[课件]实时荧光定量PCR(qPCR,RT-PCR)的原理及应用PPT
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荧光定量PCR工作原理及应用PPT课件
灵敏度高
由于采用了荧光信号，荧 光定量PCR具有较高的灵 敏度，能够检测低拷贝数 的基因表达。
重复性好
通过标准化和内参基因的 校正，荧光定量PCR具有 较好的重复性，结果可靠。
突变检测
检测范围广
荧光定量PCR可以检测各 种类型的基因突变，包括 点突变、插入和缺失等。
高通量
通过多重PCR和阵列技术， 可以对多个基因位点进行 高通量突变筛查。
准确性高
由于采用了实时监测和荧 光信号，荧光定量PCR能 够提高突变检测的准确性。
病原体检测与鉴定
快速准确
荧光定量PCR能够快速准确地检 测和鉴定病原体，为临床诊断和
治疗提供依据。
高灵敏度
对病原体进行特异性扩增后，荧 光定量PCR能够检测出极低浓度
的病原体。
鉴别分型
通过荧光标记的特异性探针，可 以对病原体进行分型和鉴别，有 助于了解疾病传播和流行病学调
特点
高灵敏度、高特异性、可定量分 析、可自动化等。
发展历程
01
02
03
04
1996年
美国PE-Cetus公司推出第一 台商业化荧光定量PCR仪。
1997年
ABI公司推出TaqMan荧光探 针技术。
2000年
实时荧光定量PCR技术开始广 泛应用于临床诊断和科研领域
。
2004年
数字PCR技术问世，实现了单 分子水平的检测。
荧光定量pcr工作原理及应 用ppt课件
目录
• 荧光定量PCR技术概述 • 荧光定量PCR工作原理 • 荧光定量PCR的应用 • 荧光定量PCR的优缺点 • 荧光定量PCR的未来发展
01
荧光定量PCR技术概述定义与特点 Nhomakorabea定义
荧光定量PCR原理及操作步骤ppt课件
参比荧光：管家荧光ROX
认识到了贫困户贫困的根本原因，才 能开始 对症下 药，然 后药到 病除。 近年来 国家对 扶贫工 作高度 重视， 已经展 开了“ 精准扶 贫”项 目
ROX校正效果
认识到了贫困户贫困的根本原因，才 能开始 对症下 药，然 后药到 病除。 近年来 国家对 扶贫工 作高度 重视， 已经展 开了“ 精准扶 贫”项 目
未结合SYBR Green 1 dye
认识到了贫困户贫困的根本原因，才 能开始 对症下 药，然 后药到 病除。 近年来 国家对 扶贫工 作高度 重视， 已经展 开了“ 精准扶 贫”项 目
SYBR Green I 应用范围
• 起始模板浓度定量
• 融解曲线分析
– ---可区分单一产物、变异产物、多种产物和（ 或）引物二聚体
模板
443.45 ng/ul
17.738 ng/ul
2♂
模板
686.75 ng/ul
26.47 ng/ul
①actin ③achi ⑤aly ②actin ④achi ⑥aly
⑦vlg ⑧vlg
⑨stat ⑩stat
认识到了贫困户贫困的根本原因，才 能开始 对症下 药，然 后药到 病除。 近年来 国家对 扶贫工 作高度 重视， 已经展 开了“ 精准扶 贫”项 目
认识到了贫困户贫困的根本原因，才 能开始 对症下 药，然 后药到 病除。 近年来 国家对 扶贫工 作高度 重视， 已经展 开了“ 精准扶 贫”项 目
定量PCR反应体系
模板cDNA Tag mixture 引物1 引物2 H20
4ul 10ul 0.5ul 0.5ul 5ul
①③⑤⑦⑨ ②④⑥⑧⑩
1♀
认识到了贫困户贫困的根本原因，才 能开始 对症下 药，然 后药到 病除。 近年来 国家对 扶贫工 作高度 重视， 已经展 开了“ 精准扶 贫”项 目
认识到了贫困户贫困的根本原因，才 能开始 对症下 药，然 后药到 病除。 近年来 国家对 扶贫工 作高度 重视， 已经展 开了“ 精准扶 贫”项 目
ROX校正效果
认识到了贫困户贫困的根本原因，才 能开始 对症下 药，然 后药到 病除。 近年来 国家对 扶贫工 作高度 重视， 已经展 开了“ 精准扶 贫”项 目
