原核表达详细步骤
原核表达步骤
Chi l 原核表达基本试验步骤将克隆化基因插入合适载体后导入大肠杆菌用于表达大量蛋白质的方法一般称为原核表达。
这种方法在蛋白纯化、定位与功能分析等方面都有应用。
大肠杆菌用于表达重组蛋白有以下特点：易于生长和控制；用于细菌培养的材料不与哺乳动物细胞系统的材料昂贵；有各种各样的大肠杆菌菌株与与之匹配的具各种特性的质粒可供选择。
但是，在大肠杆菌中表达的蛋白由于缺少修饰和糖基化、磷酸化等翻译后加工，常形成包涵体而影响表达蛋白的生物学活性与构象。
表达载体在基因工程中具有十分重要的作用，原核表达载体通常为质粒，典型的表达载体应具有以下几种元件：（1）选择标志的编码序列；（2）可控转录的启动子；（3）转录调控序列(转录终止子，核糖体结合位点)；（4）一个多限制酶切位点接头；（5）宿主体内自主复制的序列。
原核表达一般程序如下：获得目的基因－准备表达载体－将目的基因插入表达载体中（测序验证）－转化表达宿主菌－诱导靶蛋白的表达－表达蛋白的分析－扩增、纯化、进一步检测，其中包括：一、试剂准备（1）LB培养基。
（2）1M IPTG（异丙基硫代-β-D-半乳糖苷）：2.38g IPTG溶于10ml ddH2O中,0.22μm滤膜抽滤，-20℃保存。
CCY的IPTG是1M的，用时进行1000倍稀释。
二、操作步骤（一）获得目的基因1、通过PCR方法：以含目的基因的克隆质粒为模板，按基因序列设计一对引物（在上游和下游引物分别引入不同的酶切位点），PCR循环获得所需基因片段。
2、通过RT-PCR方法：用TRIzol法从细胞或组织中提取总RNA，以mRNA为模板，逆转录形成cDNA第一链，以逆转录产物为模板进行PCR循环获得产物。
（二）构建重组表达载体1、载体酶切：将表达质粒用限制性内切酶（同引物的酶切位点）进行双酶切，酶切产物行琼脂糖电泳后，用胶回收Kit或冻融法回收载体大片段。
2、PCR产物双酶切后回收，在T4DNA连接酶作用下连接入载体。
原核表达和真核表达
原核表达和真核表达原核表达的步骤和主要试剂1、获得目的基因；2、构建重组表达载体；3、获得含重组表达质粒的表达菌种；4、诱导表达；5、包涵体的分离。
获得目的基因 PCR法钓基因引物（捷瑞），普通taq酶（Regene，Fermentas）/Pfu酶（Fermentas）/Hotstart Taq酶（Fermentas）,dNTP(Regene，Fermentas)RT-PCR法获取基因Trizol（Invitrogen，捷瑞），DEPC（捷瑞或其他进分），Rnase抑制剂（MBI），M-MLV/AMV（Fermentas）或M-MLV/AMV一步法RT-PCR试剂盒（捷瑞、Qiagen、Axygen、Omega）构建重组表达载体 内切酶（Fermentas），载体（捷瑞，Fermentas），琼脂糖（西班牙），T4连接酶（Fermentas，promega），测序获得含重组表达质粒的表达菌种 菌株（捷瑞），质粒小抽试剂盒（捷瑞、Qiagen、Axygen），感受态细胞制备试剂盒（捷瑞），抗生素（捷瑞，Amresco，sigma），测序（伟沃）诱导表达 IPTG（捷瑞，Amresco，sigma），胰蛋白胨（Oxiod），酵母粉（Oxiod），琼脂（进分，国产）包涵体的分离 Triton X -100（捷瑞，进分），PMSF(sigma)，DTT （Amresco，进分），尿素（Amresco，进分，sigma）,还原型谷胱甘肽（Amresco，进分，sigma）真核表达蛋白质在真核表达的过程中，可以通过真核细胞的转录加工系统获得具有一定构象和生物活性的蛋白质。
真核表达现在主要有毕赤酵母表达体系、杆状病毒昆虫细胞表达体系、哺乳动物细胞表达体系。
各种表达系统各有其优缺点，酵母和昆虫细胞表达系统蛋白表达水平高，生产成本低，但它们的加工修饰体系与哺乳动物细胞不完全相同；哺乳动物细胞产生的蛋白质更接近于天然蛋白质，但其表达量低、操作繁琐。
原核表达步骤
原核表达步骤原核表达是指在原核生物体内将基因转录成RNA，再将RNA翻译成蛋白质的过程。
本文将详细介绍原核表达的步骤。
1. 转录DNA的双链结构被酶RNA聚合酶解开，从而形成mRNA链。
RNA聚合酶沿着DNA模板链移动，将mRNA链合成在一起。
在这个过程中，RNA聚合酶根据DNA模板链上的碱基序列，选择正确的核苷酸，将其加入到正在合成的mRNA链上。
2. 剪接在细胞核内，mRNA链是在原核生物上转录的。
这些mRNA链可能包含顺式调节区域（UTR）和内含子区域。
在剪接过程中，内含子被剪除，UTR被保留下来。
这个过程由小核RNA（snRNA）和蛋白质共同完成。
3. 翻译翻译是将mRNA链转化为氨基酸序列的过程。
翻译是在核糖体中完成的。
核糖体是由rRNA和蛋白质组成的复合体。
核糖体通过识别mRNA上的起始密码子来开始翻译过程。
起始密码子是AUG。
核糖体将氨基酸连接在一起，直到遇到终止密码子。
终止密码子分别是UAA，UAG和UGA。
翻译完成后，成品蛋白被释放出来。
4. 后翻译修饰在翻译完成后，蛋白质可能需要进行后翻译修饰。
这些修饰可以包括磷酸化，甲基化，硫化，酰化和糖基化等。
这些修饰可以改变蛋白质的结构和功能，从而影响其生物学活性。
5. 折叠蛋白质被合成后，需要进一步折叠成其最终形态。
这个过程由分子伴侣和蛋白酶等分子机器完成。
分子伴侣可以协助蛋白质正确地折叠。
蛋白酶可以降解不正确折叠的蛋白质，防止它们对细胞造成损害。
6. 定位在折叠完成后，蛋白质需要被定位到其最终的位置。
这个过程由信号肽和其他分子机器完成。
信号肽是一段氨基酸序列，可以将蛋白质定位到细胞膜，内质网，线粒体等亚细胞结构中。
原核表达是一个复杂的过程，包括转录，剪接，翻译，后翻译修饰，折叠和定位。
这些步骤需要各种不同的分子机器和分子信号来协同完成。
理解原核表达的步骤可以帮助我们更好地理解生物学过程，从而为生命科学的研究和应用提供基础。
原核表达的详细步骤
原核表达详细步骤PartⅠ选择表达的目的基因一、基因序列1. 得到靶基因DNA（cDNA）序列，有几种方式寻找正确的读码顺序:①利用生物信息学在NCBI上blast同源基因，找到同源蛋白，再在DNA的ORF中找到正确的读码。
