绿色木霉菌LTR-2对小麦纹枯病菌的作用机制

1998 杨合同，唐文华，宋家华等。

绿色木霉菌LTR-2对小麦纹枯病菌的作用机制。

植物病害研究与防治。

Pp504-507.主编刘仪, 中国农业科技出版社，北京绿色木霉菌LTR-2对小麦纹枯病菌的作用机制
杨合同1唐文华1宋家华2牛赡光3周洪友4
1:中国农业大学植保系植病生防室; 2:山东省科学院生物研究所; 3:山东省农业科学院植保所; 4:内蒙古农牧学院植保系
摘要
绿色木霉菌LTR-2对小麦纹枯病菌有强烈的拮抗作用,主要作用方式为重复寄生,位点与营养竞争,产生几丁质酶和B-1,3-葡聚糖酶消解细胞壁等.在营养竞争作用中涉及的营养物质为葡萄糖.LTR-2可能产生对小麦纹枯病菌有抗生作用的挥发性物质.
关键词:绿色木霉菌;小麦纹枯病菌;作用机制;重复寄生;竞争
木霉菌的作用机制多种多样,包括(1)抗生素:木霉菌产生抗真菌代谢产物至少在32种以上。

多数种类产生的抗生素不止一种,如哈茨木霉可产生12种,康氏木霉可产生9种,绿色木霉可产生10种,钩状木霉可产生7种,长枝木霉可产生3种,多孢木霉可产生2种,木素木霉(绿色木霉)可产生2种.这些抗生素的化学性质各不相同,包括了戊酮,辛酮,类萜,多肽和氨基酸衍生物等几大类(Ghisalbert等,1991; Faull等,1994)。

(2)重寄生作用:目前已发现木霉菌至少可寄生18个属的29种植物病原真菌.(3)溶菌作用:木霉菌有时不与寄主菌丝有直接接触,同样可以引起它们的解体,最终消失。

这与木霉菌的β-1,3-葡聚糖苷酶,几丁质酶和纤维素酶等有关。

通过酶的作用使真菌细胞壁遭到破坏,继而引起原生质体解体。

(Cook等, 1983, Wells等, 1988) (4)毒性蛋白:蛋白质Tricholin是核糖体钝化蛋白,能抑制R.solani生长与繁殖。

(Lin, 等,1994)(5)竞争作用: Sivan等(1989)的研究证明木霉菌的竞争在镰刀菌的防治中有重要作用.Ahamad 和Baker(1987)也有相似的报道.但是就特定的木霉菌菌株来说,对病原菌的作用机制则各具特点,防治效果的表现也不同.我们曾经得到一株绿色木霉菌LTR-2,对蔬菜灰霉病有良好的防治效果,已经登记注册(杨合同等,1996;宋家华等,1996;Tang Wenhua and Yang Hetong, 1997).后来的研究表明,该菌株对小麦纹枯病也有良好的效果(Tang Wenhua et al, 1996),因此对其作用机制进行了探讨,下面是研究结果.
1.材料与方法
1.1. 菌株
绿色木霉菌(Trichoderma viride)LTR-2,小麦纹枯病菌(Rhizoctonia cerealis) H-1, 哈茨木霉菌(T. harzianum）TH和粉红粘帚霉菌(Gliocladium roseum）GLR.
1.2. 方法
1.2.1.重复寄生能力测定
制备PDA平板,将LTR-2和小麦纹枯病菌H-1点接在相对的平板边缘,于28℃培养,并连续观察菌落的相互影响;LTR-2的菌落与H-1的菌落接触时,置于显微镜下观察菌丝的相互作用;另采集小麦纹枯病的病株,保湿使病部出现大量的病菌菌丝,然后喷布LTR-2的孢子悬浮液(107孢子/毫升),继续保湿,连续观察绿色孢子的产生情况,并在显微镜下观察菌丝的侵染情况.
1.2.2.抗生素的产生
①将LTR-2在PDA平板上培养至分生孢子产生完全,60℃15分钟杀死木霉菌,冷却后用打孔器取下直径0.6cm的培养物,置于另一个接种了小麦纹枯病菌的PDA平板上,28℃培养,观察抑菌圈的产生情况.另以氯仿熏蒸杀死LTR-2,作同上处理.
②在PDA平板上对峙培养LTR-2和H-1,另设单独接种LTR-2和H-1的对照,待两菌落接触时,量取从接种点到菌落汇合点的距离,以及对照培养物从接种点到菌落边缘的距离.
1.2.3.位点竞争
将小麦幼茎用LTR-2的孢子悬浮液(106孢子/ml)处理,同时以灭菌水处理作为对照,在28℃保湿3-4天,取出阴干,用透明的胶带纸印下小麦表面的微生物,显微镜下观察结果;另于PDA 平板上培养表面洗涤液.另以灭菌玻片代替小麦幼果为对照.
1.2.4营养竞争
H-1菌丝用解剖刀切碎,以灭菌生理盐水洗涤,离心,风干,平板法检测每克活菌丝段.将LTR-2作同样处理后与H-1的菌丝段等量混合,分为两份,其中一份加入1%(W/W)的葡萄糖,于灭菌的培养皿内保湿培养2天,用PDA培养基进行稀释分离,观察病原菌和LTR-2的生长情况.对照则采用LTR-2分生孢子和H-1菌丝段,以灭菌硅藻土为分散剂,观察H-1和LTR-2的生长情况。

