乳铁蛋白的研究进展

乳铁蛋白的研究进展摘要：乳铁蛋白是一种具有多种生理功能的铁结合糖蛋白，是当今乳品界和食品界最为关注的“热点”之一。

本文综述了乳铁蛋白的基本结构、理化性质、生理功能、制备方法及应用前景。

关键词：结构、理化性质、生理功能、制备、应用乳铁蛋白是一种主要存在于大多数哺乳动物乳汁中的铁结合糖蛋白[1]，属于转铁蛋白家族[2]。

1960年首先由Groves从牛乳当中分离获得，因与铁结合呈红色，故又被称为“红蛋白”[3]。

大量研究表明LF具有促进铁吸收、广谱抗菌、增强免疫、抗病毒、抗癌等生物学功能；还具有DNA酶、RNA酶、低聚寡糖水解酶、ATP酶以及磷酸酯酶等多种酶的活性。

LF 多种功能的发现，使其研究非常活跃，已成为食品界和乳品行业关心的热点问题。

1 乳铁蛋白的基本结构乳铁蛋白由转铁蛋白演变而来。

转铁蛋白包括一大族生物糖蛋白(主要有3种) ，即：血清转铁蛋白，存在于血清和其它胞外液(如乳、脊髓液、精液)中；乳铁蛋白存在于乳汁、泪液、唾液、汗液等分泌液中; 卵转铁蛋白存在于爬行类动物和鸟类的蛋清中。

乳铁蛋白是一种铁结合性糖蛋白, 它的分子主体是一个大约有700个氨基酸残基构成的多肽链,相对分子量约为80 ku。

该多肽链可以折叠成两个球状叶,一端是氨基末端叶,一端是羧基末端叶,每一叶状结构都含有一个Fe3+和一个碳酸氢阴离子结构部位,每一叶都能高亲和性地可逆的与铁结合。

其中, Fe3+结构位于一个很深的裂缝中,当铁离子缺乏时,每一片叶片可以曲折, 使裂缝打开或关闭, 但当多肽链已同铁离子结合时则裂缝处于闭锁状态[4] 。

2 乳铁蛋白的理化性质2.1 乳铁蛋白的糖基化反应乳铁蛋白中糖基成分约占7%~11.5%, 天冬酰胺残基可与糖基相连, 由唾液酸与果糖、甘露糖、岩藻糖、半乳糖形成聚—N一乙酰乳糖胺多糖与之相连, 脱去糖基并不影响乳铁蛋白与受体的结合[5]。

牛乳铁蛋白的N133,281,368,476,545位点可以进行糖基化反应, 人乳铁蛋白有2个糖基化位点。

这些糖化位点都具有异质性, 是由唾液酸的成分及与之相连的糖链大小所引起的。

乳铁蛋白中糖链的作用尚不十分明确, 可能与乳铁蛋白的功能活性、构象稳定性有关, 也可能与免疫原性、微生物结合识别位点有关, 或是与细胞膜上接触信号有关。

2.2乳铁蛋白的配基作用乳铁蛋白可与多种小分子及生物大分子结合, 如苔盼蓝、免疫球蛋白、血清蛋白、DNA, LPS,琼脂(糖)、两性电解质、肝素等。

辛糖是其结合的最小糖基。

肝素结合位点为BXBB,BXXBBXB,BBXB或BBBXXB,B代表碱性氨基酸残基。

有人提出乳铁蛋白与DNA的结合是在严格的条件下发生的,具有高度的专一性,并激活了结合部位基因的转录[6]。

2.3 乳铁蛋白受体小鼠、猪小肠绒毛刷状缘中发现了与乳铁蛋白结合的受体蛋白, 其他生物及不同类型的细胞膜表面也存在这种受体位点。

人乳铁蛋白N端部分(3 281氨基酸残基)的CFQWQRN- MRKVRGPPVSC (20- 37氨基酸残基)或KRDS (39- 42氨基酸残基)能被识别, 并具有抑制凝集的作用。

在肝细胞中依赖钙离子而结合受体的决定因素是乳铁蛋白的C端被暴露出来, 大量革兰氏阳性菌细胞膜表面都有专一性的乳铁蛋白受体, 生物化学和遗传学分析证明与乳铁蛋白结合的是两种蛋白LbpA和LbpBo, 与DNA的结合是在严格的条件下发生的, 具有高度专一性, 并激活了结合部位基因的转录。

