基因工程制药1生物技术制药
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基因表达概念的示意图
• 一、宿主细胞的选择 • 宿主细胞应满足的要求：
• 分类：第一类为原核细胞，如大肠杆菌等；第二类为真核细 胞，如酵母等。
• 1、原核细胞 • （1）大肠杆菌：目前采用最多的原核表达体系。 • （2）枯草芽孢杆菌 • （3）链霉菌 • 2、真核细胞 • （1）酵母：酿酒酵母应用广泛。 • （2）丝状真菌 • （3）哺乳动物细胞
• 基因工程技术生产药物的优点：
• （1）利用基因工程技术可大量生产过去难以获得的生理活性蛋 白质和多肽，为临床使用提供有效保障；
• （2）可以提供足够数量的生理活性物质，以便对其生理、生化 和结构进行深入的研究，从而扩大这些物质的引用范围；
• （3）利用基因工程技术可以发现，挖掘更多的内源性生理活性 物质；
第三节 目的基因的获得
• 一、逆转录法 • 逆转录法是先分离纯化目的基因的mRNA，再反转录成
cDNA，然后进行cDNA的克隆表达。 • 1、mRNA的纯化 • mRNA的特点：3’末端含有一多聚腺苷酸组成的末端。 • 方法：亲和层析法 • 2、cDNA第一链的合成 • 一般 mRNA都带有3’－polyA，所以可以用寡聚dT作为
划生物技术领域第一个实现产业化的基因工程药物。
目前我国已批准12种基因工程药物和疫苗上市，在研 究开发中的也有10余种。
第二节 基因工程药物生产的基本过程
• 定义：基因工程技术是指将重组对象的目的基因插入载体，拼接后转 入新的宿主细胞，构建成工程菌（或细胞），实现遗传物质的重新组 合，并使目的基因再工程菌内进行复制和表达。
• 基因工程技术可生产的药物和制剂包括： • （1）免疫性蛋白，如各种抗原和单克隆抗体； • （2）细胞因子，如各种干扰素、白细胞介素、集落刺激生长因
子、表皮生长因子、凝血因子；
• （3）激素，如胰岛素、生长激素、心素纳； • （4）酶类，如尿激酶、链激酶、葡激酶、组织型纤维蛋白溶酶
原激活剂、超氧化物歧化酶。
• cDNA片段与载体的连接通常采用下面方法：
• 加同聚尾连接：在载体和cDNA的3’末端加上互补的 同型多聚酶序列。
• 人工接头连接：所谓人工接头是指用人工合成的、连 接在目的基因两端的含有某些限制酶切点的寡核苷酸 片断。
• 5、将重组体导入宿主细胞
• 6、 cDNA文库的鉴定
• 7、目的cDNA克隆的分离和鉴定
• 2、下游阶段：将实验室成果产业化、商品化，它 主要包括工程菌大规模发酵最佳参数大的确立，新 型生物反应器的研制，高效分离介质及装置的开发， 分离纯化的优化控制，高纯度纯品的制备技术，生 物传感器等一系列仪器仪表的设计和制造，电子计 算机的优化控制等。上述（4）、（5）、（6）、 （7）、（8）等属于下游阶段。
• 操作：见书 • 限制：一、不能合成太长的基因。
二、人工合成基因时，遗传密码的简并会为选 择密码子带来很大的困难。
三、费用高
第四节 基因表达
• 基因表达是指结构基因在生物体中的转录、翻译以及所有 加工过程。
• 基因表达研究是指外源基因在某种细胞中的表达活动，即 剪切下一个外源基因片断，拼接到另一个基因表达体系中， 使其能获得既有原生物活性又可高产的表达产物。
• （4）内源生理活性物质在作为药物使用存放的不足之处，可以 通过基因工程和蛋白质工程进行改造和去;
• （5）利用基因工程技术可获得新型化合物，扩大药物筛选来源。
• 我国基因工程药物研究和开发：起步较晚，基础较差。 α1b 型基因工程干扰素是由我国自行研制开发的具有
国际先进水平的生物高科技成果，于1997年 通过Ⅲ 期临床，并获得国家一类新药证书，成为“863”计
• （1）核酸探针杂交法
• （2）免疫反Βιβλιοθήκη Baidu鉴定法
• 逆转录－聚合酶反应法。该方法是mRNA经逆转录合 成cDNA第一链，不需再合成第二链，而是在特异引物 的协助下，用PCR法进行扩增，特异地合成目的cDNA 链，用于重组，克隆。
• 二、化学合成法