②实验方法，即得到蛋白，进行测序，然后在DNA上找到正确的读码。
③利用mRNA的特征，找到启动子，编码区，终止子。
在编码区中找到翻译起始密码子与终止密码子（cDNA）。
2. 注意事项：①区别ORF和CDS→ORF一般在DNA上的定义，寻找原则是翻译起始密码子和终止密码子；CDS可以是DNA上的定义，也可以是mRNA上的定义，分为complete CDS 和partial CDS,是从第一个核酸开始读，连续读下去，complete CDS读码是“M、、、、、、、、、＊”，partial CDS的读码是相应的AA②在进行试验设计时，充分利用生物信息学的信息后，在进行试验设计。
二、抗原决定簇的预测1、原理：蛋白质表面部分可以使免疫系统产生抗体的区域叫抗原决定簇。
一般抗原决定簇是由6－12 氨基酸或碳水基团组成，它可以是由连续序列（蛋白质一级结构）组成或由不连续的蛋白质三维结构组成。
变性蛋白只是天然蛋白伸直的了产物，用来免疫动物具有更强的抗原性。
只是天然蛋白中被包在内部的抗原决定簇也会暴露出来，如果用该变性抗原制备的抗体来检测变性抗原是可以的，如果用来检测天然蛋白，可能会有假阳性。
做单抗也可以，同样道理，筛选出的单抗可能对抗的抗原决定簇处于天然抗原的内部，是否能用还要看将来该单抗用来干什么。
2、选择原则：（1）、亲水性：大部分抗原决定簇是亲水性的。
（2）、处于结构表面：大部分抗体只与蛋白质表面部分结合。
（3）、有弹性：许多已知的抗原决定簇是在自由活动区域。
所以一般来说蛋白质的N 端及C 端是很好的抗原决定簇区域。
3、选定抗原决定簇的步骤：（1）预测：如软件预测DNAstar（Protean）预测，Dnaman。
原核表达的详细步骤
原核表达详细步骤PartⅠ选择表达的目的基因一、基因序列1. 得到靶基因DNA（cDNA)序列,有几种方式寻找正确的读码顺序：①利用生物信息学在NCBI上blast同源基因，找到同源蛋白，再在DNA的ORF中找到正确的读码。
②实验方法，即得到蛋白,进行测序,然后在DNA上找到正确的读码。
③利用mRNA的特征，找到启动子，编码区，终止子.在编码区中找到翻译起始密码子与终止密码子(cDNA）。
2. 注意事项：①区别ORF和CDS→ORF一般在DNA上的定义，寻找原则是翻译起始密码子和终止密码子；CDS可以是DNA上的定义,也可以是mRNA上的定义,分为complete CDS 和partial CDS，是从第一个核酸开始读，连续读下去，complete CDS读码是“M、、、、、、、、、＊”,partial CDS的读码是相应的AA②在进行试验设计时，充分利用生物信息学的信息后，在进行试验设计。
二、抗原决定簇的预测1、原理:蛋白质表面部分可以使免疫系统产生抗体的区域叫抗原决定簇。
一般抗原决定簇是由6－12 氨基酸或碳水基团组成，它可以是由连续序列（蛋白质一级结构）组成或由不连续的蛋白质三维结构组成。
变性蛋白只是天然蛋白伸直的了产物，用来免疫动物具有更强的抗原性.只是天然蛋白中被包在内部的抗原决定簇也会暴露出来,如果用该变性抗原制备的抗体来检测变性抗原是可以的，如果用来检测天然蛋白,可能会有假阳性.做单抗也可以,同样道理,筛选出的单抗可能对抗的抗原决定簇处于天然抗原的内部，是否能用还要看将来该单抗用来干什么。
2、选择原则：（1）、亲水性:大部分抗原决定簇是亲水性的。
(2)、处于结构表面:大部分抗体只与蛋白质表面部分结合。
（3）、有弹性：许多已知的抗原决定簇是在自由活动区域。
所以一般来说蛋白质的N 端及C 端是很好的抗原决定簇区域。
3、选定抗原决定簇的步骤：（1）预测：如软件预测DNAstar（Protean)预测，Dnaman.在线网站预测(http：//www-bimas。
原核表达步骤总结
原核表达步骤总结原核表达步骤原核表达先要将基因克隆到原核表达载体上，然后通过转化到JM109或BL21等菌株中，诱导表达蛋⽩，然后进⾏蛋⽩纯化。
本实验⽅案的前提是，⽬的基因已克隆到载体，并已转进⼊JM109菌株中。
1．鉴定⽬的蛋⽩是否在⼤肠杆菌JM109或BL21中⼤量表达（1）制样1 . 挑取经过双酶切鉴定的单克隆菌落于700ul LB培养基，加⼊0.7ul Amp（100mg/mL），37o C200r/min摇床培养，过夜活化。
2. 以1：50⽐例（200ul），将活化的过夜培养物加⼊10mL LB液体培养基中，加⼊10uLAmp（100mg/ml），37o C200r/min 摇床扩⼤培养2h-3h，期间取样监控菌液的OD值，控制菌液OD600在0.6-1.0之间，以使⼤肠杆菌处于最适合表达外源蛋⽩的⽣长状态。
(⼀般3h时，菌液浓度及达到标准，但是不同的基因对菌的影响不同，所以第⼀次实验时需要确定这个最佳时间)3. 从10ml扩⼤培养物中取3ml菌液作为不加IPTG的空⽩对照（CK），其余7ml菌液加⼊7ul IPTG（储存浓度为0.5mol/l），使IPTG 终浓度达到0.5mmol/l。
以200r/min的转速，37o C摇床培养3h。
4. 以5000r/min离⼼2min收集菌体，倾倒上清，每个离⼼管收集3ml培养物。
5. 加⼊1ml dH2O，将管底沉淀⽤振荡器打散以充分洗涤，8000r/min 离⼼2min，倾倒上清。
6. 重复步骤5。
将离⼼管中的⽔倒⼲净。
（⼆）菌落SDS-PAGE1. 在收集的菌体中加⼊200ul 1×SDS PAGE loading buffer(可根据沉淀的量增加或减少loading buffer的量，⼀般200ul⽐较合适)。
⽤漩涡器剧烈震荡，确保将管底沉淀震散。
2. 将样品于100℃恒温加热器上开盖加热10min（Marker也要加热）。
样品凉后，12000r/min离⼼3min，取每管的上清点样。
原核表达实验流程
二．DＮA连接和转化
基本原理
Ｔ4ＤNA连接酶最初分离于T4噬菌体感染的大肠杆菌，可催化DＮA5’磷酸基与3’羟基之间形成磷酸二酯键。在本试验中,将克隆载体pGEM-Ｔ与外源DNA片段用T4连接酶连接，可将外源DNA片段插入ｐGＥM-T质粒中，构建外源DNA的克隆载体。