未结合SYBR Green 1 dye
认识到了贫困户贫困的根本原因，才 能开始 对症下 药，然 后药到 病除。 近年来 国家对 扶贫工 作高度 重视， 已经展 开了“ 精准扶 贫”项 目
SYBR Green I 应用范围
• 起始模板浓度定量
• 融解曲线分析
– ---可区分单一产物、变异产物、多种产物和（ 或）引物二聚体
模板
443.45 ng/ul
17.738 ng/ul
2♂
模板
686.75 ng/ul
26.47 ng/ul
①actin ③achi ⑤aly ②actin ④achi ⑥aly
⑦vlg ⑧vlg
⑨stat ⑩stat
认识到了贫困户贫困的根本原因，才 能开始 对症下 药，然 后药到 病除。 近年来 国家对 扶贫工 作高度 重视， 已经展 开了“ 精准扶 贫”项 目
认识到了贫困户贫困的根本原因，才 能开始 对症下 药，然 后药到 病除。 近年来 国家对 扶贫工 作高度 重视， 已经展 开了“ 精准扶 贫”项 目
定量PCR反应体系
模板cDNA Tag mixture 引物1 引物2 H20
4ul 10ul 0.5ul 0.5ul 5ul
①③⑤⑦⑨ ②④⑥⑧⑩
1♀
认识到了贫困户贫困的根本原因，才 能开始 对症下 药，然 后药到 病除。 近年来 国家对 扶贫工 作高度 重视， 已经展 开了“ 精准扶 贫”项 目
实时荧光定量PCR技术PPT课件(模板)
大多数荧光定模量板PCRD实N验的AC量T值越在1多8-30，之间荧。 光达到 荧rea光lm定阈a量steP值rCmRix的参数循解析环-- C数T值越少，即Ct值越小。
-引物和扩增产物二级结构的预测
乙1v肝标病准人品血ii+液9Lv中稀oHg释B模缓V的冲板绝液对，起定得量标始准浓品iii度与Ct值呈线 性关系。 已知在50%的乳腺肿瘤样本中, ERBB2表达异常, 因此可以作为一个检测标准
Sample
2 5
绝对定量分析几要素
✓ 一个目的基因 ——即需要确定其量值的核酸序列。 ✓ 一组标准样本 ——用来生成标准曲线。可以是含有目的基因的质粒、
PCR产物、基因组DNA等。 ✓ 重复反应孔 –——建议每个样本使用三个或更多重复反应，以确保统计
显著性。 ✓ 标记方法的选择——SYBR Green法或探针法均可。 ✓ 实验结果显示——扩增曲线；标准曲线；融解曲线（探针法不需要）。
SYBR Green I 染料法——优缺点
优点
缺点
使用方便，不必设计复杂 探针
具有价格优势
无模板特异性 对引物特异性要求较高 不能进行多重定量 灵敏度相对较低
Taqman探针法——原理
5′端标记有报告基团(Reporter, R) ，如FAM、VIC等
3′端标记有荧光淬灭基团 (Quencher, Q) 探针完整，R发射的荧光能量被Q基团吸收 ，无荧光， R与Q分开，发荧光 Taq酶有 5′→3′外切核酸酶活性，可水解探针
乙肝病人血液中HBV的绝对定量
PBMioeTr1－-FLAinMegdeenteecstieornie- sERBB2 双SY标BR准法曲实线验法流—程—及结注果意分事析项 样延本伸的 时采间集：、产处物理长和度制决备定；
-引物和扩增产物二级结构的预测
乙1v肝标病准人品血ii+液9Lv中稀oHg释B模缓V的冲板绝液对，起定得量标始准浓品iii度与Ct值呈线 性关系。 已知在50%的乳腺肿瘤样本中, ERBB2表达异常, 因此可以作为一个检测标准
Sample
2 5
绝对定量分析几要素
✓ 一个目的基因 ——即需要确定其量值的核酸序列。 ✓ 一组标准样本 ——用来生成标准曲线。可以是含有目的基因的质粒、
PCR产物、基因组DNA等。 ✓ 重复反应孔 –——建议每个样本使用三个或更多重复反应，以确保统计
显著性。 ✓ 标记方法的选择——SYBR Green法或探针法均可。 ✓ 实验结果显示——扩增曲线；标准曲线；融解曲线（探针法不需要）。