• 前提：较小的蛋白质或多肽的编码基因，必须知道目 的基因的核苷酸排列顺序，或知道目的蛋白质的氨基 酸顺序，再按相应的密码子推导出DNA的碱基序列。
引物，在逆转录酶的催化下，开始cDNA链的合成。 • 用放射性探针法检测。
• 3、cDNA第二链的合成
• 以cDNA第一链为模板合成第二链。
• 4、cDNA克隆
• 用于cDNA克隆的载体有两类：质粒DNA和噬菌体。又 将其分为表达型载体和非表达型载体。选用表达型载 体可以增加目的基因的筛选方法，有利于目的基因的 筛选。
第三章 基因工程制药
主讲 李校堃 温州医学院药学院生物制药教研室
第一节 概述
• 意义：自20世界70年代基因工程诞生以来，最先应用 基因工程技术且目前最为活跃的研究领域便是医药科学。 基因工程技术的迅猛发展使人们已能够十分方便有效地 生产许多以往难以大量获得的生物活性物质，甚至可以 创造出自然界中不存在的全新物质。1982年第一个基 因重组产品——人胰岛素在美国问世，吸引和激励了大 批科学家利用基因工程技术研制新药品，迄今累计已有 近30种基因工程药物投入市场，产生了巨大的社会效 益和经济效益。
• 真核生物和原核生物基因表达过程示意图
• 二、大肠杆菌中的基因表达 • 1、载体 • 表达载体必须具备的条件： • （1）载体能够独立的复制 • （2）具有灵活的克隆位点和方便的筛选标记 • （3）具有很强的启动子 • （4）具有阻遏子 • （5）有很强的终止子 • （6）有翻译的起始信号 • 常用的表达载体： • （1）pBV220系统 • （2）pET系统
• 基因工程药物制造的一般流程： • （1）获得目的基因；（2） 组建重组质粒；（3）构建基因工程菌；
（4）培养工程菌；（5）产物分离纯化；（6）除菌过滤；（7）半成 品检定；（8）包装。
• 1、上游阶段：首先获得目的基因，然后用限制性 内切酶和连接酶将其插入适当的载体质粒或噬菌体 中并转大肠杆菌或其它宿主菌（细胞），以便大量 复制目的基因。选择基因表达系统主要考虑的是保 证表达功能，其次要考虑的是表达量的多少和分离 纯化的难易。其中的（1）、（2）、（3）步骤属 于上游阶段，在实验室完成。
• 一、宿主细胞的选择 • 宿主细胞应满足的要求：
• 分类：第一类为原核细胞，如大肠杆菌等；第二类为真核细 胞，如酵母等。
• 1、原核细胞 • （1）大肠杆菌：目前采用最多的原核表达体系。 • （2）枯草芽孢杆菌 • （3）链霉菌 • 2、真核细胞 • （1）酵母：酿酒酵母应用广泛。 • （2）丝状真菌 • （3）哺乳动物细胞
• 基因工程技术生产药物的优点：
• （1）利用基因工程技术可大量生产过去难以获得的生理活性蛋 白质和多肽，为临床使用提供有效保障；
• （2）可以提供足够数量的生理活性物质，以便对其生理、生化 和结构进行深入的研究，从而扩大这些物质的引用范围；
• （3）利用基因工程技术可以发现，挖掘更多的内源性生理活性 物质；
第三节 目的基因的获得
• 一、逆转录法 • 逆转录法是先分离纯化目的基因的mRNA，再反转录成
cDNA，然后进行cDNA的克隆表达。 • 1、mRNA的纯化 • mRNA的特点：3’末端含有一多聚腺苷酸组成的末端。 • 方法：亲和层析法 • 2、cDNA第一链的合成 • 一般 mRNA都带有3’－polyA，所以可以用寡聚dT作为
划生物技术领域第一个实现产业化的基因工程药物。
目前我国已批准12种基因工程药物和疫苗上市，在研 究开发中的也有10余种。
第二节 基因工程药物生产的基本过程
• 定义：基因工程技术是指将重组对象的目的基因插入载体，拼接后转 入新的宿主细胞，构建成工程菌（或细胞），实现遗传物质的重新组 合，并使目的基因再工程菌内进行复制和表达。
• 基因工程技术可生产的药物和制剂包括： • （1）免疫性蛋白，如各种抗原和单克隆抗体； • （2）细胞因子，如各种干扰素、白细胞介素、集落刺激生长因
子、表皮生长因子、凝血因子；
• （3）激素，如胰岛素、生长激素、心素纳； • （4）酶类，如尿激酶、链激酶、葡激酶、组织型纤维蛋白溶酶
原激活剂、超氧化物歧化酶。
• cDNA片段与载体的连接通常采用下面方法：