质粒的转化是指将质粒或以它为载体构建的重组子导入细菌的过程。将连接产物转化到感受态细胞中，实现重组克隆的增殖，便于后续分子操作。可以采用多种方法筛选和鉴定目的克隆。
(６)４℃用JＡ转头(或与之相当的转头)以2500rpｍ／ｍiｎ离心2０miｎ,以回收细胞。倒去培养液,用2５mＬ冰冷的10%甘油重悬沉淀。(甘油有保存细胞的作用)
（7）4℃用ＪA转头（或与之相当的转头)以2500rpm／ｍin离心20ｍiｎ，以回收细胞。倒去培养液，用1mL冰冷的１0％甘油重悬沉淀。(倾倒培养液时要小心，１0%甘油中的细菌沉淀附着力降低。)
(阳性）转化细胞１
酶切，获取目的基因
Peｔa／DH5a载体
重组
重组载体２
第二步
重组载体2DＨ5a感受态细胞
转化
转化细胞2
抽取质粒进行电泳
酶切验证检验阳性
(阳性）转化重组载体３
BL21感受态细胞
转化细胞３
诱导表达
蛋白质提取
SDＳ-ＰAＧＥ电泳检测呈阳性
目的蛋白
一.感受细胞的制备
体外连接的ＤNA重组分子导入合适的受体细胞才能大量增殖。为了提高受体菌摄取外源ＤNA的能力,提高转化效率以获得更多的转化子，人们摸索出了不同的方法处理细菌，使其处于感受态。目前主要采用电转化法和CａCl２ 法将外源ＤＮA导入受体细胞中，并需要相应地制备电转化感受态细胞和CaＣl2感受态细胞。本实验制备的是电转化感受态细胞。
原核表达步骤
3、重组蛋白所处的环境:发酵温度高或胞内pH接近蛋白的等电点时容易形成包涵体。
CCＹ的IPＴG是1M的,用时进行１０00倍稀释。ﻫ二、操作步骤ﻫ（一)获得目的基因
1、通过PCＲ方法：以含目的基因的克隆质粒为模板，按基因序列设计一对引物（在上游和下游引物分别引入不同的酶切位点），PＣR循环获得所需基因片段。ﻫ2、通过RT-ＰCR方法:用TＲIｚoｌ法从细胞或组织中提取总ＲNA，以mＲNA为模板，逆转录形成cDNＡ第一链,以逆转录产物为模板进行PＣＲ循环获得产物。
1２、用３mｌ 含40０ｍM咪唑洗脱目的蛋白。
１3、镍柱用20%的乙醇适量，4℃保存。
1４、SDS-ＰAGＥ电泳检测蛋白纯化效果（上柱前样本,上柱后样本，杂蛋白，目的蛋白，未诱导蛋白）
附相关试剂配制：
50mＭ ＰBS
NａＨ2PO4.2H2O 1．48g
Na2ＨＰO４.１2Ｈ２Ｏ 14.５046g
NａＣL 29.3g
表达载体在基因工程中具有十分重要的作用,原核表达载体通常为质粒，典型的表达载体应具有以下几种元件:ﻫ(1）选择标志的编码序列；
(2）可控转录的启动子；ﻫ（3)转录调控序列(转录终止子,核糖体结合位点);
(４）一个多限制酶切位点接头;ﻫ(5）宿主体内自主复制的序列。
原核表达一般程序如下：获得目的基因－准备表达载体－将目的基因插入表达载体中(测序验证）-转化表达宿主菌－诱导靶蛋白的表达-表达蛋白的分析－扩增、纯化、进一步检测,其中包括：ﻫ一、试剂准备ﻫ(1）ＬB培养基。ﻫ(2）1M IPTG（异丙基硫代-β-D-半乳糖苷）:2.３8g ＩPTG溶于１０ml ｄｄH2Ｏ中,0.22μm滤膜抽滤,-20℃保存。
原核表达操作步骤及注意事项
原核表达操作步骤及注意事项时间：2010-03-03 14:05:01 来源：作者：点击：1046次将克隆化基因插入合适载体后导入大肠杆菌用于表达大量蛋白质的方法一般称为原核表达。
这种方法在蛋白纯化、定位及功能分析等方面都有应用。
大肠杆菌用于表达重组蛋白有以下特点：易于生长和控制；用于细菌培养的材料不及哺乳动物细胞系统的材料昂贵；有各种各样的大肠杆菌菌株及与之匹配的具各种特性的质粒可供选择。
但是，在大肠杆菌中表达的蛋白由于缺少修饰和糖基化、磷酸化等翻译后加工，常形成包涵体而影响表达蛋白的生物学活性及构象。
表达载体在基因工程中具有十分重要的作用，原核表达载体通常为质粒，典型的表达载体应具有以下几种元件：（1）选择标志的编码序列；（2）可控转录的启动子；（3）转录调控序列(转录终止子，核糖体结合位点)；（4）一个多限制酶切位点接头；（5）宿主体内自主复制的序列。
原核表达一般程序如下：获得目的基因－准备表达载体－将目的基因插入表达载体中（测序验证）－转化表达宿主菌－诱导靶蛋白的表达－表达蛋白的分析－扩增、纯化、进一步检测一、试剂准备1、LB培养基。
2、100mM IPTG（异丙基硫代-β-D-半乳糖苷）：2.38g IPTG溶于100ml ddH2O中，μm滤膜抽滤，-20℃保存。
二、操作步骤（一）获得目的基因1、通过PCR方法：以含目的基因的克隆质粒为模板，按基因序列设计一对引物（在上游和下游引物分别引入不同的酶切位点），PCR循环获得所需基因片段。
2、通过RT-PCR方法：用TRIzol法从细胞或组织中提取总RNA，以mRNA为模板，逆转录形成cDNA第一链，以逆转录产物为模板进行PCR循环获得产物。
（二）构建重组表达载体1、载体酶切：将表达质粒用限制性内切酶（同引物的酶切位点）进行双酶切，酶切产物行琼脂糖电泳后，用胶回收Kit或冻融法回收载体大片段。
2、PCR产物双酶切后回收，在T4DNA连接酶作用下连接入载体。
原核表达步骤
原核表达步骤一、转录（Transcription）转录是指DNA转录为RNA的过程，即DNA的信息通过RNA的合成而表达出来。
转录是生物体中基因表达的第一步，也是生物体合成蛋白质的关键步骤之一。
在原核生物中，转录过程分为三个阶段：启动、延伸和终止。
启动阶段是指RNA聚合酶（RNA polymerase）与DNA的结合，并在DNA上找到起始转录位点。
延伸阶段是指RNA聚合酶沿DNA模板链向下滑动，并合成RNA链。
终止阶段是指RNA聚合酶在遇到终止信号时停止转录，释放出合成的RNA链。
二、剪接（Splicing）剪接是指在转录过程中，将RNA前体分子中的内含子（intron）剪切除去，将外显子（exon）连接起来的过程。
原核生物中的剪接方式相对简单，通常是直接将外显子连接起来，形成成熟的RNA分子。
剪接的主要作用是消除内含子的干扰，使RNA分子能够直接参与翻译过程。
通过剪接，原核生物能够快速生成成熟的RNA分子，提高基因表达效率。
三、翻译（Translation）翻译是指将RNA的信息翻译成蛋白质的过程。
在原核生物中，翻译过程发生在核糖体（ribosome）中，涉及到mRNA、tRNA和rRNA等多种分子。
翻译分为三个主要步骤：启动、延伸和终止。
