三细胞工程基本技术
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细胞观察与分析
细胞计数与活力分析 细胞固定与染色观察 凋亡细胞观察 染色体分析
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细胞计数与活力分析
采用血细胞计数法计数 活力分析：
➢ 台盼蓝染色法：死细胞着色 ➢MTT ：活细胞使其还原为兰色，用酶标仪
测定490nm 处的光密度，计算细胞相对活力
适用于无菌室的定期灭菌。
常用的方法是将甲醛和高锰酸钾
混合后，产生大量蒸气，以杀死微生物，
效果较好。
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消毒液灭菌
Βιβλιοθήκη Baidu
依化学灭菌剂的不同而适用于不
同场合的灭菌。
70%酒精几乎适用于组织培养中如 各种器皿、培养材料、无菌室、接种箱、 工作台、操作人员的手等；
升汞、漂白粉、新洁尔灭、次氯酸
器皿材料
接种工具
操作环境
培养室
第10页/共115页
玻璃器皿清洗
浸泡——刷洗——浸酸——冲洗
第11页/共115页
无菌室
无菌操作室和无菌培养室 要求：墙壁光滑、地面平坦无缝，门窗
密闭，无空气对流
第12页/共115页
灭菌种类
物理灭菌：高温高压灭菌、干热灭菌、 射线辐照灭菌、过滤灭菌
化学灭菌：熏蒸灭菌、消毒液灭菌（酒 精、升汞、漂白粉、新洁尔灭、次氯酸 钠、次氯酸钙、过氧化氢）
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血球计数板
第26页/共115页
计数法
第27页/共115页
细胞固定与染色观察
细胞固定
➢甲醇-醋酸 ➢FAA ➢Carnoy
细胞染色
➢苏木精-伊红（H.E)染色法 ➢Giemsa染色法 ➢Feulgen染色法 ➢考马斯蓝染色法
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凋亡细胞观察
形态观察: 生化分析:
原理：将带菌的液体或气体通过孔径小 于0.45uM微孔装置，使杂菌留在滤板上 而液体或气体进入无菌空瓶中，从而达 到除菌目的。
常用于不能以高温高压灭菌的培养液、 有机物质溶液和酶液的除菌。
组织培养中常用的过滤除菌器是滤膜过 滤器，它清洗方便，过滤效果好。
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蒸灭菌
用能杀死微生物的蒸汽进行灭菌，
钠、次氯酸钙、过氧化氢、抗菌素等适
用于培养材料的灭菌。
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室内灭菌
2%的新洁尔灭擦洗， 70%乙醇喷雾， 紫外灯照射约20分钟 定期用甲醛和高锰酸钾熏蒸
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试剂和器皿的灭菌
包括培养基、特殊药品和所有无菌操作 使用的器皿的灭菌
培养基通常使用灭菌锅通过高压蒸汽灭 菌进行灭菌
接种室： 接种室的功能是进行无菌操作。 要求封闭性好，干燥清洁，能较长时间 保持无菌。房间一般不宜过大，其规模 根据实验需要而定。接种室除了出入口 和通气口外，应行密闭。
培养室： 培养室的功能是对离体材料进
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辅助实验室
细胞学实验室 ：其功能是对培养材料进 行细胞学鉴定和研究。要求清洁、明亮、 干燥，使各种光学仪器不受潮湿和灰尘 污染。
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污染检测与控制
细菌：可采用抗生素预防 真菌：可采用抗真菌剂防治 支原体：可采用抗生素、加温处理
（41℃）、使用支原体特异性血清 病毒：脱毒 细胞交叉污染：严格操作规程
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显微技术
显微观察技术： 显微操作技术：借助显微操作仪采用细
微玻璃针或用微吸管、微电极、微热电 偶等可进行细胞解剖、物质的抽取及注 入、移植等操作。
无菌操作设备 ：净化工作台、接种箱。 光温控制设备 ：时间程序控制器、空调
及温度感应器。 细胞培养设备： 培养设备根据需要而定，
包括培养架、培第养9页箱/共1、15页摇床、生物反应
无菌技术
无菌技术是一个技术体系，涉及多方 面因素、多个环节，只有诸因素和环节 都处理好，才能达到无菌。
培养基
➢锚定蛋白:检测凋亡早期 ➢PI:检测晚期或死细胞
分子技术:梯形电泳图谱
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PS可从细胞膜的内侧翻转到细 胞膜的表面
