂通常为某种化学物质或蛋白质，能够特异性地结合两个半抗体的非抗原结合部分，将它们连接在一起。
三、半抗体组装成双特异抗体的方法1. 化学交联法：化学交联法是将两个半抗体分子通过化学交联剂连接在一起。
常用的化学交联剂有二硫化物、双酐和双醛等。
通过调整交联剂的浓度和反应条件，可以实现两个半抗体的特异性连接，并形成双特异抗体。
2. 酶法：酶法是将两个半抗体通过酶的催化作用连接在一起。
常用的酶有酶标记的辣根过氧化物酶（HRP）、碱性磷酸酶（AP）等。
通过将酶标记的半抗体与另一种酶标记的半抗体反应，可以实现双特异抗体的组装。
3. 基因工程法：基因工程法是利用重组DNA技术将两个半抗体的基因合成在一起，通过表达和分泌形成双特异抗体。
该方法通常需要构建特定的表达载体，并在适当的宿主细胞中进行表达和分泌。
四、半抗体组装成双特异抗体的应用半抗体组装成双特异抗体在生物医学研究和临床应用中具有广泛的应用前景，主要包括以下几个方面：1. 免疫治疗：双特异抗体可以同时结合两个不同的抗原，增强免疫细胞的识别和杀伤能力，提高免疫治疗的效果。
半抗体组装成双特异抗体的方法
半抗体组装成双特异抗体的方法引言：双特异抗体是一种具有高度特异性和亲和力的抗体，可以同时结合两种不同的抗原。
为了生产双特异抗体，一种常用的方法是将两种特异性单克隆抗体（mAb）通过半抗体组装成双特异抗体。
本文将介绍半抗体组装成双特异抗体的方法及其应用。
一、什么是半抗体？半抗体是指在动物体内或体外制备的单克隆抗体的重链与轻链进行非共价连接的一种抗体形式。
由于半抗体只包含一种单克隆抗体的重链和轻链，因此它只具有一种特异性。
半抗体在体内半衰期较短，不容易引起免疫反应，可以用作特异性的载体。
二、半抗体组装成双特异抗体的方法1. 选择合适的单克隆抗体：首先需要选择两种具有不同特异性的单克隆抗体作为组装双特异抗体的材料。
这两种单克隆抗体可以分别来自不同物种，或者来自同一物种但结合不同抗原位点。
2. 酶处理：将两种单克隆抗体的Fc区域通过酶处理，如胰蛋白酶、Pepsin等，使其与Fc区域断裂，得到Fab'2片段。
这样Fab'2片段就失去了Fc区域的功能，但仍保留了抗原结合位点。
3. 互补决定区（CDR）重组：将两种Fab'2片段的互补决定区（CDR）进行互换，使得两种抗体的互补决定区与目标抗原结合的特异性发生变化。
这样就可以得到两种具有不同特异性的Fab'2片段。
4. 半抗体组装：将经过互补决定区重组的Fab'2片段进行混合，使其通过重链-轻链非共价连接，形成半抗体。
半抗体由于只含有一种重链和一种轻链，具有一种特异性。
组装时需要注意两种Fab'2片段的比例和连接方式，以确保半抗体的稳定性和活性。
5. 双特异抗体组装：最后，将两种不同的半抗体进行合并，使其通过重链-重链非共价连接，形成双特异抗体。
双特异抗体具有两种不同的特异性，可以同时结合两种不同的抗原。
三、半抗体组装成双特异抗体的应用半抗体组装成双特异抗体的方法在生物医学研究和临床治疗中有着广泛的应用。
以下是一些典型的应用案例：1. 免疫疗法：双特异抗体可以结合两种不同的肿瘤抗原，将肿瘤细胞与免疫效应细胞（如T细胞）连接起来，增强免疫细胞对肿瘤细胞的杀伤作用，从而提高抗肿瘤治疗效果。
双特异性抗体的制备流程
双特异性抗体的制备流程《双特异性抗体的制备流程，就像一场奇妙冒险！》嘿，各位小伙伴们！今天咱来聊聊双特异性抗体的制备流程，那可真是一场充满挑战和惊喜的奇妙冒险啊！咱就先从“原材料”开始说起吧。
这就好比是做饭，得先有好材料，才能做出美味佳肴。
