蛋白质与蛋白质、DNA相互作用研究方法加实例
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Tserendulam Batsukh, Yvonne Schulz,et.al.Identification and Characterization of FAM124B as a Novel Component of a CHD7 and CHD8 Containing Complex.PLoS One. 2012; 7(12): e52640
1.5 酵母双杂交技术的弱点：
1. 假阳性：自激活、多因子参与…… 2. 3. 假阴性：毒性蛋白、膜蛋白、难表达的蛋白…… 低等真核细胞不能完全等同于高等真核生物的情况
酵母双杂交实验的结果必须经过多方面的验证，包括： 1. 体外相互作用验证 体外亲和纯化（GST pull-down）、体外免疫共沉淀…… 2. 哺乳动物细胞内验证 亚细胞共定位、体内免疫共沉淀……
3）离心弃上清 4）沉淀加入2× 蛋白Loading Buffer煮沸，离心
These both plasmids were co-transformed into Y2HGold strain cells together with either the CHD7-CR1-3-pGBKT7 (amino acids 1591-2181) or the CHD8-pGBKT7 (amino acids 1789– 2302) plasmids.
实例
Identification and Characterization of FAM124B as a Novel Component of a CHD7 and CHD8 Containing Complex
(A) Using the anti-CHD8 (abcam, ab84527) or the anti-CHD7 (abcam, ab31824) antibody for precipitation, we detected with the anti-HA antibody (Roche) an approximately 51 kDa band corresponding to the estimated size of FAM124B transcript variant 1. Lane 1: co-transfected Co-IP, lane 2: untransfected HeLa cells as negative control.
1.4 酵母双杂交技术的优点：
1. 是一种细胞内蛋白质相互作用研究技术，比体外的蛋白 质相互作用技术更接近生物体内的真实情况。 基于基因重组技术和分子遗传学的原理，更便于观察和 检测实验结果。 酵母菌是一种低等真核微生物，能反映真核生物的基本 生命现象和规律。
2.
3.
wk.baidu.com
4. 酵母菌生长迅速、容易培养，便于进行高通量、大规模 的组学研究。
1.1
酵母双杂交技术的原理
同时将上述两种载体转化改造后的酵母， 这种改造后的酵母细胞的基因组中既不能 产生GAL4，又不能合成LEU、TRP、 HIS、ADE，因此，酵母在缺乏这些营养的 培养基上无法正常生长。当上述两种载体 所表达的融合蛋白能够相互作用时，功能 重建的反式作用因子能够激活酵母基因组 中的报告基因HIS、ADE、LACZ、 MEL1，从而通过功能互补和显色反应筛选 到阳性菌落。
二、免疫共沉淀
2.1 定义及原理
– 免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation）：是以抗体 和抗原之间的专一性作用为基础的用于研究蛋白质相 互作用的经典方法。是确定两种蛋白质在完整细胞内 生理性相互作用的有效方法。 – 原理：当细胞在非变性条件下被裂解时，完整细胞内 存在的许多蛋白质－蛋白质间的相互作用被保留了下 来。如果用蛋白质x的抗体免疫沉淀x，那么与x在体内 结合的蛋白质y也能沉淀下来。这种方法常用于测定两 种目标蛋白质是否在体内结合；也可用于确定一种特 定蛋白质的新的作用搭档。
Yeast two hybrid assay.
(A)Direct yeast two hybrid experiment with the constructs FAM124B-1,3-pGADT7 (full length transcript variant 1) and CHD7-CR1-3-pGBKT7 (amino acids 1591-2181, demonstrating no direct interaction between FAM124B transcript variant 1 and the CHD7 part, while (B) Direct yeast two hybrid experiment with the constructs FAM124B-1,3-pGADT7 (full length transcript variant 1) and CHD8-pGBKT7 (amino acids 1789–2302, shows a direct interaction. The same experiments were performed for FAM124B transcript variant 2. (C) Direct yeast two hybrid experiment with the constructs FAM124B-1,2-pGADT7 (full length transcript variant 2) and CHD7-CR1-3-pGBKT7 (amino acids 15912181, (D) Direct yeast two hybrid experiment with the constructs FAM124B-1,2-pGADT7 (full length transcript variant 2) and CHD8-pGBKT7 (amino acids 1789–2302, FAM124B transcript variant 2 interacts directly with the CHD8 part, while no direct interaction with the CHD7 part could be observed.