启动阶段是指核糖体与mRNA的结合，并识别起始密码子（AUG）位置。
延伸阶段是指核糖体沿mRNA滑动，将氨基酸依次加入正在合成的多肽链中。
终止阶段是指核糖体在遇到终止密码子（UAA、UAG、UGA）时停止翻译，释放合成的多肽链。
四、调控（Regulation）调控是指控制基因表达水平的过程，包括转录调控和翻译调控两个方面。
原核生物通过调控转录和翻译过程中的各个环节来实现基因表达的精确调控。
转录调控主要通过转录因子（transcription factor）和启动子（promoter）之间的相互作用来实现。
转录因子能够结合到启动子上，促进或抑制RNA聚合酶的结合，从而调控基因的转录水平。
原核表达实验
原核表达操作流程实验概要本实验介绍了原核表达的具体操作流程，包括：外源基因的诱导表达，大肠杆菌包涵体的分离与蛋白质纯化。
实验原理1. E. coli 表达系统E. coli 是重要的原核表达体系。
在重组基因转化入E. coli 菌株以后，通过温度的控制，诱导其在宿主菌内表达目的蛋白质，将表达样品进行SDS-PAGE 以检测表达蛋白质。
2. 外源基因的诱导表达提高外源基因表达水平的基本手段之一，就是将宿主菌的生长与外源基因的表达分成两个阶段，以减轻宿主菌的负荷。
常用的有温度诱导和药物诱导。
本实验采用异丙基硫代-β-D-半乳糖昔（IPTG）诱导外源基因表达。
不同的表达质粒表达方法并不完全相同，因启动子不同，诱导表达要根据具体情况而定。
主要试剂1. 诱导表达材料1) LB （Luria—Bertani）)培养基酵母膏 (Yeast extract) 5g 蛋白胨 (Peptone) 10gNaCl 10g 琼脂 (Agar) 1-2%蒸馏水 (Distilled water) 1000ml pH 7.0适用范围：大肠杆菌2) IPTG 贮备液：2 g IPTG溶于10 mL 蒸馏水中，0 . 22 μm 滤膜过滤除菌，分装成1 mL /份，－20 ℃保存。
3) l×凝胶电泳加样缓冲液：50 mmol / L Tris -CI ( pH 6 . 8 )50 mmol / L DTT2 % SDS （电泳级）0.1 ％溴酚蓝10 ％甘油2. 大肠杆菌包涵体的分离与蛋白纯化材料1) 酶溶法a. 裂解缓冲液：50 mmol / L Tris-CI ( pH 8 . 0 )1 mmol / L EDTA100 mmol / LNaClb. 50 mmol / L 苯甲基磺酰氟（PMSF ）。
c. 10 mg / mL 溶菌酶。
d. 脱氧胆酸。
e. 1 mg / mL DNase I。
2) 超声破碎法a. TE 缓冲液。
原核表达及纯化方法
原核表达及纯化-His tag一、原核表达1.挑取一个单菌落（重组表达载体），接种到10mL LB培养基中（注意抗生素抗性）。
37℃，过夜摇菌。
2.次日，将菌液接种到1L LB培养基中（1:50~1:100），继续培养至OD600=0.6时（0.6~0.8），加1×IPTG诱导4h。
（加IPTG前留样（诱导前全菌蛋白）200μL做SDS-PAGE）3.收菌：(1)200μL诱导后全菌；(2)小量表达：收集5mL诱导后全菌，12000g离心1min，裂解沉淀，分别收集上清（可溶性）和沉淀（包涵体）中的蛋白。
大量表达：收集1L诱导后全菌，4℃，4500g离心15~30min。
二、可溶性分析目的：重组蛋白是否表达，是可溶性的还是包涵体形式。
根据这个结果选择纯化方法。
（1）各用30μL 4×SDS Loading buffer重悬诱导前和诱导后的菌体（200μL）；用500μL 1×Binding Buffer重悬菌体（5mL），超声破碎（3min，超2s，挺3s，27%能量；溶液透亮即可）；4℃，19000g离心15min，分离上清和沉淀；（2）用30μL 4×SDS Loading buffer重悬沉淀；（3）取10μL上清蛋白加10μL 4×SDS Loading buffer；（4）将诱导前全菌，诱导后全菌，上清蛋白和包涵体蛋白煮沸5~10min。
（5）各取10μL 用于SDS-PAGE检测（12%的胶）。
三、小量富集实验样品制备：取5mL诱导全菌，用500μL 1×Binding Buffer（8M Urea）溶解，超声破碎（3min，超2s，挺3s，27%能量；溶液透亮即可）。
4℃，19000g离心15min，取上清用于富集实验。
（留样做SDS-PAGE）富集：1.装柱：取30μL~50μL体积的Ni柱料（纯柱料）于1.5mL离心管中。
原核表达实验技术
TAKARA DNA凝胶回收试剂盒1. 切胶：先用酒精灯消毒手术刀，在酶切仪中切胶，把片段放入1.5ml管中，用枪头搅碎。
2. 加GM试剂溶胶：加入700--800ul左右的GM，放进45℃水浴锅中溶胶。
3. 拿新的过滤柱和离心管，转移溶胶后液体进过滤柱，12000rpm.1min离心，把滤液重新倒进过滤柱，同样离心，后弃滤液。
4. 加WB（加乙醇）清洗：向过滤柱中心加700ulWB，同样条件下离心两次，弃滤液，最后空离30s。
5. 换新的1.5ml离心管，把柱子放入，加30ul的Elution Buffer/DDH2O.（注意要加在中央，不要碰壁）6. 离心1min，把滤液重新加入到过滤柱中，再离心，得到溶解的DNA液体，弃柱子。
7. 保存：-20℃LB培养液制备（1000ml）1. 称量：10g胰蛋白胨粉，5g酵母提取物，10gNacl于玻璃瓶，加DDH2O 1000ml。
2. 灭菌：把盖子拧松，高压蒸汽灭菌121℃，20min。
3. 置室温降温，后放4℃保存。
LB固体培养基制备1. 向100ml的液培中加入1.5g琼脂粉，高压灭菌20min。
2. 抗生素贮存液：卡那霉素（Kan）贮存液50 mg/ml、氨苄西林（Amp）贮存液100 mg/ml (均经过0.22µm 滤膜过滤除菌），-20℃储存，使用浓度卡那（k+）0.05mg/ml，氨苄（A+）0.1mg/ml。
3. 取出培养液，待其温度降至45—50℃时（不烫手），按照1:1000比例加入抗生素，充分混匀。
4. 倒入6cm一次性培养皿中，静置30—60min（等待平板冷却）。