以对照菌数为基数计算H-1和LTR-2在两者混合情况下的死亡率.
1.2.5.β-1,3-葡聚糖酶和几丁质酶活性测定
1.2.5.1.β-1,3-葡聚糖酶活性测定
茯苓粉中的β-1,3-葡聚糖与苯胺蓝结合呈蓝色,在β-1,3-葡聚糖酶的作用下,β-1,3-葡聚糖被水解,蓝色消失,在平板上表现为无色的水解区,由此可以判断β-1,3-葡聚糖酶的活性是否存在。

培养基的配方为：磷酸二氢钾,6.8克;磷酸氢二钾,17.98克;酵母汁,5克;茯苓粉,4克;苯胺蓝,100毫克;琼脂粉,14克。

灭菌以后制平板,接种LTR-2,以哈茨木霉菌(T. harzianum）TH 和粉红粘帚霉菌(Gliocladium roseum）GLR为对照,于27℃培养3-4天,观察结果。

1.2.5.2.几丁质酶活性测定
几丁质在琼脂培养基中呈微粒悬浮状,培养基平板为云雾状半透明;在几丁质酶的水解作用下,几丁质被水解为可溶性小分子物质,在菌落的周围出现透明的水解圈,由此可以判断几丁质酶活性的有无。

测定几丁质酶活性的培养基组成为：硫酸铵,3克;磷酸二氢钾,4克;磷酸氢二钾,3克;硫酸镁,0.2克;酵母汁,0.2克,硼酸,5.6毫克;硫酸铜,0.4毫克;硫酸锌,0.5毫克;钼酸钠,1.5毫克;柠檬酸铁,1毫克;氯化钙,10毫克;几丁质,5毫克;琼脂粉,13克;水,1000毫升pH以氢氧化钠调整到7.2-7.4;平板制备完毕以后,将LTR-2,以TH和GLR接种于平板上,27℃培养3-4天,观察
2.结果与分析
2.1.重复寄生现象的观察
在LTR-2和H-1的平板对峙培养过程中发现,接种后12小时两者均可见到明显的生长现象,表现为接种点出现白色或灰白色的菌丝.24小时后,可见LTR-2的生长速度明显高于H-1,约在36-48小时,两者菌落边缘汇合,并在24小时以内,LTR-2的菌落完全覆盖H-1的菌落,此时整个平板均为LTR-2 的深绿色分生孢子所掩盖.在两个菌落接触之前,LTR-2的菌落外缘一直呈圆弧形,而H-1的菌落与LTR-2菌落相对的边缘则呈平直且略有凹进,表现为受抑制状态.在两个菌落刚刚开始接触时,将平板置于显微镜下观察,可见在H-1菌落靠近LTR-2菌落的部分LTR-2的菌丝以各种方式寄生于H-1的菌丝上,H-1菌丝的被寄生率达到100%.喷布LTR-2孢子悬浮液的小麦纹枯病病菌霉层,2-3天时出现大量的绿色分生孢子,于显微镜下观察,可见纹枯病病菌菌丝被大量寄生,受到严重破坏.认为LTR-2对纹枯病菌的寄生作用是很明显的,是防治纹枯病的重要作用机制.LTR-2对纹枯病菌的寄生方式有：缠绕在病菌菌丝上,紧贴病菌菌丝生长,穿透病菌菌丝和穿入病菌菌丝并在菌丝内部生长;这些寄生方式的最终结果是造成病菌菌丝的彻底解体。