五.双分子荧光互补（Bimolecular Fluorescent Complement）BIFC
六.蛋白质芯片技术
七.其它方法
一.酵母双杂交系统
1.1 酵母双杂交技术的原理
酵母双杂交系统由Fields和Song等首先在研究真核基因转录调控中建 立。他的产生是基于对酵母转录因子GAL4性质的研究.
1.3 应用
酵母双杂交系统是一种在酵母细胞内分析蛋
白质相互作用的技术。主要有二类载体: a 含 DNA -binding domain的载体; b 含Transcription-
activating domain的载体。另外还需要特殊的酵
母菌株如GAL4缺陷型。
•
它可用于：
– – – 检验蛋白质间的相互作用； 分析蛋白质相互作用的结构域； 发现新的作用蛋白质。
蛋白质与蛋白质的相互作用研究方法 蛋白质与DNA相互作用研究方法
蛋白质与蛋白质的相互作用的研究方法
一.酵母双杂交系统Yeast Two-Hybrid Systerm 二.免疫共沉淀Co-immunoprecipitation (Co-IP) 三.GST pull-down 技术 四.荧光共振能量转移Fluorescent Resonant Energy Transfer （FRET）
1.2 酵母双杂交操作主要流程
BD
1. 分别构建BD和AD融合蛋白载体 2. 分别将重组载体转化酵母菌细胞 3. 对酵母转化子进行自激活检测 4. 将重组载体共转化酵母菌细胞 5. 检测报告基因表达产物 6. 分析酵母双杂交实验结果
AD
Y
x
BD
AD
BD
AD
实例
Identification and Characterization of FAM124B as a Novel Component of a CHD7 and CHD8 Containing Complex Method： For yeast two hybrid studies we generated the constructs FAM124B-1,3-pGADT7 (transcript variant 1) and FAM124B-1,2pGADT7 (transcript variant 2) FAM124B-1,3-pGBKT7 (transcript variant 1, FAM124B-1,2pGBKT7 (transcript variant ),
两种应用： 1）确定融合（或探针）蛋白与未知（或靶）蛋白间的新的相互作用 2）证实探针蛋白与已知蛋白质间可疑的相互作用
3.2 方法： 1） GST融合蛋白先与下列蛋白溶液之一孵育（a, 单一明确 的重组蛋白；b，细胞裂解蛋白混合液；c, 体外翻译cDNA 表达得到的未知蛋白）
2）混合液与谷胱甘肽琼脂糖球珠反应 4º C 2h
三、GST pull—down技术
3.1 定义及原理
—定义：该技术是通过以适当标签 和目的基因进行融合 表达作为诱饵．从细胞提取物中钓出与目的蛋白相互作 用的蛋白。多组分蛋白质复合物的分离主要利用固定在 琼脂糖树脂的反标签系统完成。 —原理：将诱饵蛋白质和用谷胱甘肽-s-转移酶 (glutathione-transferase，GST）标签融合表达，一步 纯化后与含有目的蛋白质的溶液进行孵育．利用谷胱甘 肽琼脂糖球珠将GST-融合蛋白-目的蛋白复合物沉淀下来， 然后进行聚丙烯酞胺凝胶电泳(SDS—PAGE) 鉴定与诱饵 蛋白质相互作用的蛋白质
优点：生理条件下的结合 缺点：可能检测不到低亲和力和瞬间的蛋白质－蛋白质相互作用
2.2 方法
1) 收获培养的细胞（1×107－1×108）冷PBS洗涤2次 2）细胞裂解液裂解细胞，冰浴30min 3) 12000rpm 离心 30min 4）收集上清并加入适量抗体，4º C摇动1h～过夜 5）加入ProteinA/G-Sepharose(琼脂糖凝胶)悬液， 4º C摇动1h 6）细胞裂解液洗涤ProteinA/G-Sepharose混合液 7）离心弃上清 8）沉淀加2×蛋白Loading Buffer煮沸5－10min 9）离心，上清液跑SDS-PAGE 胶 10）考马氏亮兰染色、银染 Western Blot 质谱分析