SYBR Green I 染料法——优缺点
优点
缺点
使用方便，不必设计复杂 探针
具有价格优势
无模板特异性 对引物特异性要求较高 不能进行多重定量 灵敏度相对较低
Taqman探针法——原理
5′端标记有报告基团(Reporter, R) ，如FAM、VIC等
3′端标记有荧光淬灭基团 (Quencher, Q) 探针完整，R发射的荧光能量被Q基团吸收 ，无荧光， R与Q分开，发荧光 Taq酶有 5′→3′外切核酸酶活性，可水解探针
乙肝病人血液中HBV的绝对定量
PBMioeTr1－-FLAinMegdeenteecstieornie- sERBB2 双SY标BR准法曲实线验法流—程—及结注果意分事析项 样延本伸的 时采间集：、产处物理长和度制决备定；
实时荧光定量PCR技术PPT课件(模板)
Cycle number
Sample
Ck 104
Ck 102 Lg of DNA concentration
qPCR 常用实验方法
A
B
C
简单 成本较低
适用于多重PCR 特异性较好
可进行SNP检测 特异性非常好
SYBR Green I 染料法——原理
SYBR Green I 是一种结合于所有dsDNA双螺旋小沟区域的具有绿色 激发波长的染料
大多数荧光定模量板PCRD实N验的AC量T值越在1多8-30，之间荧。 光达到 荧rea光lm定阈a量steP值rCmRix的参数循解析环-- C数T值越少，即Ct值越小。
-引物和扩增产物二级结构的预测
乙1v肝标病准人品血ii+液9Lv中稀oHg释B模缓V的冲板绝液对，起定得量标始准浓品iii度与Ct值呈线 性关系。 已知在50%的乳腺肿瘤样本中, ERBB2表达异常, 因此可以作为一个检测标准
待Sta测n样da本rd拷cu贝rv数e （copies/ul标）准=待品测样本浓度5×/样1本0分3 子量×268×.110814 28.64
C-不al要ibr有at连or续: 可4以个用G 带有PCR扩增子的合成的RNA或cDNA寡核苷酸；
输C乙用RHTee入肝Nfa值eol要 病tr-h是eTy查人ne判cRm找血e断NpR的液lAa实Nt蛋中eA验C白Hp成oBo或no功Vtl是r的s与o；l基绝(否N因对的T标标名定C重)准准称量检要品品验参q考PCR体系55××（11引00物45 ）
实验数据 实cD验NA步合骤成：(提两取步H法BVqRDTN-PAC；R)
T9a5q~m1 anS探lop针e法: -—3.—原理
c可D以NA是影含响有q目PC的R基敏因感的度质粒、PCR产物、基因组DNA等。
实时荧光定量PCR实验原理与技术 ppt课件
非特异的双链如引物二聚体或非特异性扩增产物等结合。
要避免这些非特异荧光信号对定量精确性的影响，可以利
用热循环仪内设定的熔解反应程序对扩增产物进行熔解曲 线分析。
熔解曲线峰为 单一峰形，未 见其他峰值， 并且峰的形状 也比较锐利。 扩增产物特异 性好。
qRT-PCR技术实验操作（优化）
有研究建议在每一个循环中 PCR 延伸后增加一步，即
水解探针法
分子信标
Scorpion引物/探针 复合探针
qRT-PCR技术影响因素
① 样品RNA 的完整性 ② RNA 样品中的基因组 DNA污染
③ 特异性良好的引物
④ PCR反应体系的优化 ⑤ 反转录所得 cDNA 的量必须精确地等于相应的
mRNA的量 ⑥ 可靠的内标基因：
TEF-2
热循环参数的设置 上机前样本的制备 检测程序的设置 运行检测程序果分析 扩增曲线 结果的显示与输出
qRT-PCR技术实验操作
qRT-PCR技术实验操作（优化）
qRT-PCR技术实验操作（优化）
qRT-PCR技术实验操作（优化）
假阳性：荧光染料能和任何 ds DNA 结合，因此它也能与
qRT-PCR技术实验操作（优化）
1、同管扩增：减少操作误差，引物间影响大
2、异管扩增：扩增结果真实可信，具有操作误差
总RNA提取； 2. 模板cDNA制作； 3. 半定量PT-PCR：
1.
