抗体制备详解

☆戊二醛是常用的带有两个活性基团的 双功能联接剂☆
第二节 免疫佐剂
免疫佐剂（immunoadjuvant）： 预先或与抗原同时注入体内，可
增强机体对该抗原的免疫应答或改 变免疫应答的类型的物质称为免疫 佐剂,简称佐剂（adjuvant）。
一、佐剂的种类
化合物 生物制剂
人体的佐剂：氢氧化铝、明矾、poly I∶C、胞壁酰二肽、细胞因子、热休 克蛋白 动物的佐剂：弗氏佐剂
★（三）免疫球蛋白片段的制备：
1. 解离二硫键 2. 溴化氰裂解法 3. 酶裂解法
三、半抗原
半抗原（无免疫原性）多肽、多糖、甾族激
＋
素、脂肪胺、类脂质、 核苷、某些药物以及
载体
其他化学物品等。
完全抗原（具免疫原性）
机体 抗体/致敏淋巴细胞
1、载体的选择
①蛋白质：牛血清白蛋白、人血清白蛋白、 兔血 清白蛋白、牛甲状腺球蛋白 ②多肽聚合物：多聚赖氨酸 ③大分子聚合物：
组织和细胞成分混合抗原制备程序
所用材料必须是新鲜或低温保存的 去除包
洗去血迹 及污物
脏器进行灌洗
NS内含0.5g／L
膜或结 缔组织
NaN3
冷浴中组织剪碎
装入捣碎机筒内高速 粉碎制成组织匀浆液
上清液 澄清
去除细胞碎片 及微小组织
3000r／ min×10min
离心 取上清液
2.细胞可溶性抗原的破碎
5.亲和层析法
是利用生物大分子的生物学特异性， 即生物分子间所具有的专一性亲和力而 设计的层析技术。 特点：纯化效率高，速度快，有时仅一 步即可达到纯化目的。
★亲和层析支持物的选择： ①非特异性吸附低； ②液体流速快； ③在各种pH和高浓度盐溶液中稳定； ④有合适丰富的化学基团 ⑤有丰富的微，以增加结合容量。
第三章 抗体制备
医学技术学院免疫教研室
教学目的
掌握：颗粒性抗原的制备、可溶性抗原的 制备
熟悉：可溶性抗原的纯化--盐析法
第一节 免疫原的制备
免疫原(immunogen)是能诱导机体产生抗体 并能与抗体发生反应的物质。
免疫原：颗粒性抗原 可溶性抗原 半抗原性免疫原
一、颗粒性抗原
➢细胞抗原：绵羊红细胞
白蛋白 IgM IgG
Sephadex G-200凝胶
4. 离子交换层析法
原理： 利用带电离子基团的纤维素或凝胶，吸
附交换带相反电荷的蛋白质抗原。各种蛋 白质的等电点不同，所带电荷不同，与纤 维素结合的能力有差别。
交联葡萄糖 琼脂糖
聚丙烯酰胺
离子交换 常用离子
纤维素
交换剂
离子化 细粉
交联树脂
（4）表面活性剂处理法
原理： 在适当的温度、pH及低离子强度的条件下， 表面活性剂能与脂蛋白形成微泡，使膜的渗透 性改变或使之溶解。
应用: ①破碎细菌，且作用比较温和 ②提取核酸时，常用此法破碎细胞
（二）可溶性抗原的提取和纯化
1.超速离心法： ➢ 差速离心法－低速和高速交替进行 ➢ 密度梯度离心法－区带离心法
★配体的选择条件： ①抗原或抗体必须单一特异性； ②抗原与抗体具有较高的亲和力； ③配体必须有一个适当的化学基团。
★抗原或抗体与支持物的结合： ①活化：溴化氰； ②接“手臂”：带“手臂”琼脂糖有氨
基琼脂糖、羧基琼脂糖、溴乙酰琼脂糖、 重氮盐衍生物琼脂糖、疏基琼脂糖。