• 加同聚尾连接：在载体和cDNA的3’末端加上互补的 同型多聚酶序列。
• 人工接头连接：所谓人工接头是指用人工合成的、连 接在目的基因两端的含有某些限制酶切点的寡核苷酸 片断。
• 5、将重组体导入宿主细胞
• 6、 cDNA文库的鉴定
• 7、目的cDNA克隆的分离和鉴定
• 2、下游阶段：将实验室成果产业化、商品化，它 主要包括工程菌大规模发酵最佳参数大的确立，新 型生物反应器的研制，高效分离介质及装置的开发， 分离纯化的优化控制，高纯度纯品的制备技术，生 物传感器等一系列仪器仪表的设计和制造，电子计 算机的优化控制等。上述（4）、（5）、（6）、 （7）、（8）等属于下游阶段。
• 操作：见书 • 限制：一、不能合成太长的基因。
二、人工合成基因时，遗传密码的简并会为选 择密码子带来很大的困难。
三、费用高
第四节 基因表达
• 基因表达是指结构基因在生物体中的转录、翻译以及所有 加工过程。
• 基因表达研究是指外源基因在某种细胞中的表达活动，即 剪切下一个外源基因片断，拼接到另一个基因表达体系中， 使其能获得既有原生物活性又可高产的表达产物。
• （4）内源生理活性物质在作为药物使用存放的不足之处，可以 通过基因工程和蛋白质工程进行改造和去;
• （5）利用基因工程技术可获得新型化合物，扩大药物筛选来源。
• 我国基因工程药物研究和开发：起步较晚，基础较差。 α1b 型基因工程干扰素是由我国自行研制开发的具有
国际先进水平的生物高科技成果，于1997年 通过Ⅲ 期临床，并获得国家一类新药证书，成为“863”计
• （1）核酸探针杂交法
• （2）免疫反Βιβλιοθήκη Baidu鉴定法
• 逆转录－聚合酶反应法。该方法是mRNA经逆转录合 成cDNA第一链，不需再合成第二链，而是在特异引物 的协助下，用PCR法进行扩增，特异地合成目的cDNA 链，用于重组，克隆。
• 二、化学合成法
• 前提：较小的蛋白质或多肽的编码基因，必须知道目 的基因的核苷酸排列顺序，或知道目的蛋白质的氨基 酸顺序，再按相应的密码子推导出DNA的碱基序列。
引物，在逆转录酶的催化下，开始cDNA链的合成。 • 用放射性探针法检测。
• 3、cDNA第二链的合成
• 以cDNA第一链为模板合成第二链。
• 4、cDNA克隆
• 用于cDNA克隆的载体有两类：质粒DNA和噬菌体。又 将其分为表达型载体和非表达型载体。选用表达型载 体可以增加目的基因的筛选方法，有利于目的基因的 筛选。
第三章 基因工程制药
主讲 李校堃 温州医学院药学院生物制药教研室
第一节 概述
• 意义：自20世界70年代基因工程诞生以来，最先应用 基因工程技术且目前最为活跃的研究领域便是医药科学。 基因工程技术的迅猛发展使人们已能够十分方便有效地 生产许多以往难以大量获得的生物活性物质，甚至可以 创造出自然界中不存在的全新物质。1982年第一个基 因重组产品——人胰岛素在美国问世，吸引和激励了大 批科学家利用基因工程技术研制新药品，迄今累计已有 近30种基因工程药物投入市场，产生了巨大的社会效 益和经济效益。
• 真核生物和原核生物基因表达过程示意图
• 二、大肠杆菌中的基因表达 • 1、载体 • 表达载体必须具备的条件： • （1）载体能够独立的复制 • （2）具有灵活的克隆位点和方便的筛选标记 • （3）具有很强的启动子 • （4）具有阻遏子 • （5）有很强的终止子 • （6）有翻译的起始信号 • 常用的表达载体： • （1）pBV220系统 • （2）pET系统
• 基因工程药物制造的一般流程： • （1）获得目的基因；（2） 组建重组质粒；（3）构建基因工程菌；
（4）培养工程菌；（5）产物分离纯化；（6）除菌过滤；（7）半成 品检定；（8）包装。
• 1、上游阶段：首先获得目的基因，然后用限制性 内切酶和连接酶将其插入适当的载体质粒或噬菌体 中并转大肠杆菌或其它宿主菌（细胞），以便大量 复制目的基因。选择基因表达系统主要考虑的是保 证表达功能，其次要考虑的是表达量的多少和分离 纯化的难易。其中的（1）、（2）、（3）步骤属 于上游阶段，在实验室完成。