1. 引物设计及选择：a)上下游引物设计在跨内含子的
2.
3. 4. 5.
一个外显子的5’端和下一个外显子的3’端。b)设计在 两个离得远的外显子上。 引物的长度：严格配对17-19bp。最后一个碱基为C或 G；GC含量为40％-60％之间。如此，管家基因与目 的基因的退火温度基本一致。长度一般设计为 350bp-600bp之间 内参的选择 同管扩增或异管扩增的选择 PCR循环数的选择
实时荧光定量PCR的原理、操作及其应用PPT课件
THANKS FOR WATCHING
感谢您的观看
它利用荧光染料或荧光探针标记特异性引物，在PCR反应过 程中，随着DNA或RNA的扩增，荧光信号被逐渐释放，通过 检测荧光信号的强度，可以实时监测DNA或RNA的扩增量。
实时荧光定量PCR的原理概述
实时荧光定量PCR的基本原理是在PCR反应体系中加入荧光染料或荧光探针，这些荧光物质 与DNA或RNA结合后，在特定波长光的激发下产生荧光信号。
环介导等温扩增技术
在恒温条件下进行核酸扩增，具有快速、特异性强和灵敏度高等优 点。
纳米材料与PCR的结合
利用纳米材料的特性，提高PCR的检测效率和灵敏度。
提高检测灵敏度与特异性
信号放大技术
通过使用信号放大系统，提高检测信号，从而提高检测灵 敏度。
特异性引物和探针的设计
针对目标基因设计特异性引物和探针，降低非特异性扩增 和交叉污染的风险。
选择合适的内参基因
选择稳定的内参基因
01
内参基因应具有稳定的表达水平，不受实验处理的影响。
验证内参基因的稳定性
02
通过实时荧光定量PCR技术，对候选内参基因进行稳定性评估。
使用多个内参基因参基因进行数据校正。
数据解读与报告
标准化处理
对原始数据进行标准化处理，消 除不同样本间的差异。
样本处理
对样本进行破碎、离心、 提取核酸等处理，以获得 待测的DNA或RNA。
浓度和纯度测定
使用紫外分光光度计等设 备测定核酸浓度和纯度， 确保符合实验要求。
引物设计与选择
引物设计
根据目标基因序列，利用 引物设计软件进行引物设 计。
引物筛选
根据实验需求，筛选出特 异性好、扩增效率高的引 物。
实时荧光定量PCR(qPCR,RT-PCR)的原理及应用ppt课件
pcrrtpcr反应体系模板45ltagmixture50l025l荧光染料sybrgreen荧光标记的探针taqman探针法rtpcrmonitoringpcrsybrgreendyesybrgreen变性退火延伸rtpcrsybrgreenrtpcr10rtpcrmonitoringpcrtaqmantaqman法11rtpcrtaqman法12taqmanrtpcr13?绝对定量absolutequantificationaq病原体检测转基因食品检测基因表达研究?相对定量relativequantificationrq基因在不同组织中的表达差异药物疗效考核耐药性研究rtpcr14相对定量通过内标定量内标定量结果代表了样本中所含细胞或基因组数rtpcr内标endogenouscontrol通常是18s28sactingapdh基因等看家基因在细胞中的表达量或在基因组中的拷贝数恒定受环境因素影响小15rtpcr16rtpcrctpcr扩增循环数荧光域值threshold的设定在定量pcr中需要经过数个循环后荧光信号才能够被检测到一般以15个循环的荧光信号作为荧光本底信号
4
实时荧光定量PCR的定义
PCR技术和荧光检测技术的结合
通过荧光染料或荧光标记的特异性探针，对PCR产物进行 标记跟踪，实时在线监控反应过程，通过仪器和相应的软 件分析结果，对待测样品的初始模板进行定量或定性分析。
5
RT-PCR技术的原理及试验流程
6
RT-PCR技术的原理及试验流程
7
RT-PCR技术的原理及试验流程
RT-PCR反应体系
模板
4.5μl
Tag mixture
5.0μl
F(F’)
0.25μl
R(R’)
0.25μl
4
实时荧光定量PCR的定义
PCR技术和荧光检测技术的结合
通过荧光染料或荧光标记的特异性探针，对PCR产物进行 标记跟踪，实时在线监控反应过程，通过仪器和相应的软 件分析结果，对待测样品的初始模板进行定量或定性分析。
5
RT-PCR技术的原理及试验流程
6
RT-PCR技术的原理及试验流程
7
RT-PCR技术的原理及试验流程
RT-PCR反应体系
模板
4.5μl