3.注意事项 1）细胞裂解 采用温和的裂解条件，不能破坏细胞内存在的蛋白 质－蛋白质相互作用，多采用非离子变性剂（NP40或 Triton X-100)。每种细胞的裂解条件是不一样的，通过 经验确定。 不能用高浓度的变性剂（0.2％SDS)，细胞裂解液中 要加各种蛋白酶酶抑制剂，如商品化的cocktailer。 2）使用明确的抗体，有的抗体不适宜做免疫共沉淀。 3) 对照实验的设计。
如果要研究两个蛋白之间有无相互作用，可以把这两 个蛋白分别与DB和AD形成的融合蛋白。 与DB 融合的蛋白称为“诱饵”(bait)， 与AD融合的蛋白称为“猎物”(prey)。 如果这两个蛋白能发生相互作用, 这两个融合蛋白上的 DB和AD就能重新形成有活性的转录激活因子, 从而激活 报告基因(reporter gene)的转录与表达。 通过检测报告基因的表达产物, 可判别“诱饵”和“猎物” 这两个蛋白质之间是否存在相互作用。
基因转录不仅需要有特定的DNA顺式序列结构，而且也 需要有反式转录激活因子的参与。 转录激活因子往往 由两个或两个以上相互独立的结构域构成,其中有DNA 结合结构域(DNA binding domain, DB)和转录激活结构 域(activation domain, AD), 它们都是转录激活因子发挥 功能所必需的。 单独的BD或AD都不能激活基因转录，但不同转录激活 因子的DB和AD形成的杂合蛋白仍然具有正常的激活 转录的功能。
1.5 酵母双杂交技术的弱点：
1. 假阳性：自激活、多因子参与…… 2. 3. 假阴性：毒性蛋白、膜蛋白、难表达的蛋白…… 低等真核细胞不能完全等同于高等真核生物的情况
酵母双杂交实验的结果必须经过多方面的验证，包括： 1. 体外相互作用验证 体外亲和纯化（GST pull-down）、体外免疫共沉淀…… 2. 哺乳动物细胞内验证 亚细胞共定位、体内免疫共沉淀……
3）离心弃上清 4）沉淀加入2× 蛋白Loading Buffer煮沸，离心
These both plasmids were co-transformed into Y2HGold strain cells together with either the CHD7-CR1-3-pGBKT7 (amino acids 1591-2181) or the CHD8-pGBKT7 (amino acids 1789– 2302) plasmids.
实例
Identification and Characterization of FAM124B as a Novel Component of a CHD7 and CHD8 Containing Complex
(A) Using the anti-CHD8 (abcam, ab84527) or the anti-CHD7 (abcam, ab31824) antibody for precipitation, we detected with the anti-HA antibody (Roche) an approximately 51 kDa band corresponding to the estimated size of FAM124B transcript variant 1. Lane 1: co-transfected Co-IP, lane 2: untransfected HeLa cells as negative control.
1.4 酵母双杂交技术的优点：
1. 是一种细胞内蛋白质相互作用研究技术，比体外的蛋白 质相互作用技术更接近生物体内的真实情况。 基于基因重组技术和分子遗传学的原理，更便于观察和 检测实验结果。 酵母菌是一种低等真核微生物，能反映真核生物的基本 生命现象和规律。
2.