为了制备这厉害的双特异性抗体，咱得精心挑选各种细胞、抗体片段啥的，这可不能马虎，要像挑食材一样精挑细选！万一挑到个“歪瓜裂枣”，那可就麻烦啦。
选好材料后，那就是“加工环节”啦！这就好像雕刻艺术品，得小心翼翼、精雕细琢。
要把那些细胞啊、片段啊，一点点地拼接起来，组合成我们想要的样子。
这个过程可不简单，得有一双稳定的手和一颗专注的心。
要是手抖一下，说不定就前功尽弃喽，这可不能像我平时做饭撒盐那样随手一抖呀！接下来就是“调试”啦！这就跟调整音响的音质似的，得让双特异性抗体发挥出最佳效果。
得看看它结合各种靶点的能力够不够强，效果好不好。
要是不行，还得回去重新调整那些“小零件”，这可真是个考验耐心的活儿。
等一切都弄好了，那就是见证奇迹的时刻啦！就好像动画片里英雄出场一样，闪闪发光。
看着自己亲手制备的双特异性抗体，那感觉，可别提多有成就感啦！不过呢，这制备流程可不是一帆风顺的哦！有时候会碰上各种各样的问题，就像是游戏里的关卡一样，得一个个去攻克。
可能会发现某个环节没做好，得重新开始；也可能会遇到一些意想不到的难题，得绞尽脑汁地想办法解决。
但是，别怕呀！这就是科研的魅力嘛，充满了未知和挑战。
就像打游戏升级一样，虽然过程中困难重重，但每攻克一个难题，就感觉自己又厉害了一点。
总之呢，双特异性抗体的制备流程，那真是一场既精彩又刺激的冒险。
虽然有麻烦，但也有无尽的乐趣和成就感。
大家一起加油，去探索这个神奇的领域吧！愿我们都能在这场冒险中取得圆满成功，做出超级厉害的双特异性抗体来造福人类哟！哈哈！。
双抗体夹心法原理
双抗体夹心法原理双抗体夹心法（bispecific antibody sandwich assay）是一种常用的生物医学实验技术，用于检测特定蛋白质或生物分子的存在及其数量。
该方法利用两种不同的抗体，通过特异性结合目标物质，形成夹心的结构，从而实现高灵敏度和高特异性的检测。
双抗体夹心法的原理可以概括为以下几个步骤：第一步：制备特异性抗体在进行双抗体夹心法之前，需要制备两种特异性抗体，分别与待检测蛋白质或生物分子的不同表位结合。
这些特异性抗体可由动物免疫产生，或通过基因工程技术制备。
第二步：夹心结构形成首先，在待测样品中加入第一种特异性抗体（抗体A），该抗体与待测物质的一特定表位结合。
抗体A与待测物质结合后形成一个抗原-抗体复合物。
在复合物形成后，加入第二种特异性抗体（抗体B），该抗体与待测物质的另一特定表位结合。
抗体B的结构可使其同时与抗体A和待测物质结合，形成一个夹心式的结构。
这个夹心结构增大了检测的特异性和敏感性。
第三步：信号产生为了检测夹心结构的形成，一般会在其中一种特异性抗体上标记一种信号物。
例如，可以在抗体A上标记荧光染料，当夹心结构形成时，荧光信号会发出。
通过检测信号的发出情况，可以确定待测样品中待检测蛋白质或生物分子的存在与否。
如果夹心结构形成，信号就会发出；如果夹心结构未形成，信号则不会发出。
第四步：结果分析最后，通过定量或定性分析信号的强度，可以确定待测样品中目标物质的浓度或存在情况。
一般来说，信号强度与待测物质的浓度呈正相关关系。
双抗体夹心法的优势在于其高特异性和高灵敏度。
由于夹心结构只能形成在特定目标物质存在时，可以降低假阳性结果的发生。
同时，夹心结构的形成也增加了检测信号的产生，提高了检测的灵敏度。
除了在生物医学研究中应用广泛外，双抗体夹心法还可以在临床诊断中应用。
例如，可以用于检测肿瘤标志物、病原体感染和免疫相关疾病等。
双抗体夹心法在生物医学领域具有重要的应用前景，有助于更准确地进行疾病诊断和治疗。