Tag mixture
5.0μl
F(F’)
0.25μl
R(R’)
0.25μl
最新实时荧光定量PCR介绍PPT课件
Probe设计要求高 Probe合成费用高
常用于mRNA表达量分析等
实时荧光定量PCR介绍
常用于SNP解析，病毒、病源菌检测
3/12/2024 • 11
主要内容
2
Real Time PCR实验方法
反转录反应
Real Time PCR反应
实时荧光定量PCR介绍
3/12/2024 • 12
RT Primer的选择
体外转录RNA标准品构建流程
目的基因
RT
目的基因
Total RNA cDNA
T7 Promoter
PCR
目的基因
TTTT•••T
PCR产物
T7 RNA polymerase
AAAA•••A
体外转录RNA
AAAA•••A
RNA纯化后，测OD定量。将RNA梯度稀释至105-101 copies/ul，作为标准品。
• Random Primer • Oligo dT Primer • Gene Specific Primer
Random 6mer Primer Gene Specific Primer
Oligo dT Primer
PCR F-Primer PCR R-Primer
实时荧光定量PCR介绍
3/12/2024 • 13
进行相对表达量分析。
实时荧光定量PCR介绍
3/12/2024 • 32
相对定量解析方法
管家基因
维持细胞基本代谢活动所必须的基因, 如：GAPDH、β-actin等。
筛选方法
• 根据文献提供 • 通过具体实验筛选
实时荧光定量PCR介绍
3/12/2024 • 33
主要内容
实时荧光定量PCR(qPCR,RT-PCR)的原理与应用
RT-PCR技术的数据分析
相对定量通过内标定量
内标（Endogenous Control） 通常是18S、28S、β-actin、GAPDH基因等看家基 因
在细胞中的表达量或在基因组中的拷贝数恒定， 受环境因素影响小
内标定量结果代表了样本中所含细胞或基因组 数量
RT-PCR技术的数据分析 PCR分四个阶段
SYBR Green法优缺点
RT-PCR技术的原理及试验流程
Monitoring PCR with TaqMan（ TaqMan法）
RT-PCR技术的原理及试验流程
TaqMan法
RT-PCR技术的原理及试验流程
TaqMan探针法优缺点
RT-PCR技术的数据分析
•绝对定量(Absolute Quantification，AQ) 病原体检测 转基因食品检测 基因表达研究 •相对定量(Relative Quantification，RQ) 基因在不同组织中的表达差异 药物疗效考核 耐药性研究
扣 除 背 景 荧 光 后 的 相 对 荧 光 量
PCR扩增循环数
2. Ct 值的定义
在荧光定量PCR技术中，有一个很重要的概念 —
— Ct值。C代表Cycle，t代表threshold，Ct值的含义是：
每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的
循环数（如图所示）。
RT-PCR技术的数据分如析 何定量？-ΔΔCt
5.0μl
F(F’)
0.25μl
R(R’)
0.25μl
荧光染料 SYBR Green I 荧光标记的探针TaqMan探针法
RT-PCR技术的原理及试验流程
Monitoring PCR with the SYBR Green I Dye（SYBR Green 法）
-实时荧光定量PCRppt课件
标准品的稀释 Real-time PCR 数据的分析 Real-time PCR产物的电泳
荧光定量 PCR 所使用的荧光化学可分为两种：荧光 探针和荧光染料。
荧光定量 PCR 最常用的方法是 DNA 结合染料 SYBR GreenⅠ的非特异性方法和 Taqman 水解探针 的特异性方法，
新疆医科大学第一附属医院
The First Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University
解曲线来分析产物的均一性有助于分析由 SYBR Green I 得到定量结果。另外， 因为 SYBR Green I 不能区分不同扩增子发出的荧光而导致它不能用于多重反
应。
新疆医科大学第一附属医院