3.
wk.baidu.com
4. 酵母菌生长迅速、容易培养，便于进行高通量、大规模 的组学研究。
1.1
酵母双杂交技术的原理
同时将上述两种载体转化改造后的酵母， 这种改造后的酵母细胞的基因组中既不能 产生GAL4，又不能合成LEU、TRP、 HIS、ADE，因此，酵母在缺乏这些营养的 培养基上无法正常生长。当上述两种载体 所表达的融合蛋白能够相互作用时，功能 重建的反式作用因子能够激活酵母基因组 中的报告基因HIS、ADE、LACZ、 MEL1，从而通过功能互补和显色反应筛选 到阳性菌落。
二、免疫共沉淀
2.1 定义及原理
– 免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation）：是以抗体 和抗原之间的专一性作用为基础的用于研究蛋白质相 互作用的经典方法。是确定两种蛋白质在完整细胞内 生理性相互作用的有效方法。 – 原理：当细胞在非变性条件下被裂解时，完整细胞内 存在的许多蛋白质－蛋白质间的相互作用被保留了下 来。如果用蛋白质x的抗体免疫沉淀x，那么与x在体内 结合的蛋白质y也能沉淀下来。这种方法常用于测定两 种目标蛋白质是否在体内结合；也可用于确定一种特 定蛋白质的新的作用搭档。
Yeast two hybrid assay.
(A)Direct yeast two hybrid experiment with the constructs FAM124B-1,3-pGADT7 (full length transcript variant 1) and CHD7-CR1-3-pGBKT7 (amino acids 1591-2181, demonstrating no direct interaction between FAM124B transcript variant 1 and the CHD7 part, while (B) Direct yeast two hybrid experiment with the constructs FAM124B-1,3-pGADT7 (full length transcript variant 1) and CHD8-pGBKT7 (amino acids 1789–2302, shows a direct interaction. The same experiments were performed for FAM124B transcript variant 2. (C) Direct yeast two hybrid experiment with the constructs FAM124B-1,2-pGADT7 (full length transcript variant 2) and CHD7-CR1-3-pGBKT7 (amino acids 15912181, (D) Direct yeast two hybrid experiment with the constructs FAM124B-1,2-pGADT7 (full length transcript variant 2) and CHD8-pGBKT7 (amino acids 1789–2302, FAM124B transcript variant 2 interacts directly with the CHD8 part, while no direct interaction with the CHD7 part could be observed.
五.双分子荧光互补（Bimolecular Fluorescent Complement）BIFC
六.蛋白质芯片技术
七.其它方法
一.酵母双杂交系统
1.1 酵母双杂交技术的原理
酵母双杂交系统由Fields和Song等首先在研究真核基因转录调控中建 立。他的产生是基于对酵母转录因子GAL4性质的研究.
1.3 应用
酵母双杂交系统是一种在酵母细胞内分析蛋
白质相互作用的技术。主要有二类载体: a 含 DNA -binding domain的载体; b 含Transcription-
activating domain的载体。另外还需要特殊的酵
母菌株如GAL4缺陷型。
•
它可用于：
– – – 检验蛋白质间的相互作用； 分析蛋白质相互作用的结构域； 发现新的作用蛋白质。
蛋白质与蛋白质的相互作用研究方法 蛋白质与DNA相互作用研究方法
蛋白质与蛋白质的相互作用的研究方法
一.酵母双杂交系统Yeast Two-Hybrid Systerm 二.免疫共沉淀Co-immunoprecipitation (Co-IP) 三.GST pull-down 技术 四.荧光共振能量转移Fluorescent Resonant Energy Transfer （FRET）