3 乳铁蛋白的生理功能3.1 抑菌作用乳铁蛋白属于广谱抑菌剂,既抑制需铁的革兰氏阴性菌(如大肠菌群、沙门氏菌和志贺氏菌等) , 也抑制革兰氏阳性菌, 如金黄色葡萄球菌、杆菌和单细胞李斯特菌; 但对铁需求不高的微生物( 如乳酸菌) , 则基本不抑制。

另外, 乳铁蛋白对链球菌的变异菌株和霍乱弧菌等有直接的致死效果,这种作用与铁无关[7]。

乳铁蛋白的抑菌效果取决于微生物对铁的需求程度、外源铁的生物利用率、乳铁蛋白的饱和度、盐类、pH 值、抗体或其他免疫物质、介质等因素。

乳铁蛋白抑菌作用的机制主要有以下3 点。

( 1) 乳铁蛋白夺去了微生物生长所需的铁,使后者因失铁而停止生长甚至死亡; ( 2) 乳铁蛋白通过氨基末端强阳离子结合区域, 增加细菌细胞膜的通透性, 使细菌的脂多糖从外膜渗出, 达到直接杀菌的作用; ( 3) 乳铁蛋白通过水解得到的抗菌肽来实现抗菌作用。

3.2抗病毒乳铁蛋白在宿主体内对抵抗病毒有很大作用, 可以抑制人体免疫缺陷性病毒( HIV)、细胞巨化病毒、疱疹病毒1和2型、丙型肝炎病毒( HCV)、流感病毒等。

关于乳铁蛋白抑制病毒的机制不是很清楚, 可能是其能与病毒结合或与宿主细胞结合, 从而阻断病毒与宿主细胞的结合。

乳铁蛋白可以抑制流感病毒的活性主要是因为其碳水化合物残基上含涎酸,它干扰病毒对靶细胞的结合和侵染[8]。

另外有证据表明乳铁蛋白可以抑制、杀死多种真菌。

3.3 调节免疫乳铁蛋白具有调节巨噬细胞活性和刺激淋巴细胞合成的能力; 而且嗜中性粒细胞是含乳铁蛋白最多的细胞, 当机体受感染时就可将乳铁蛋白释放出来,释放出的乳铁蛋白夺取致病菌的铁离子致使后者死亡。

机体感染时会产生6~ 20 倍以上的乳铁蛋白参与抗菌过程。

乳铁蛋白还具有促进中性白细胞对受伤部分的吸附和聚集、增加粒细胞粘性、促进细胞间相互作用、调节免疫球蛋白分泌、参与调节机体免疫耐受能力、抑制补体系统激活或激活已有的补体途径等功能。

另外,研究显示乳铁蛋白对抗体生成、T 细胞成熟、淋巴细胞中自然杀伤细胞比例都有调节作用。

3.4 促铁吸收乳铁蛋白通过它的氨基和羧基末端两个铁结合区域能高亲和性可逆地与铁结合, 并维持铁元素在一个较广的pH 范围内而完成铁在十二指肠细胞的吸收和利用。

KAWAKAM I证实, 给贫血的小鼠进食结合了铁的乳铁蛋白和普通硫酸亚铁,为了达到同样治疗效果,后者的摄入量需是前者的4倍。

实验发现,机体对铁的吸收有负反馈调节机制,当细胞缺铁时,细胞就会在其表面合成特异的铁受体,如血液中的转铁蛋白和肠道中的乳铁蛋白。

此外, 在摄入铁时若结合摄入乳铁蛋白则可明显减缓铁对肠道的刺激作用,一是因为乳铁蛋白螯合了铁, 避免了铁离子对肠道的直接刺激作用; 二是进食乳铁蛋白可以减少无机铁离子的摄入量。

3.5 促进肠道及肠道内双歧杆菌生长NICHOLS, BUFORD L 发现乳铁蛋白有促进婴儿肠道生长的特殊作用[9]。

在母乳喂养时, 初生婴儿在1~ 3 d 内肠道会突然变长,在动物中也发现这种情况。

如果喂普通的配方乳, 无论是初生婴儿或初生动物都不会发生肠道在几天内突然变长的现象。

当把配方乳中的乳铁蛋白加到母乳初乳的含量时,则和喂母乳的结果一样。

肠道短的婴儿会发生短肠综合症,伴随着很难处理的腹泻,添加乳铁蛋白的婴儿配方乳或乳铁蛋白的营养补充剂可解决这一问题。

另外,母乳喂养的婴儿较用配方奶粉喂养的婴儿体内的双歧杆菌和乳酸菌数要多, pH 值也较低,而且溶菌酶活性和有机酸含量都有所增加,这是乳铁蛋白与母乳其它因子共同作用的结果。