5. 封口胶封口，倒置保存在4℃，期限为30D。
纯化PCR 产物（胶回收）（天根试剂盒）1. 在紫外灯下准确切取含有目的DNA片段的凝胶（体积尽可能小），放入干净的1.5 ml EP 管（预先称取空管重量）中，称取凝胶的重量。
2. 按每0.1 g凝胶加入100 ul PC溶液的比例往EP管中加入溶液PC，50℃水浴放置约10 min，期间不断温和晃动，确保凝胶完全溶解，此时溶液呈现黄色。
原核表达步骤
悬细菌。超声破碎（300W4 S/4S,99次）。超声后液体变清澈。超声时 探头离管底一定距离，防止管破裂。
&12000g, 10mi n,取上清作为待纯化的样品。
9、 混匀镍柱，根据培养物及表达水平装柱2ml（加膜防镍柱漏），用三 个柱床体积50mM PBS（不可溶细菌加8M尿素50mM PBS平衡柱子
原剂使二硫键正常形成。一般在尿素浓度4M左右时复性过程开始，到2M左右时结束。对于
盐酸胍而言，可以从4M开始，到1.5M时复性过程已经结束。
复性中常采用的方法有： 稀释复性：直接加入水或缓冲液，放置过夜，缺点是体积增加较大，变性剂稀释速度太快， 不易控制。
透析复性： 好处是不增加体积， 通过逐渐降低外透液浓度来控制变性剂去除速度， 有人称易 形成沉淀，且不适合大规模操作，无法应用到生产规模。
1可溶性蛋白在细胞容易受到蛋白酶的攻击，包涵体表达可以避免蛋白酶对外源蛋白的降 解。
2、降低了胞外源蛋白的浓度，有利于表达量的提高。
3、包涵体中杂蛋白含量较低，且只需要简单的低速离心就可以与可溶性蛋白分离，有利于 分离纯化。
4、对机械搅拌和超声破碎不敏感，易于破壁，并与细胞膜碎片分离。
分离：
1离心：5000-20000g15min离心，可使大多数包涵体沉淀，与可溶性蛋白分离。
杆菌中表达的蛋白由于缺少修饰和糖基化、磷酸化等翻译后加工，常形
成包涵体而影响表达蛋白的生物学活性及构象。
表达载体在基因工程中具有十分重要的作用， 原核表达载体通常为质粒， 典型的表达载体应具有以下几种元件：
（1）选择标志的编码序列；
（2）可控转录的启动子；
原核表达步骤
1.引物的设计及合成2.基因的克隆: PCR反应PCR产物的回收和纯化PCR产物的酶切3.质粒pET-32a的扩增、提取及酶切接种含有pET-32a空质粒的DH5α的菌株至LB (含有Amp l00ug/mL)中，37℃培养过夜。
取5mL菌液，按质粒提取试剂盒说明书提取质粒，酶切提取出的质粒，-20℃保存。
4.重组原核表达质粒的构建：4.1重组质粒的连接4.2感受态细胞的制备和转化：参照《分子克隆实验指南》的方法进行BL21感受态细胞的制备[16]。
在平板上挑取新鲜的BL21菌落，接种到5mLLB培养基中，37℃振荡培养2~5h，OD600达到0.35～0.5之间，取l～2mL菌液于无菌离心管中，冰上放置至0℃，4℃、5000 rpm离心5min，弃上清，用200uL CaCl2(0.1M)重悬，冰上放置30min，4℃、5000 rpm离心5min，弃上清，0.1M CaC12100uL重悬，4℃放置备用。
4.3重组质粒转化感受态细胞：将10uL重组原核表达质粒加入到100uL的BL21感受态细胞中，轻轻混匀，冰上放置30min，将离心管放入42℃水浴中热休克90s，立即将离心管冰浴5~10min，每管加入800uL的LB培养基，然后放入37℃摇床中100rpm培养45min，取出离心管5000rpm离心5min，弃去600uL上清，将沉淀的细菌混匀并涂布氨卞抗性的LB平板，涂布后正置30min后倒置于37℃培养箱中，培养12~16h。
4.4 重组质粒的鉴定4.4.1 PCR鉴定：挑取抗性LB平板上长出的BL21重组菌，并接种LB培养基中(含Amp100ug/mL)，37℃、200rpm摇振培养3~5h，PCR鉴定。
4.4.2 酶切鉴定：应用限制性内切酶对提取的质粒进行双酶切鉴定，通过双酶切鉴定目的基因有无插入及大小是否正确。
酶切结束后进行1%琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像系统下观察并拍照记录。
4.4.3重组质粒基因序列测定：挑选PCR检测条带亮，酶切鉴定正确的菌株测序。
原核表达实验流程
原核表达流程：第一步DH5a感受态制备PCR扩增pGEM-T载体重组载体1 DH5a感受态细胞转化转化细胞1抽取质粒进行电泳酶切验证检验阳性1Pet28a/DH5a载体重组重组载体2第二步重组载体2 DH5a感受态细胞转化转化细胞2抽取质粒进行电泳酶切验证检验阳性3BL21感受态细胞转化细胞3诱导表达蛋白质提取SDS-PAGE电泳检测呈阳性目的蛋白一.感受细胞的制备体外连接的DNA重组分子导入合适的受体细胞才能大量增殖。
为了提高受体菌摄取外源DNA 的能力，提高转化效率以获得更多的转化子，人们摸索出了不同的方法处理细菌，使其处于感受态。
目前主要采用电转化法和CaCl2 法将外源DNA 导入受体细胞中，并需要相应地制备电转化感受态细胞和CaCl2 感受态细胞。
本实验制备的是电转化感受态细胞。
实验原理：对于电转化法，因利用瞬间高压在细胞上打孔，因而需用冰冷的超纯水多次洗涤处于对数生长前期的细胞，以使细胞悬浮液中应含有尽量少的导电离子。
(109～1010转化子/μg DNA)实验材料：LB 培养基（根据需要确定配制的量）：10g/l 胰蛋白胨，5g/l 酵母提取物，10g/l NaCl，加水至1000ml，高压灭菌，保存在室温。
无抗生素LB琼脂糖平板培养基（根据需要确定配制的量）：10g/l 胰蛋白胨，5g/l 酵母提取物，10g/l NaCl，15g/l 琼脂粉，加水至1000ml，高压灭菌；铺平板，冷却后在37℃培养24小时，保存在室温。
10％甘油：10ml甘油加入90m l ddH2O水，混匀，高压灭菌。
其他：DH5α大肠杆菌，灭菌玻璃平皿若干，接菌环，加100ml LB液体培养基的500ml灭菌锥形瓶一个，灭菌50ml离心管若干，冰盒，移液器，灭菌移液器吸头，灭菌Eppendorf管等。
实验仪器酒精灯，超净工作台，温控摇床，4℃离心机等。
实验方法(1) 将大肠杆菌DH5a 贮存菌液在无抗的LB平板划线，37℃培养箱过夜培养（培养好的平皿放入4℃冰箱贮存备用）。