另外,LTR-2菌丝密集区的附近,病菌菌丝在没有接触LTR-2菌丝时也会发生消解,推测可能是LTR-2产生了大量的消解酶。

2.2.抗生素的产生
在观察重复寄生现象时发现,LTR-2对H-1有一定的抑制作用,表现为H-1菌落前沿的生长受阻.用高温杀死的LTR-2培养物进行抑菌试验,发现并无抑菌现象;用氯仿杀死的LTR-2培养物也同样没有抑菌现象;说明LTR-2至少不产生能耐热或耐氯仿的抗生素.但是如2.3所述,LTR-2可能产生了挥发性的抗生物质,抑制了病原菌的生长.
2.3.竞争作用
2.3.1.平板检测结果
与H-1和LTR-2的纯培养相比,对峙培养时两者的生长均有一定程度的下降.对峙培养到40小时,两者的菌落发生接触;H-1菌落从接种点到前沿的距离平均为1cm,LTR-1菌落从接种点到前沿的距离平均为6.8cm;在纯培养时,两者菌落从接种点到前沿的平均距离基本相同,分别为7.4cm和8.1cm;说明LTR-1的存在确能显著抑制纹枯病菌的生长.由于两者的生长速度都有下降,营养竞争应是主要原因;但相比之下,H-1所受到的抑制作用比LTR-2要大得多,单纯用营养竞争来解释并不完全,很可能LTR-2通过某种挥发性抗生素抑制了H-1的生长;但在抗生素试验中没有发现LTR-2通过抗生素来抑制病原菌的生长,这可能有两方面的原因,一是抗生素为蛋白质类物质,在抗生素试验中无论是60℃的高温还是氯仿处理,均能钝化这些蛋白质类,使之失去抗生素的活性,因而检测不出抗菌活性;二是LTR-2产生的抗生素为挥发性物质,处理过程在杀死LTR-2 的同时,挥发性抗生素也随之消失,因而不表现抗菌活性.
2.3.2.小麦幼茎表面观察
小麦幼茎表面以LTR-2的分生孢子接种,培养2天后用胶带纸印迹观察,发现分生孢子全部发芽,芽管的长度为孢子直径的5倍以上,约有60-70％的芽管产生分枝;无菌水处理则没有发现LTR-2的分生孢子,相反有大量的细菌微菌落。

在PDA平板上培养幼果表面的洗涤液,有大量的LTR-2菌落出现。

用灭菌的玻片作对照,于显微镜下亦可见LTR-2的分生孢子萌发,发芽率在35％左右,芽管没有分枝,长度仅为孢子直径的1-2倍,PDA平板培养也出现大量的LTR-2菌落。

这说明LTR-2在小麦幼茎表面生长旺盛,而在玻片上的生长相对较弱,很明显是小麦幼果表面的渗出物为LTR-2的分生孢子提供了营养物质。

2.3.3.LTR-2与H-1混合试验
LTR-2与H-1菌丝段混合物的稀释分离结果表明,在有葡萄糖存在时,H-1的菌丝段全部被LTR-2杀死,PDA平板上找不到H-1的菌落,均为LTR-2的菌落,即H-1菌丝段的死亡率为100%,而LTR-2的死亡率为0;镜检时发现H-1菌丝细胞壁不完整,菌丝干瘪;而LTR-2分生孢子的发芽率在95-100％之间。