双抗分装实验报告
一、实验目的1. 掌握双抗（双特异性抗体）的制备方法。
2. 学习双抗分装的操作步骤和注意事项。
3. 提高实验操作的准确性和规范性。
二、实验原理双抗是一种新型的生物制剂，由两个特异性抗体通过特定连接方式构建而成，具有双重靶向作用。
本实验采用化学交联法，将两种特异性抗体连接起来，制备双抗。
分装是将制备好的双抗按照一定规格进行定量包装，以方便储存和使用。
三、实验材料1. 抗体A：100mg2. 抗体B：100mg3. 交联剂：EDC (1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐)：10mg4. 氨水：1ml5. 生理盐水：1L6. 分装瓶：100ml×107. 移液器：1ml、10ml、100ml8. 烧杯：500ml9. 离心机：低速离心机10. 超净工作台四、实验步骤1. 准备工作（1）将抗体A和抗体B分别溶解于生理盐水中，配制成浓度为1mg/ml的溶液。
（2）称取EDC，用氨水溶解，配制成1mg/ml的EDC溶液。
2. 交联反应（1）取抗体A和抗体B溶液各10ml，分别置于两个烧杯中。
（2）向抗体A溶液中加入EDC溶液，室温下反应30分钟。
（3）向抗体B溶液中加入EDC溶液，室温下反应30分钟。
（4）将反应后的抗体A和抗体B溶液混合，室温下反应2小时。
3. 分装（1）将混合好的双抗溶液用离心机低速离心10分钟，去除未反应的EDC和交联剂。
（2）用移液器将离心后的双抗溶液分装到100ml分装瓶中，每瓶10ml。
（3）封口，标记瓶号、日期和浓度。
五、实验结果本实验成功制备了双抗，分装过程顺利进行。
通过检测，双抗的浓度和纯度符合要求。
六、实验讨论1. 在本实验中，EDC作为交联剂，能够有效地将抗体A和抗体B连接起来，形成双抗。
2. 实验过程中，严格控制反应时间和温度，有利于提高双抗的制备效率。
3. 分装过程中，采用低速离心去除未反应的EDC和交联剂，有利于提高双抗的纯度。
4. 本实验操作过程中，严格遵守实验规程，确保实验结果的准确性。
双特异性抗体治疗恶性肿瘤的研究进展
织 能力 差 ， 以及 存 在 与人 类 免 疫 效 应 细 胞 功 能 的不 相 容性 等 缺点 ， 限制 其 临 床 使 用 。分 子 工 程 方 法 可 通 过
改变 抗 体 的 大 小 和 亲 和 性 来 克 服 上 述 问题 。 鼠 源 性 Ｍａ ｂ人 源化 ， 鼠源 的 Ｍａ 即 ｂ的可 变 区和 人类 ＩＧ抗 体 ｇ 恒 定 区结 合 可提 高 效 应 细 胞 功 能 和减 少 ＨＡＭＡ 反 应 的 发生 。 或将 抗 体 中形 成抗 原 结合 部 位 的 ６个 高变 区 （ Ｄ 移植 人 人 的框 架 中 ， 生 Ｃ Ｃ Ｒ） 产 ＤＲ嵌 合或 人 源化 的
维普资讯
・
１８・ ７
国外 医学 肿 瘤学 分 册
２０ ０ ２年 ６月 第 ２ ９卷
第 ３期
双 特 异性 抗体 治 疗 恶 性 肿 瘤 的 研 究进 展
张辛 燕 ， 学人 民医院 妇 科肿 瘤 中心 ， 京 １ ０ ４ ） 北 北 ０ ０ ４
应， 是一种很 有潜力 的恶性 肿瘤免 疫治疗方式 。本文对双特异性 抗体 的构建方 法 、 用机制及其相 关研 究加 以概述 。 作
关 键 词 ： 特 异 性 抗 体 ； 疫 治 疗 ； 瘤 双 免 肿
中图分类号 ： ７ ０ ５ Ｒ ３ ．１
文献标识 码 ： Ａ
一种能联合免疫细胞增强肿瘤杀伤能力的双特异性抗体及其制备方法
专利名称：一种能联合免疫细胞增强肿瘤杀伤能力的双特异性抗体及其制备方法和应用