原核表达操作步骤及注意事项
原核表达操作步骤及注意事项原核表达操作步骤及注意事项发布时间： 2019-06-03 新闻来源：将克隆化基因插入合适载体后导入大肠杆菌用于表达大量蛋白质的方法一般称为原核表达。
这种方法在蛋白纯化、定位及功能分析等方面都有应用。
大肠杆菌用于表达重组蛋白有以下特点：易于生长和控制；用于细菌培养的材料不及哺乳动物细胞系统的材料昂贵；有各种各样的大肠杆菌菌株及与之匹配的具各种特性的质粒可供选择。
但是，在大肠杆菌中表达的蛋白由于缺少修饰和糖基化、磷酸化等翻译后加工，常形成包涵体而影响表达蛋白的生物学活性及构象。
表达载体在基因工程中具有十分重要的作用，原核表达载体通常为质粒，典型的表达载体应具有以下几种元件：（1）选择标志的编码序列；（2）可控转录的启动子；（3）转录调控序列(转录终止子，核糖体结合位点) ；（4）一个多限制酶切位点接头；（5）宿主体内自主复制的序列。
原核表达一般程序如下：获得目的基因－准备表达载体－将目的基因插入表达载体中（测序验证）－转化表达宿主菌－诱导靶蛋白的表达－表达蛋白的分析－扩增、纯化、进一步检测一、试剂准备1、LB 培养基。
2、100mM IPTG（异丙基硫代-β-D-半乳糖苷）：2.38g IPTG溶于100ml ddH2O 中,0.22μm滤膜抽滤，-20℃保存。
二、操作步骤（一）获得目的基因1、通过PCR 方法：以含目的基因的克隆质粒为模板，按基因序列设计一对引物（在上游和下游引物分别引入不同的酶切位点），PCR 循环获得所需基因片段。
2、通过RT-PCR 方法：用TRIzol 法从细胞或组织中提取总RNA ，以mRNA 为模板，逆转录形成cDNA 第一链，以逆转录产物为模板进行PCR 循环获得产物。
（二）构建重组表达载体1、载体酶切：将表达质粒用限制性内切酶（同引物的酶切位点）进行双酶切，酶切产物行琼脂糖电泳后，用胶回收Kit 或冻融法回收载体大片段。
2、PCR 产物双酶切后回收，在T4DNA 连接酶作用下连接入载体。
原核表达步骤
成包涵体而影响表达蛋白的生物学活性及构象。
表达载体在基因工程中具有十分重要的作用， 原核表达载体通常为质粒， 典型的表达载体应具有以下几种元件：
（1）选择标志的编码序列；
（2）可控转录的启动子；
（3）转录调控序列（转录终止子，核糖体结合位点）；
超滤复性： 在生产中较多的使用，规模较大， 易于对透析速度进行控制，缺点是不适合样品 量较少的情况，且有些蛋白可能在超滤过程中不可逆的变性。
（2）融合表达时在选择外源DNA同载体分子连接反应时，对转录和转译 过程中密码结构的阅读不能发生干扰。
Rosetta有两套质粒，做表达时，先将质粒转入DH5a,测序，酶切正确
后再转入Rosetta;
Pet30a通过酶切可保留C端HIS，通过终止密码子可保留N端密码子。
包涵体的形成：
主要因为在重组蛋白的表达过程中缺乏某些蛋白质折叠的辅助因子，或环境不适，无法形成
与包涵体的形成呈正相关。
3、重组蛋白 所处的环境：发酵温度高或胞pH接近蛋白的等电点时容易形成包涵体。
4、 重组蛋白是大肠杆菌的异源蛋白，由于缺乏真核生物中翻译后修饰 所需酶类，致使中间 体大量积累，容易形成包涵体沉淀。 因此有人采用共表达分子伴侣的方法以增加可溶蛋白的 比例。
包涵体表达的有利因素：
CCY勺IPTG是1M的，用时进行1000倍稀释。
二、操作步骤
（一）获得目的基因
1、通过PCF方法：以含目的基因的克隆质粒为模板， 按基因序列设计一 对引物（在上游和下游引物分别引入不同的酶切位点），PCR循环获得 所需基因片段。
2、通过RT-PCF方法：用TRIzol法从细胞或组织中提取总RNA以mRNA为模板，逆转录形成cDNA第一链，以逆转录产物为模板进行PCR循环获 得产物。
原核表达 操作
蛋白质的表达、分离、纯化实验标签： 蛋白质 表达 分离 纯化蛋白质表达、分离、纯化可以：（1）探索和研究基因的功能以及基因表达调控的机理；（2）供作结构与功能的研究；（3）作为催化剂、营养剂等。
详细实验方法原核表达法实验方法原理 携带有目标蛋白基因的质粒在大肠杆菌BL21中，在 37℃，IPTG 诱导下，超量表达携带有6个连续组氨酸残基的重组氯霉素酰基转移酶蛋白，该蛋白可用一种通过共价偶连的次氨基三乙酸（NTA ）使镍离子（Ni 2+）固相化的层析介质加以提纯，实为金属熬合亲和层析（MCAC ）。
蛋白质的纯化程度可通过聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分析。
实验材料大肠杆菌BL21 试剂、试剂盒LB 液体培养基氨苄青霉素Washing BufferElution BufferIPTG 蒸馏水胰蛋白胨酵母粉氯化钠 仪器、耗材 摇床离心机层析柱离心管移液枪枪头盒烧杯玻璃棒 实验步骤一、试剂准备1. LB 液体培养基：Trytone 10 g ， yeast extract 5 g ，NaCl 10 g ，用蒸馏水配至1000 mL 。
2. 氨苄青霉素：100 mg/mL 。
3. 上样缓冲液：100 mM NaH 2PO 4，10 mM Tris ，8M Urea ，10 mM 2-ME ，pH8.0。
4. Washing Buffer ：100 mM NaH 2PO 4，10 mM Tris ，8 M Urea ，pH6.3。
5. Elution Buffer ：100 mM NaH 2PO 4，10 mMTris ，8M Urea ， 500 mMImidazole， pH8.0。
6. IPTG：100mM IPTG（异丙基硫代-β-D-半乳糖苷）：2.38g IPTG溶于100ml ddH2O中,0.22μm滤膜抽滤，-20℃保存。
二、获得目的基因1. 通过PCR方法：以含目的基因的克隆质粒为模板，按基因序列设计一对引物（在上游和下游引物分别引入不同的酶切位点），PCR循环获得所需基因片段。
原核表达实验
原核表达实验原核表达操作流程实验概要本实验介绍了原核表达的具体操作流程，包括：外源基因的诱导表达，大肠杆菌包涵体的分离与蛋白质纯化。
实验原理1. E. coli 表达系统E. coli 是重要的原核表达体系。