不加葡萄糖的对照,镜检可见LTR-2孢子的萌发率在90％以上,H-1表现为干瘪菌丝段减少;在PDA平板上,H-1的菌落出现;LTR-2的死亡率为5%,H-1菌丝段的死亡率为79%.很明显,葡萄糖在这两种菌的相互作用中有重要地位,有葡萄糖时,LTR-2对H-1的作用强,无葡萄糖时,LTR-2对H-1的作用弱;一个较为合理的解释是,葡萄糖为LTR-2和H-1提供营养,在生长发育过程中LTR-2利用葡萄糖的速度大大超过H-1,从而有效地杀灭了H-1;在无葡萄糖时,两者利用自身的贮存物质作为营养发芽和生长,LTR-2的分生孢子虽然能正常发芽,但生长显然不如有外源营养物质时强,因而对H-1的杀灭作用就小,甚至部分孢子死亡,而H-1的菌丝段死亡率也下降。

在这种情况下,葡萄糖成为两者竞争的营养物质,决定了LTR-2的优势。

可见,营养竞争在木霉菌防治纹枯病菌的过程中具有重要地位,使用LTR-2防治纹枯病时,在菌剂中添加特定的营养物质是必要的。

2.4.水解酶活性的测定
2.4.1β-1,3-葡聚糖酶活性
在接种后的第二天,LTR-2和TH的β-1,3-葡聚糖酶活性即可明显地观察到;至第三天,酶的活性表现更加明显,LTR-2的菌落直径为3.6cm,水解圈的直径为3.2cm;TH的菌落直径为5.0cm,水解圈的直径为3.0cm;GLR于第四天才表现出微弱的酶活性,菌落直径为2.3cm,水解圈的直径为1.0cm。

2.4.2. 几丁质酶活性
LTR-2和GLR的几丁质酶活性均于第二天即表现出来,到第三天时,LTR-2的菌落直径为8.4cm,水解圈的直径为4.2cm;GLR的菌落直径为1.5cm,水解圈的直径为2.1cm;TH的酶活性于第四天表现明显,菌落直径为15cm,水解圈的直径为10.8cm。

可见,LTR-2可以产生大量的几丁质酶和β-1,3-葡聚糖酶,用硫酸铵盐析法浓缩两种酶,用于处理生长旺盛的纹枯病菌菌丝,发现浓缩液可以导致菌丝尖端膨大和原生质体泄漏,说明这两种酶与LTR-2寄生于纹枯病菌菌丝后导致菌丝崩溃有关.
3.结论与讨论
试验结果表明重复寄生和营养竞争是LTR-2防治纹枯病的重要机制,在重复寄生发生后导致菌丝崩溃的水解酶类至少有两种,即β-1,3-葡聚糖酶和几丁质酶;在营养竞争机制中涉及的营养物质至少与葡萄糖有关,但可能比较复杂,还需要研究其他的相关营养物质.另外,LTR-2的分生孢子在小麦幼茎表面能发芽生长,可以想见位点占领作用也是存在的。

没有发现LTR-2产生水溶性抗生物质,但从纹枯病菌生长受到明显的抑制来看,产生挥发性抗生物质的可能性较大,是值得探讨的.现在还不能确定上述机制中哪一种是主要的机制,进一步的研究应当明确主要的作用机制,以指导木霉菌的筛选和改良,找到更为有效的木霉菌生防菌株.
参考文献
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Mechanisms of Trichoderma viride Strain LTR-2
Against Rhizoctonia cerealis
Yang Hetong1Tang Wenhua1Song Jiahua2Niu Shanguang3Zhou Hongyou4
1:Dept. of Plant Protection, China Agricultural University; 2:Shandong Biology Research Institute; 3:Institute of Plant Protection, Shandong Academy of Agriculture Science; 4:Dept. of Plant Protection, Inner Mongolia Agricultural College
Abstract
Trichoderma viride strain LTR-2 showed strong inhibitory activity against Rhizoctonia cerealis.The main mechanisms of LTR-2 included mycoparasitism, spatial and nutrient competition,production of chitinase and β-1,3-glucanase which were responsible for the digestion of cell wall and collapse of mycelia. Glucose was found to be one of the related nutrient involved in competition. It was speculated that LTR-2 produced volatile inhibitory compounds against the pathogen.
Key words: Trichoderma viride; Rhizoctonia cerealis; Mechanism; Mycoparasitism; Competition。