专利类型：发明专利
发明人：于浩洋,李正成,苏静
申请号：CN202010918971.X
申请日：20160414
公开号：CN112430270A
公开日：
20210302
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：本发明提供了一种能联合免疫细胞增强肿瘤靶向杀伤能力的双特异性抗体及其制备方法和应用。
通过采用化学方法连接抗体和可降解的纳米颗粒，一个纳米颗粒上同时连接两种或两种以上多个抗体分子，其中一种抗体能够特异结合免疫细胞，另一种或几种抗体可以特异结合肿瘤细胞，从而起到增强免疫细胞靶向特异杀伤肿瘤细胞的效果。
申请人：本康生物制药(深圳)有限公司
地址：518055 广东省深圳市南山区桃源街道田寮工业A区9栋二楼东面
国籍：CN
代理机构：中国专利代理(香港)有限公司
代理人：彭昶
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背景
5
双特异性抗体的优势
• 改变特异性免疫应答细胞的方向到癌细胞，增强癌细 胞杀伤能力
• 通过和两个不同的细胞表面抗原结合，有效增强癌细 胞靶向性
• 降低治疗费用 • 同时阻断两个不同的通路
背景
6
开发进展
30年前
Medarex 公 司 开 发 出 双 特 异 性 抗 体 ， 并 在 2001年进行三期临床试验
2009年
Trion公司研发的Catumaxomab被欧盟批准上 市用于治疗Ep CAM阳性肿瘤所引起的恶性腹水
2014年
安进公司研发的Blinatumomab获得FDA 的批 准，用于治疗费城染色体阴性的复发性或难治性 B细胞急性淋巴细胞白血病
背景
7
2 化学交联 0
PART ONE
化学交联
9
重新形成二硫键 不同半抗体结合
优点：可大规模生产（1500L）
PART ONE
03 杂交瘤细胞技术
杂交瘤细胞技术
12
Quadroma technology 杂交瘤细胞技术
制备方法： 融合两个分别表达不同抗体的杂交瘤细胞，两株异源抗
体轻重链随机装配，形成混合双功能抗体。
重链的正确装配：
CH3区小氨基酸 突变为大氨基酸
双特异性抗体制备方法进展
指导老师：张革副教授 小组成员：温婷、张杨玲、崔影彤、杨杰琪
目 录
CONTENT
01 | 背景 02 | 化学交联 03 | 杂交瘤细胞技术 04 | 基因工程制备 05 | 总结与展望 06 | 参考文献
背景
PART ONE
0
1
背景
4
双特异性抗体：
含有2种特异性抗原结合位点的人工抗体，能在 靶细胞和功能分子(细胞)之间架起桥梁，激发具有导 向性的免疫反应。
凸出的杵
CH3区大氨基酸 突变为小氨基酸
凹陷的臼
杂交瘤细胞技术
13
优点：保留了Fc段的生物学功能 缺点：轻链也会随机装配，这是我们不想要的
避免轻链的随机装配的方法 • 两类抗体使用序列相同的轻链，这种轻链可
以和两类抗原结合 • 双细胞系分别表达半抗体 • 结合crossmab技术（把重链CH1区和轻链
除了化学交联、杂交瘤细胞技术、基因工程之外， 还可以利用分子克隆技术、抗体工程等，对双特异性 抗体的选择性进行改造，提高生物活性和临床疗效。
PART ONE
06 部分参考文献
部分参考文献
26
[1]Zhang X, Yang Y, Fan D, Xiong D. Bispecific antibodies and their applications. Exp Hematol Oncol. 2017;6:12.