在重组基因转化入E. coli 菌株以后，通过温度的控制，诱导其在宿主菌内表达目的蛋白质，将表达样品进行SDS-PAGE 以检测表达蛋白质。
2. 外源基因的诱导表达提高外源基因表达水平的基本手段之一，就是将宿主菌的生长与外源基因的表达分成两个阶段，以减轻宿主菌的负荷。
常用的有温度诱导和药物诱导。
本实验采用异丙基硫代-β-D-半乳糖昔（IPTG）诱导外源基因表达。
不同的表达质粒表达方法并不完全相同，因启动子不同，诱导表达要根据具体情况而定。
主要试剂1. 诱导表达材料1) LB （Luria—Bertani）)培养基酵母膏 (Yeast extract) 5g 蛋白胨 (Peptone) 10gNaCl 10g 琼脂 (Agar) 1-2%蒸馏水 (Distilled water) 1000ml pH 7.0适用范围：大肠杆菌2) IPTG 贮备液：2 g IPTG溶于10 mL 蒸馏水中，0 . 22 μm 滤膜过滤除菌，分装成1 mL /份，－20 ℃保存。
3) l×凝胶电泳加样缓冲液：50 mmol / L Tris -CI ( pH 6 . 8 )50 mmol / L DTT2 % SDS （电泳级）0.1 ％溴酚蓝10 ％甘油2. 大肠杆菌包涵体的分离与蛋白纯化材料1) 酶溶法a. 裂解缓冲液：50 mmol / L Tris-CI ( pH 8 . 0 )1 mmol / L EDTA100 mmol / LNaClb. 50 mmol / L 苯甲基磺酰氟（PMSF ）。
c. 10 mg / mL 溶菌酶。
d. 脱氧胆酸。
e. 1 mg / mL DNase I。
2) 超声破碎法a. TE 缓冲液。
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原核：（1）、要构建一个合适的原核表达载体的基本要求：①有一个强的启动子及其两侧的调控序列；②有SD序列及SD序列与起始密码子之间要有合适的距离；③在克隆基因与启动子之间有正确的阅读框架；④外源基因下游加入不依赖ρ因子的转录终止区。
（2）、编码基因要完整，没有插入序列；（3）、将真核基因克隆到原核基因中，以保证产物表达的稳定性；（4）、克隆基因中保留信号肽序列，使表达产物自细菌分泌到溶液中，有利于产物的分离纯化。
表达详细步骤PartⅠ选择表达的目的基因一、基因序列1. 得到靶基因DNA（cDNA）序列，有几种方式寻找正确的读码顺序:①利用生物信息学在NCBI上blast同源基因，找到同源蛋白，再在DNA的ORF中找到正确的读码。
②实验方法，即得到蛋白，进行测序，然后在DNA上找到正确的读码。
③利用mRNA的特征，找到启动子，编码区，终止子。
在编码区中找到翻译起始密码子与终止密码子（cDNA）。
2. 注意事项：①区别ORF和CDS→ORF一般在DNA上的定义，寻找原则是翻译起始密码子和终止密码子；CDS可以是DNA上的定义，也可以是mRNA上的定义，分为complete CDS 和partial CDS,是从第一个核酸开始读，连续读下去，complete CDS读码是“M、、、、、、、、、＊”，partial CDS的读码是相应的AA②在进行试验设计时，充分利用生物信息学的信息后，在进行试验设计。
二、抗原决定簇的预测1、原理：蛋白质表面部分可以使免疫系统产生抗体的区域叫抗原决定簇。
一般抗原决定簇是由6－12 氨基酸或碳水基团组成，它可以是由连续序列（蛋白质一级结构）组成或由不连续的蛋白质三维结构组成。
变性蛋白只是天然蛋白伸直的了产物，用来免疫动物具有更强的抗原性。
只是天然蛋白中被包在内部的抗原决定簇也会暴露出来，如果用该变性抗原制备的抗体来检测变性抗原是可以的，如果用来检测天然蛋白，可能会有假阳性。
做单抗也可以，同样道理，筛选出的单抗可能对抗的抗原决定簇处于天然抗原的内部，是否能用还要看将来该单抗用来干什么。
2、选择原则：（1）、亲水性：大部分抗原决定簇是亲水性的。
（2）、处于结构表面：大部分抗体只与蛋白质表面部分结合。
（3）、有弹性：许多已知的抗原决定簇是在自由活动区域。
所以一般来说蛋白质的N 端及C 端是很好的抗原决定簇区域。
3、选定抗原决定簇的步骤：（1）预测：如软件预测DNAstar（Protean）预测，Dnaman。
在线网站预测（/molbio/hla_bind/index.shtmland http://www.imtech.res.in/raghava/propred/algorithm.html）（2）选定：接近N、C端；选取在此区间内，（Antigenic Index）Jameson-wolf 抗原决定簇选正分高处；（Hydrophilicity plot）Kyte-Doolittle预测亲水性强的区域。
同时符合以上3点的区域较好（命名为多肽片断A）。
注：如果设计的多肽是跨膜蛋白，请尽量回避选择蛋白的跨膜区，即头端信号肽所在的区域（3）NCBI（BlastP）比对：将多肽片断A放入blastp进行同源性比对。
如果制备某一动物种属的抗体，该区必须与该动物的氨基酸序列没有较高的同源性。
注：这一步往往容易漏掉，所以学会应用生物信息学，可以减少走弯路！！！（4）抗原合成：①原核表达：②化学合成：需要做化学偶联增强多肽稳定性。
多肽的纯度越纯越好，一般> 80%就完全可以了。
合成5-10 mg就可以了。
PartⅡ选择表达系统一、选择表达载体1、选择表达载体的原则（1）蛋白质大小：决定在胞质中表达还是以包涵体的形式表达，是否加标签或以融合蛋白的形式表达。
（2）蛋白需求量：根据实验方案确定蛋白需求量，选择合适的载体。
（3）蛋白质是否需要保留活性：有活性的可溶性蛋白表达（胞质蛋白），无活性的不溶的蛋白（包涵体蛋白）2、原核表达载体通常为质粒，典型的表达载体应具有以下几种元件：（1）选择标志的编码序列：用于筛选重组子，有抗生素抗性基因、报告基因（GFP 等）（2）可控转录的启动子：启动子是DNA链上一段能与RNA聚合酶结合并起始RNA合成的序列，它是基因表达不可缺少的重要调控序列。
启动子的强弱是对表达量有决定影响的因素之一。
没有启动子，基因就不能转录。
由于细菌RNA聚合酶不能识别真核基因的启动子，因此原核表达载体所用的启动子必须是原核启动。