1.2 酵母双杂交操作主要流程
BD
1. 分别构建BD和AD融合蛋白载体 2. 分别将重组载体转化酵母菌细胞 3. 对酵母转化子进行自激活检测 4. 将重组载体共转化酵母菌细胞 5. 检测报告基因表达产物 6. 分析酵母双杂交实验结果
AD
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BD
AD
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实例
Identification and Characterization of FAM124B as a Novel Component of a CHD7 and CHD8 Containing Complex Method： For yeast two hybrid studies we generated the constructs FAM124B-1,3-pGADT7 (transcript variant 1) and FAM124B-1,2pGADT7 (transcript variant 2) FAM124B-1,3-pGBKT7 (transcript variant 1, FAM124B-1,2pGBKT7 (transcript variant ),
两种应用： 1）确定融合（或探针）蛋白与未知（或靶）蛋白间的新的相互作用 2）证实探针蛋白与已知蛋白质间可疑的相互作用
3.2 方法： 1） GST融合蛋白先与下列蛋白溶液之一孵育（a, 单一明确 的重组蛋白；b，细胞裂解蛋白混合液；c, 体外翻译cDNA 表达得到的未知蛋白）
2）混合液与谷胱甘肽琼脂糖球珠反应 4º C 2h
三、GST pull—down技术
3.1 定义及原理
—定义：该技术是通过以适当标签 和目的基因进行融合 表达作为诱饵．从细胞提取物中钓出与目的蛋白相互作 用的蛋白。多组分蛋白质复合物的分离主要利用固定在 琼脂糖树脂的反标签系统完成。 —原理：将诱饵蛋白质和用谷胱甘肽-s-转移酶 (glutathione-transferase，GST）标签融合表达，一步 纯化后与含有目的蛋白质的溶液进行孵育．利用谷胱甘 肽琼脂糖球珠将GST-融合蛋白-目的蛋白复合物沉淀下来， 然后进行聚丙烯酞胺凝胶电泳(SDS—PAGE) 鉴定与诱饵 蛋白质相互作用的蛋白质
优点：生理条件下的结合 缺点：可能检测不到低亲和力和瞬间的蛋白质－蛋白质相互作用
2.2 方法
1) 收获培养的细胞（1×107－1×108）冷PBS洗涤2次 2）细胞裂解液裂解细胞，冰浴30min 3) 12000rpm 离心 30min 4）收集上清并加入适量抗体，4º C摇动1h～过夜 5）加入ProteinA/G-Sepharose(琼脂糖凝胶)悬液， 4º C摇动1h 6）细胞裂解液洗涤ProteinA/G-Sepharose混合液 7）离心弃上清 8）沉淀加2×蛋白Loading Buffer煮沸5－10min 9）离心，上清液跑SDS-PAGE 胶 10）考马氏亮兰染色、银染 Western Blot 质谱分析
3.注意事项 1）细胞裂解 采用温和的裂解条件，不能破坏细胞内存在的蛋白 质－蛋白质相互作用，多采用非离子变性剂（NP40或 Triton X-100)。每种细胞的裂解条件是不一样的，通过 经验确定。 不能用高浓度的变性剂（0.2％SDS)，细胞裂解液中 要加各种蛋白酶酶抑制剂，如商品化的cocktailer。 2）使用明确的抗体，有的抗体不适宜做免疫共沉淀。 3) 对照实验的设计。
如果要研究两个蛋白之间有无相互作用，可以把这两 个蛋白分别与DB和AD形成的融合蛋白。 与DB 融合的蛋白称为“诱饵”(bait)， 与AD融合的蛋白称为“猎物”(prey)。 如果这两个蛋白能发生相互作用, 这两个融合蛋白上的 DB和AD就能重新形成有活性的转录激活因子, 从而激活 报告基因(reporter gene)的转录与表达。 通过检测报告基因的表达产物, 可判别“诱饵”和“猎物” 这两个蛋白质之间是否存在相互作用。
基因转录不仅需要有特定的DNA顺式序列结构，而且也 需要有反式转录激活因子的参与。 转录激活因子往往 由两个或两个以上相互独立的结构域构成,其中有DNA 结合结构域(DNA binding domain, DB)和转录激活结构 域(activation domain, AD), 它们都是转录激活因子发挥 功能所必需的。 单独的BD或AD都不能激活基因转录，但不同转录激活 因子的DB和AD形成的杂合蛋白仍然具有正常的激活 转录的功能。