第30页/共115页
FITC-AnnexinV染色
第31页/共115页
FITC-AnnexinV和PI染色
第32页/共115页
梯形电泳图谱
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基本技术
实验室条件 无菌技术 显微技术 细胞观察与分析 细胞分离 细胞保存与复苏
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实验室基本组成
细胞工程实验室它必须满足三个基本的 需要，即：
➢ 实验准备，包括培养基配制，洗涤与灭菌等； ➢ 无菌操作； ➢ 控制培养。
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基本实验室
准备室： 准备室的功能就是进行一切与 实验有关的准备工作。要求宽敞明亮， 通风条件好。
抗生素消毒：在动物细胞培养中，常采 用青霉素、链霉素、卡那霉素、制霉菌 素等抗生素抑制细菌、真菌等污染。
根据灭菌对象选择不同的灭菌方法 第13页/共115页
高温高压灭菌
原理：在121℃高温和0.8kg/cm21.1kg/cm2的压力下，一般持续15-20 分钟后，就可杀死一切微生物的营养体 及其孢子。
染色体分析
样品处理:秋水仙素 低渗处理 固定化 染色观察
适用于器皿、工具、衣物和培养基灭菌。
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干热灭菌法
将物品放入烘箱，利用高温使微
生物细胞内的蛋白质凝固而达到灭菌的
目的。
适用于玻璃器皿。
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射线灭菌
紫外光常用于培养室和接种箱或超 净台的灭菌。操作前开灯20分钟可达到 灭菌效果。
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过滤灭菌
摄影室及暗室： 其功能是进行培养材料 的摄影记录和胶片冲印。在有条件的情 况下可建立此实验室。
生化分析室： 在以培养细胞产物为主要 目的的实验室中，应建立相应的分析化
第4页/共115页
实验室布局的基本要求
便于隔离、便于操作、便于灭菌、便于 观察。
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实验用品及主要设备
玻璃器皿 常用器械 细胞培养的主要设备
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玻璃器皿
液体储存瓶 吸管 离心管 培养皿 培养瓶与培养板 其它器皿1
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常用器械
解剖刀、镊子、剪刀、洗耳球、封口膜、 酒精灯等
第8页/共115页
胞培养的主要设备
基本设备： 冰箱、天平、酸度计、、纯 水器、电炉、培养基分装器、搅拌器。
灭菌设备 ：蒸汽压力灭菌锅、烘箱、过 滤灭菌装置、喷雾消毒器、紫外灯。
细胞观察与分析
细胞计数与活力分析 细胞固定与染色观察 凋亡细胞观察 染色体分析
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细胞计数与活力分析
采用血细胞计数法计数 活力分析：
➢ 台盼蓝染色法：死细胞着色 ➢MTT ：活细胞使其还原为兰色，用酶标仪
测定490nm 处的光密度，计算细胞相对活力
适用于无菌室的定期灭菌。
常用的方法是将甲醛和高锰酸钾
混合后，产生大量蒸气，以杀死微生物，
效果较好。
第18页/共115页
消毒液灭菌
Βιβλιοθήκη Baidu
依化学灭菌剂的不同而适用于不
同场合的灭菌。
70%酒精几乎适用于组织培养中如 各种器皿、培养材料、无菌室、接种箱、 工作台、操作人员的手等；
升汞、漂白粉、新洁尔灭、次氯酸
器皿材料
接种工具
操作环境
培养室
第10页/共115页
玻璃器皿清洗
浸泡——刷洗——浸酸——冲洗
第11页/共115页
无菌室
无菌操作室和无菌培养室 要求：墙壁光滑、地面平坦无缝，门窗
密闭，无空气对流
第12页/共115页
灭菌种类
物理灭菌：高温高压灭菌、干热灭菌、 射线辐照灭菌、过滤灭菌
化学灭菌：熏蒸灭菌、消毒液灭菌（酒 精、升汞、漂白粉、新洁尔灭、次氯酸 钠、次氯酸钙、过氧化氢）
第25页/共115页
血球计数板
第26页/共115页
计数法
第27页/共115页
细胞固定与染色观察
细胞固定
➢甲醇-醋酸 ➢FAA ➢Carnoy
细胞染色
➢苏木精-伊红（H.E)染色法 ➢Giemsa染色法 ➢Feulgen染色法 ➢考马斯蓝染色法
第28页/共115页
凋亡细胞观察
形态观察: 生化分析:
原理：将带菌的液体或气体通过孔径小 于0.45uM微孔装置，使杂菌留在滤板上 而液体或气体进入无菌空瓶中，从而达 到除菌目的。
常用于不能以高温高压灭菌的培养液、 有机物质溶液和酶液的除菌。
组织培养中常用的过滤除菌器是滤膜过 滤器，它清洗方便，过滤效果好。
第17页/共115页
蒸灭菌
用能杀死微生物的蒸汽进行灭菌，
钠、次氯酸钙、过氧化氢、抗菌素等适
用于培养材料的灭菌。
第19页/共115页
室内灭菌
2%的新洁尔灭擦洗， 70%乙醇喷雾， 紫外灯照射约20分钟 定期用甲醛和高锰酸钾熏蒸
第20页/共115页
试剂和器皿的灭菌
包括培养基、特殊药品和所有无菌操作 使用的器皿的灭菌
培养基通常使用灭菌锅通过高压蒸汽灭 菌进行灭菌
接种室： 接种室的功能是进行无菌操作。 要求封闭性好，干燥清洁，能较长时间 保持无菌。房间一般不宜过大，其规模 根据实验需要而定。接种室除了出入口 和通气口外，应行密闭。
培养室： 培养室的功能是对离体材料进
第3页/共115页
辅助实验室
细胞学实验室 ：其功能是对培养材料进 行细胞学鉴定和研究。要求清洁、明亮、 干燥，使各种光学仪器不受潮湿和灰尘 污染。
第21页/共115页
污染检测与控制
细菌：可采用抗生素预防 真菌：可采用抗真菌剂防治 支原体：可采用抗生素、加温处理
（41℃）、使用支原体特异性血清 病毒：脱毒 细胞交叉污染：严格操作规程
第22页/共115页
显微技术
显微观察技术： 显微操作技术：借助显微操作仪采用细
微玻璃针或用微吸管、微电极、微热电 偶等可进行细胞解剖、物质的抽取及注 入、移植等操作。
无菌操作设备 ：净化工作台、接种箱。 光温控制设备 ：时间程序控制器、空调
及温度感应器。 细胞培养设备： 培养设备根据需要而定，
包括培养架、培第养9页箱/共1、15页摇床、生物反应
无菌技术
无菌技术是一个技术体系，涉及多方 面因素、多个环节，只有诸因素和环节 都处理好，才能达到无菌。
培养基
➢锚定蛋白:检测凋亡早期 ➢PI:检测晚期或死细胞
分子技术:梯形电泳图谱
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PS可从细胞膜的内侧翻转到细 胞膜的表面
第30页/共115页
FITC-AnnexinV染色
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FITC-AnnexinV和PI染色
第32页/共115页
梯形电泳图谱
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基本技术
实验室条件 无菌技术 显微技术 细胞观察与分析 细胞分离 细胞保存与复苏
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实验室基本组成
细胞工程实验室它必须满足三个基本的 需要，即：
➢ 实验准备，包括培养基配制，洗涤与灭菌等； ➢ 无菌操作； ➢ 控制培养。
第2页/共115页
基本实验室
准备室： 准备室的功能就是进行一切与 实验有关的准备工作。要求宽敞明亮， 通风条件好。
抗生素消毒：在动物细胞培养中，常采 用青霉素、链霉素、卡那霉素、制霉菌 素等抗生素抑制细菌、真菌等污染。
根据灭菌对象选择不同的灭菌方法 第13页/共115页
高温高压灭菌
原理：在121℃高温和0.8kg/cm21.1kg/cm2的压力下，一般持续15-20 分钟后，就可杀死一切微生物的营养体 及其孢子。
染色体分析
样品处理:秋水仙素 低渗处理 固定化 染色观察
适用于器皿、工具、衣物和培养基灭菌。
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干热灭菌法
将物品放入烘箱，利用高温使微
生物细胞内的蛋白质凝固而达到灭菌的
目的。
适用于玻璃器皿。
第15页/共115页
射线灭菌
紫外光常用于培养室和接种箱或超 净台的灭菌。操作前开灯20分钟可达到 灭菌效果。
第16页/共115页
过滤灭菌
摄影室及暗室： 其功能是进行培养材料 的摄影记录和胶片冲印。在有条件的情 况下可建立此实验室。
生化分析室： 在以培养细胞产物为主要 目的的实验室中，应建立相应的分析化
第4页/共115页
实验室布局的基本要求
便于隔离、便于操作、便于灭菌、便于 观察。
第5页/共115页
实验用品及主要设备
玻璃器皿 常用器械 细胞培养的主要设备
第6页/共115页
玻璃器皿
液体储存瓶 吸管 离心管 培养皿 培养瓶与培养板 其它器皿1
第7页/共115页
常用器械
解剖刀、镊子、剪刀、洗耳球、封口膜、 酒精灯等
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胞培养的主要设备
基本设备： 冰箱、天平、酸度计、、纯 水器、电炉、培养基分装器、搅拌器。
灭菌设备 ：蒸汽压力灭菌锅、烘箱、过 滤灭菌装置、喷雾消毒器、紫外灯。