基因工程制备
17
Ig-G样形式（含Fc段单克隆抗体的可变区
和接头均可被克隆和连接。 优势：
抗体尺寸更小 具有更好的肿瘤组织渗透性
基因工程制备
19
非Ig-G样形式——串联scFv
通过额外的肽接头如甘氨酸-丝 氨酸重复基序连接的两scFv片段
最常用的结构域顺序： VLA-linker1-VHA-linker2-VHB-linker3-VLB • 接头1和接头3的长度决定了scFv的聚合情况 • 接头2决定了两个scFv之间的运动灵活性
（VL和VH衍生自单链抗体片段; A和B代表亲本单克隆抗 体A和B）
基因工程制备
20
非Ig-G样形式——Blinatumonmab
• 已上市，最着名的双特异性T细胞衔接器（BiTEs）之一 • 在大肠杆菌中不易表达，但在哺乳动物细胞中表达良好 • 靶点：CD3+CD19
• 两个较长的接头被置于轻链和重链之 间，短接头以串联形式桥接两个scFv
• AFM13（进入Ⅱ期临床试验）
基因工程制备
22
半衰期延长策略
• 多聚化 • 与PEG链共轭连接（PEG化） • 与人血清白蛋白（HSA）融合 • 与Fc片段融合
PART ONE
05 结论与展望
结论与展望
24
双特异性抗体的发展仍面临着许多问题 • 稳定性低 • 低表达率 • 免疫原性 • 生物利用度低 • ……
• 短链接头阻止VL和VH结构域的链内而 非链间配对，长接头允许抗原结合位 点自由旋转
基因工程制备
21
四价串联双抗体（Tand-Abs）
• 含有连接在单个多肽链中的两对VL和VH结构域 • 在表达时，两种多肽产物以头对尾的方式二聚化，
形成具有大分子量（〜105kDa）的同源二聚体
药物
• AFM11是一种靶向CD19和CD3的四价双特异性 TandAb，其在小鼠静脉内给药后的半衰期为18.4至 22.9小时（Ⅰ期临床试验中）
PART ONE
04 基因工程制备
基因工程制备
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Genetic engineering of BsAbs 基因工程制备双特异性抗体
利用分子克隆技术，可将一个抗体的部分/全部 恒定区用于构建双特异性抗体。
Ig-G样形式：指BsAbs中含有Fc段（保留了Fc介 导的效应器功能）
非Ig-G样形式：不含Fc段
[2]Kontermann RE, Brinkmann U. Bispecifc antibodies. Drug Discov Today. 2015;20:838–47.
[3]Chames P, Baty D. Bispecifc antibodies for cancer therapy: the light at the end of the tunnel? mAbs. 2009;1:6,539–47.
CL区交换）和knobs-into-holes技术 • 在VH-VL和CH1-CL的内表面引入新的突变
杂交瘤细胞技术
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主要药物 ➢ Catumaxomab
• 第一个上市的双功能抗体（2009） • 靶标：CD3+EpCAM • 适应症：恶性腹水 ➢ FBTA05：CD3+CD20，临床1-2期 ➢ Ertumaxomab：CD3+Her2，临床2期
Chemical cross-linking（化学交联）
制备方法： 分别连接交联剂
脱盐
混合，化学结合 缺点：纯化困难、稳定性差、活性降低
化学交联
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Controlled Fab-arm exchange (cFAE) 可控制的Fab臂交换技术
制备方法： 制备CH3突变的母抗体
铰链区链间二硫键 还原制备半抗体