★亲和层析条件的选择： ①封闭活性基团 ②除去未结合和结合不牢的蛋白 解脱剂： 3mol/L 硫氰酸钾（或钠）、 0.1mol/L pH2.4甘氨酸缓冲液
方法
差速离心
梯度密度离心
2.选择性沉淀法： 核酸去除法－氯化锰、鱼精蛋白 盐析法－硫酸铵、硫酸钠 有机溶剂沉淀法－乙醇、丙酮 聚合物沉淀法－聚乙二醇
盐析沉淀法
原理：利用各种蛋白质在不同浓度的盐溶液 中有不同的溶解度。
优点：方便、有效、不影响蛋白质活性 应用： 抗原的初筛
提取丙种球蛋白 抗原的浓缩
➢细菌抗原：菌体抗原
➢
鞭毛抗原
➢寄生虫体抗原：虫卵
血细胞抗原制备
细菌抗原制备: 多用液体或固体纯培养 物，经集菌后处理。
寄生虫和真菌抗原制备: 除用破碎法加 工粗提外，大多要加以适当纯化。
二、可溶性抗原
（一）组织和细胞可溶性抗原的粗提 ➢ 1.组织细胞抗原的制备：
➢ 高速捣碎法－组织捣碎机捣碎 ➢ 研磨法－用玻璃匀浆器或乳钵研磨
羧甲基纤维素 聚乙烯吡咯烷酮
2、半抗原与载体的连接方法
①物理方法 ②化学方法
碳化二亚胺法：
半抗原＋载体 蛋白质
人工免疫原
混合
搅拌1-2h
R-
室温24h
NH透=C析H除-R去’未反应 的半抗原
戊二醛法:
半抗原-NH2
OHC-(CH2)3-CHO
混合
载体蛋白NH2
半抗原-N=CH-
(CH2)3-CH=NH-载 体蛋白
➢ （1） 超声破碎法 ➢ （2）酶处理法 ➢ （3）反复冻融法 ➢ （4）表面活性剂处理法
（1）超声破碎法
原理：利用超声波的机械振动而使细胞破碎 特点：①操作简单，重复性较好，节省时间
②多用于微生物和组织细胞的破碎
（2）酶处理法
常用酶类：溶菌酶（碱性环境） 方法：EDTA--革兰氏阴性菌细胞壁 特点：①此法适用多种微生物；
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水溶性非离子型聚合物沉淀法
常用的聚合物： 聚乙二醇(PEG)、硫酸葡聚糖
应用： 3%-4% PEG沉淀免疫复合物 6%-7% PEG沉淀IgM 8%-12% PEG沉淀IgG 12%-15% PEG沉淀其他球蛋白 25% PEG沉淀白蛋白
3. 凝胶层析法
样品溶液缓慢流经凝胶柱时，大分子短 时间内被洗脱出来；小分子物质缓慢地流 出分子筛柱；通过凝胶的分子筛作用,大、 中、小三类分子彼此间较易分开。 特点：简单易行，但掌握不好，分离效果 较差。
②作用条件温和； ③内含物成分不易受到破坏；
④细胞壁损坏的程度可以控制。
（3）反复冻融法
原理：因突然冷冻，细胞内冰晶的形成及胞 内外溶剂浓度的突然改变而破坏细胞。
方法：将待破碎的细胞置冰箱内冻结，然后 置室温融化，如此反复两次，大部分组织细 胞及细胞内的颗粒可被融破。
特点：此法适用于组织细胞。
弗氏佐剂(Freund,s adjuvant)： 弗氏完全佐剂－羊毛脂 与液体石蜡的混合物 弗氏完全佐剂－弗氏不 完全佐剂加卡介苗
乳化方法： 研磨法和搅拌混合法
弗氏佐剂(Freund adjuvant) 液体石蜡 ＋ 羊毛脂 混合 弗氏不完全佐剂
抗原