原核启动子是由两段彼此分开且又高度保守的核苷酸序列组成，对mRNA的合成极为重要。
在转录起始点上游5～10 bp处，有一段由6～8个碱基组成，富含A 和T的区域，称为Pribnow 盒，又名TATA 盒或－10区。
来源不同的启动子，Pribnow 盒的碱基顺序稍有变化。
在距转录起始位点上游35 bp处，有一段由10 bp组成的区域，称为-35区。
转录时大肠杆菌RNA聚合酶识别并结合启动子。
-35区与RNA聚合酶s亚基结合，-10区与RNA聚合酶的核心酶结合，在转录起始位点附近DNA被解旋形成单链，RNA聚合酶使第一和第二核苷酸形成磷酸二酯键，以后在RNA聚合酶作用下向前推进，形成新生的RNA链。
原核表达系统中通常使用的可调控的启动子有Lac(乳糖启动子)、Trp(色氨酸启动子)、Tac(乳糖和色氨酸的杂合启动子) 、lPL (l噬菌体的左向启动子)、T7噬菌体启动子等。
（3）转录终止子：在一个基因的3¢末端或是一个操纵子的3¢末端往往有特定的核苷酸序列，且具有终止转录功能，这一序列称之为转录终止子，简称终止子(terminator)。
转录终止过程包括：RNA聚合酶停在DNA模板上不再前进，RNA 的延伸也停止在终止信号上，完成转录的RNA从RNA聚合酶上释放出来。
对RNA 聚合酶起强终止作用的终止子在结构上有一些共同的特点，即有一段富含A/T的区域和一段富含G/C的区域，G/C富含区域又具有回文对称结构。
这段终止子转录后形成的RNA具有茎环结构，并且有与A/T富含区对应的一串U。
转录终止的机制较为复杂，并且结论尚不统一。
但在构建表达载体时，为了稳定载体系统，防止克隆的外源基因表达干扰载体的稳定性，一般都在多克隆位点的下游插入一段很强的rrB核糖体RNA的转录终止子。
（4）核糖体结合位点（SD序列）：1974年Shine和Dalgarno首先发现，在mRNA上有核糖体的结合位点，它们是起始密码子AUG和一段位于AUG上游3～10 bp处的由3～9 bp组成的序列。
这段序列富含嘌呤核苷酸，刚好与16S rRNA 3¢末端的富含嘧啶的序列互补，是核糖体RNA的识别与结合位点。
以后将此序列命名为Shine-Dalgarno序列，简称SD序列。
它与起始密码子AUG之间的距离是影响mRNA转录、翻译成蛋白的重要因素之一，某些蛋白质与SD序列结合也会影响mRNA与核糖体的结合，从而影响蛋白质的翻译。
另外，真核基因的第二个密码子必须紧接在ATG之后，才能产生一个完整的蛋白质。
（5）多克隆位点（MCS）：选择的酶切位点在靶基因上没有相应的酶切序列，否则在构建重组子进行酶切时会把靶基因给切开。
在惠赠或交换的质粒中确定MCS 的正确性，否则会造成错读密码子。
（6）复制子：通常表达载体都会选用高拷贝的复制子。
pSC101类质粒是严谨方式复制，拷贝数低，pCoE1，pMBI(pUC)类的复制子（复制起始部位）的拷贝数高达500以上，是表达载体常用的。
通常情况下质粒拷贝数和表达量是非线性的正相关，当然也不是越多越好，超过细胞的承受范围反而会损害细胞的生长。
如果碰巧需要2个质粒共转化，就要考虑复制元（？）是否相容的问题。
（7）融合Tag：基因融合是将两个或多个开放阅读框按一定顺序连接起来，并且正确读码。
在表达靶蛋白是加上融合标签的好处，（a保护靶蛋白免受原核宿主蛋白酶的降解；b提供亲和纯化的配基结合位点；c改善靶蛋白的溶解性，使其正确折叠；d与已知酶或抗原结构域连接，可以进行标记和分离；e与信号肽连接，可将融合蛋白分泌到特定细胞区域。
）注：选择融合蛋白表达载体时，融合标签与靶蛋白的连接处如果有酶切位点，且想除去标签，则载体的酶切序列在靶蛋白中不能出现。
二、选择表达宿主首先要看靶基因中有没有细菌不常用的密码子——如果有，需要考虑换表达菌株。
每种菌株都有自己独特的设计，或者是蛋白酶缺陷，或者是重组酶缺陷，改造的目的都是为了让质粒在细菌中存在更稳定，表达的产物不易被降解。
不同的载体要配合一定的菌株使用，像pET系列就一定需要有T7 RNA聚合酶片段整合在细菌中的菌株才可用于表达。
采用不同调控机制会使用不同的表达菌株，所以换菌株一定要仔细看过载体的调控方式再换。
以Novagen为例，如果使用BL21(DE3)表达不成功的话可以换Rosetta系列菌株，它能够由一种氯霉素抗性的、与pET 相容的质粒提供AUA，AGG，AGA，CUA，CCC和GGA 的tRNA。
所以这类菌株能够明显改善大肠杆菌中由于稀有密码子造成的表达限制。
有时不明原因的表达蛋白截短（比预期的分子量要小很多）也可能是由于稀有密码子造成的。
另外一种可能是不严谨的本底表达产物抑制。
1. 原核表达系统（大肠杆菌）优点：①遗传图谱明确②容易培养且费用低③对许多外源蛋白耐受能力强④能高水平表达这些蛋白缺点：①蛋白质不能进行翻译后修饰（在真核高尔基复合体中的糖基化修饰，特点位点的切割等产生具有活性的蛋白）②具有密码子的偏好（？）2. 真核表达系统优点：可以产生修饰的蛋白缺点：①真核表达系统复杂②费用高注：不同的表达宿主有相应的表达载体，二者应是最佳表达组合。
PartⅢ构建重组子一、重组子的构建1. 设计引物：a保证引物序列扩出的靶基因插入到表达载体MCS上，能够正确读码；b引物两端加入酶切位点；c遵循引物设计原则（一般性引物自动搜索可采用“Premier Primer 5”软件，而引物的评价分析则可采用“Oligo 6”软件）。
2. 扩增靶基因：（1）通过PCR方法：以含目的基因的克隆质粒为模板，按基因序列设计一对引物（在上游和下游引物分别引入不同的酶切位点），PCR循环获得所需基因片段。
（2）通过RT-PCR方法：用TRIzol法从细胞或组织中提取总RNA，以mRNA为模板，逆转录形成cDNA第一链，以逆转录产物为模板进行PCR循环获得产物。
注：但在PCR过程中，需要减少突变的发生，可采用高保真酶，尽量减少PCR循环次数，增加模板和引物的浓度。
尤其注意不要引入终止密码子。
3. 限制性内切核酸酶消化载体DNA 和目的基因：（1）载体双酶切后回收：将表达质粒用限制性内切酶（同引物的酶切位点）进行双酶切，酶切产物行琼脂糖电泳后，用胶回收Kit或冻融法回收载体大片段。