转基因植物PPT课件

利用培养的植物细胞生产次生物质
植物细胞不仅具有形态建成的全能性，还具有 物质代谢的全能性，通过药用植物细胞或组织 的大量培养，可以获得某些有用成分，特别是 用化学手段合成困难的药物。目前通过组织培 养成细胞培养的药用成分有生物碱，甙类、甾 醇，萜稀类、醌类、木质素类、黄酮类、糖类、 蛋白类、有机酸类、芳香油、酚类等上百种。 培养物中药用成分产量超过1%干重的药用植物 已有几十种之多。
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3.4 提高次代谢产物产量的方式
3.4.1 选育高产稳定细胞株 在药用植物组织培养中，细胞株 不移稳定，有效成分含量在继代中会逐渐降低，此外许多药用 成分含量太少，不利于工业化生产。因此，首先要建立快速检 测产物含量的检测系统，检测一个个细胞团，从中找出高产细 胞株，将高产量的细胞株继续培养，从中再找出更高产量和更 稳定的细胞株，如此反复筛选，最终选育出高产稳定细胞株。 还有一个常用的方法是使植物细胞发生突变。由于突变有可能 造成某些和次生代谢有关的基因缺失，如某一抑制基因缺失， 从而解除了对代谢过程的抑制，使产物量大大增加；或某一些 代谢基因的缺失造成某种中间产物的积累。常用的使细胞发生 突变的方法包括用紫外线、γ-射线及X-射线的照射，或用化学 诱变剂，如5-溴尿嘧啶，甲基磺酸乙酯等。
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上述培养出来的细胞悬浮液是异源的，为了进一步得 到均一的无性细胞，可以在这种悬浮培养基的基础上， 当细胞分散程度和迅速生长达到一定阶段后，利用平 板培养技术进行细胞无性系分离。即细胞悬浮液通常 通过双层不锈钢网或尼龙网的除去细胞聚集体，将滤 过的细胞液与选定的琼脂培养基在35℃左右下混合， 浇到培养皿上使其形成一薄层，当琼脂冷却凝固后， 细胞就全比较均匀地分布并固定在琼脂培养基中。此 方法也称单细胞培养。在做平板培养基时一个关键的 问题是细胞密度，103/ml为宜。
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3.1培养基的选择
对细胞培养来说不同的培养基往往使细 胞产率和所需的次生产物的产率都不同。 例如，用不同的培养基长春花细胞悬浮 培养物，在细胞产率和蛇根碱的产率上 场产生不同的结果，且适合于细胞生长 的培养基不一定有利于次生物的生产。 另外，降低培养基的成本也是研究的重
b 固定化培养 将悬浮培养的植物细胞包埋于固体基 质中，成为一个固定的生物反映系统。包埋的基质： 多糖和多聚化合物，如褐藻酸盐、琼脂（糖）、聚丙 烯酰胺、角叉莱胶。由于这些支持物胶体本身的交联 方式，使之对养料、水分及气体有一定的通透性，在 不同程度上维持细胞的生物活力，从而得证进行生化 反映的酶系和辅助因子的存在。基于此原理，在细胞 产生次生产物的时期，就将其固定化，加以营养介质 及底物进行反应，将其制成颗粒状，注入柱式反应器， 就可以进行连续循环反应。通过固定化细胞进行连续 培养始实现商业化生产的有效途径。
D 两相培养技术（two-phase culture） 即在培 养基中引入第二相，细胞产物在原培养系统合成后， 向第二相富集，从而减了产物的反馈抑制，不仅提高 了产物，而且简化了后处理。
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3.4.4 药用成分生物合成途径及关键酶
研究植物次生代谢合成途径对提高次生代谢 物产量很有帮助。可以通过添加产物的前体 或添加副产物使细胞内合成有利于产物方向 从而提高产量。其次，药用植物次生代谢产 物的形成总是与连接初生和次生代谢酶的活 性成正相关，因此分离编码这些酶的基因， 通过Ti质粒和Ri质粒载体携带克隆基因等到植 物细胞中， 可提高该酶的表达量，酶活总量 提高，次生物量也响应增加。
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3.4.3 建立适宜的培养程序和条 件，保证细胞系高产稳定
a二步法 从许多植物细胞培养与次生产物的形成来 看，生物合成作用往往在细胞生长的后期，据此提出 二步培养发（two-step culture）。第一步培养基称 为生长培养基，主要适合于细胞的生长；第二步称为 生产培养基，用于次生产物的合成。两种培养基往往 有所区别，后者通常具有较低含量的硝酸盐或磷酸盐， 或两者含量均较低。此外，通常也含有较低的糖分或 少量可利用的碳源。二步培养已在许多药用植物细胞 培养中得到应用。日本首次利用紫草细胞工业化生产 紫草宁用二步法。Mei等（1996）在10L反应器中采 用二步培养技术培养红豆杉细胞，20天后生物增加 了3倍，经过比较，生长基中紫杉醇含量很低 （0.8mg/L），生产基中达19.4—27.5mg/L。
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3.4.2 培养液中加入诱导子，增加有效 成份含量 诱导子可以是高压灭活的真 菌，细菌和酵母的细胞壁萃取物，滤液 或孢子等生物诱导子，也可以是重金属， 砜酸盐和阿魏酸，苯甲酸等人工合成的 化合物，如悬浮培养的西洋参细胞经刺 盘孢菌丝状体诱导子处理后，总皂甙产 率可由对照的296mg/L增加到679mg/L （约总细胞干重的16.3%）。
植物的根、茎、叶、花、果实、种子、髓等 组织或器官都可用来诱导愈伤组织，在实际 工作中往往是在生长活跃的部位取材，进行 愈伤组织的培养，此时可以进行各种培养基 的选择，经过一段时间的培养，可以选择出 适当的培养基作为以后培养的基本培养基。 等愈伤组织长大后，转移到液体培养基中进 行振荡，分离细胞。一般愈伤组织不会很好 地分散成理想的单细胞悬浮液，大多为50— 200个细胞组成的细胞团。
筛选：具色物质如花色苷、醌类、胡萝卜等在显微镜 下就能显示出单细胞的着色程度，也可以从高的着色 细胞选出细胞株。酶联免疫反应测定（ElISA）
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3.3 培养方式和培养容器
小规模培养可选择大小适当的三角瓶 （50—2000ml），里面有选定的培养基， 把筛选好的细胞株接入以后，转旋培养 （60—150转/min）,4周后可进行继代 培养。若采用固体培养，在培养基中加 入0.7-0.9%琼脂。大规模培养方式主要 是液体悬浮培养法，培养容器用桨式搅 拌罐、空气提升式反应器。
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C代谢产物胞外释放 由于大部分有用的次生代谢物 并不释放到培养基中，而是储存于液泡中，传统的提 取药用次生代谢物的方法始破碎细胞，使细胞只能一 次性的使用。解决储存液泡中的次生代谢物使之释放 到胞外也是通过固定化细胞进行连续培养要解决的一 个主要问题。已发展出了化学试剂法、改变离子强度 法、PH扰动法、电击法等。