3.6 阻断自由基由于乳铁蛋白能与铁离子结合,从而抑制铁诱导的脂质过氧化过程所产生的硫代巴比妥酸和丙二醛的生成, 从而阻断氧自由基的生成。

牛乳铁蛋白能降解酵母中的转运RNA,具有核糖核酸酶的活性,且能抑制超氧离子的形成。

所有这些都可降低人体内自由基对动脉血管壁弹性蛋白的破坏, 达到预防和治疗动脉粥样硬化和冠心病的目的。

3.7 其他功能LF 除了具有以上功能，还具有调控细胞增长、促进DNA合成、抑制血小板凝集、抗血栓、抵抗肿瘤生长和转移等多种功能[10]。

4 乳铁蛋白的生产制备早在1938 年人们就发现牛乳中存在乳铁蛋白, 由于其具有一些特殊的生理活性功能, 1960 年MONTREUIL J 和JOHANSIN B 等从母乳乳汁中分离得到了乳铁蛋白。

此后人们用各种方法来分离制备乳铁蛋白,例如采用色谱法、超滤法、盐析法以及酸沉淀法等从人或牛乳中分离纯化乳铁蛋白。

郭本恒等也介绍了两大类分离乳铁蛋白的方法,即色谱法和超滤法[11]。

目前,随着分离精制技术不断完善, 已在工业规模上成功地从干酪乳清和脱脂乳中制备了纯度高达95%以上的乳铁蛋白; 其生产技术要点是组合使用膜技术和色谱分离技术。

( 1) 离子交换色谱法。

最早使用DEAE 纤维素阴离子交换树脂和磷酸纤维素交换色谱法分离出较纯的乳铁蛋白,其纯度为81%左右。

( 2) 超滤法。

超滤法操作简单, 费用低廉,易于形成工业化规模, 但纯度不如色谱法高。

对分离得到的乳铁蛋白可以通过SDS- PAGE、Native PAGE、HPLC 等方法分离纯化。

( 3) 亲和色谱法。

亲和色谱是一种新兴的分离技术, 通过该方法获得的产品纯度极高。

由于其操作简单, 分离效果好纯度高,且没有生物活性损失, 是生产医药用高纯度乳铁蛋白最有效的方法之一。

通过以上方法得到的乳铁蛋白,原料来源有限且含量低,分离纯化操作复杂, 价格昂贵。

近年来, 人们开始利用生物技术来重组乳铁蛋白。

例如KRIMPENFORT( 1993) 将人乳铁蛋白cDNA 导入奶牛,在牛乳中含有人乳铁蛋白。

在日本新开发出一种基因重组番茄品种“秋玉”，其果实、叶、根均能生成乳铁蛋白,每100 g果实就含有 2. 5~ 3. 3 mg 的乳铁蛋白。

在国内, 李树芹等通过PCR 扩增人乳铁蛋白基因, 重组后导入大肠杆菌中并得到了高效融合表达, 获得了特异表达的乳铁蛋白[ 12]。

曹阳等通过克隆人乳铁蛋白cDNA 序列,构建乳铁蛋白的基因表达载体并导入小鼠细胞中, 经激素诱导表达出具有抗菌活性并结合铁离子的重组乳铁蛋白[ 13]。

5 乳铁蛋白的应用前景作为一种高效补铁组分, Lf 可用作食品添加剂, 以改变婴幼儿及孕妇普遍缺铁的现状, 也可制成含铁饮料或补铁胶囊, 用来提高造血功能, 改善贫血。

在食品或乳制品( 如婴幼儿奶粉) 甚至口香糖中, 添加Lf 可调节免疫功能。

国外在乳制品中补充益生菌和Lf, 制成片剂或速溶饮料, 作为运动员的营养品。

把Lf 添加到碳酸饮料、焙烤食品中既具营养价值,又可增进消化功能。

在肉食生产中, 可利用Lf抑制产品表面因人手接触等原因而滋生的有害细菌。

在玉米油乳化体系及卵磷脂脂质体系中Lf 具有抗氧化功能。

实验证明, Lf 可改进大豆油粉末的保质期。

Lf 具有抑菌、灭菌的活性,国外已将其添加到乳品、婴幼儿食品、大豆蛋白制品、肉品中, 以控制大肠杆菌、肠炎沙门氏菌等病原微生物, 同时可以期待用它开发出一种安全有效的天然防腐剂。

总之, Lf 因其具有多种生理活性功能,在乳品、食品、生化、医药、化妆品等领域已得到广泛应用, 其开发前景不可限量。

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