The First Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University
新疆医科大学第一附属医院
The First Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University
-实时荧光定量 PCR
新疆医科大学第一附属医院
The First Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University
（一）实时荧光定量PCR原理 和应用
新疆医科大学第一附属医院
The First Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University
PCR 定量PCR 荧光化学监测物质 实时荧光定量PCR应用
ＰＣＲ技术
新疆医科大学第一附属医院
The First Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University
荧光定量PCR技术原理及应用课件
详细描述
VS
荧光定量PCR技术在病原体检测和耐药基因研究中具有高灵敏度、高特异性和快速检测的优势，有助于及时诊断和治疗相关疾病。
详细描述
针对不同病原体，荧光定量PCR技术可以设计特异性引物和探针，实现对病毒、细菌、寄生虫等病原体的快速检测。同时，该技术还可以用于耐药基因的检测和研究，为抗生素的合理使用和疾病治疗提供科学依据。
总结词
荧光定量PCR技术在基因表达分析中具有重要作用，能够检测基因在不同条件下的表达水平，有助于深入了解基因的功能和调控机制。
详细描述
通过荧光定量PCR技术，可以设计特异引物，对目的基因进行扩增，并实时监测扩增过程中的荧光信号，从而计算出目的基因的起始拷贝数和相对表达量。这种方法广泛应用于基因表达谱分析、转录因子研究、药物筛选等领域。
荧光定量PCR技术原理及应用课件
荧光定量PCR技术概述 荧光定量PCR技术原理 荧光定量PCR技术的应用 荧光定量PCR技术的优缺点 荧光定量PCR技术的实验操作流程 荧光定量PCR技术的应用案例
contents
目 录
01
荧光定量PCR技术概述
荧光定量PCR技术的定义
荧光定量PCR技术是一种在PCR反应过程中，通过荧光染料或荧光探针标记特异性寡核苷酸，实时监测PCR产物量的变化，实现定性和定量分析的技术。
根据实验需求，准备PCR引物、探针、DNA模板等必要材料。
对采集的样品进行预处理，如DNA提取、纯化等，确保样品质量满足PCR扩增要求。
实验准备和样品处理
样品处理
实验材料准备
按照PCR反应体系的要求，将引物、探针、DNA模板等组分加入到反应液中。
反应液配制
确保反应液中的组分充分混匀，以保证PCR扩增的均匀性。
VS
荧光定量PCR技术在病原体检测和耐药基因研究中具有高灵敏度、高特异性和快速检测的优势，有助于及时诊断和治疗相关疾病。
详细描述
针对不同病原体，荧光定量PCR技术可以设计特异性引物和探针，实现对病毒、细菌、寄生虫等病原体的快速检测。同时，该技术还可以用于耐药基因的检测和研究，为抗生素的合理使用和疾病治疗提供科学依据。
总结词
荧光定量PCR技术在基因表达分析中具有重要作用，能够检测基因在不同条件下的表达水平，有助于深入了解基因的功能和调控机制。
详细描述
通过荧光定量PCR技术，可以设计特异引物，对目的基因进行扩增，并实时监测扩增过程中的荧光信号，从而计算出目的基因的起始拷贝数和相对表达量。这种方法广泛应用于基因表达谱分析、转录因子研究、药物筛选等领域。
荧光定量PCR技术原理及应用课件
荧光定量PCR技术概述 荧光定量PCR技术原理 荧光定量PCR技术的应用 荧光定量PCR技术的优缺点 荧光定量PCR技术的实验操作流程 荧光定量PCR技术的应用案例
contents
目 录
01
荧光定量PCR技术概述
荧光定量PCR技术的定义
荧光定量PCR技术是一种在PCR反应过程中，通过荧光染料或荧光探针标记特异性寡核苷酸，实时监测PCR产物量的变化，实现定性和定量分析的技术。
根据实验需求，准备PCR引物、探针、DNA模板等必要材料。
对采集的样品进行预处理，如DNA提取、纯化等，确保样品质量满足PCR扩增要求。
实验准备和样品处理
样品处理
实验材料准备
按照PCR反应体系的要求，将引物、探针、DNA模板等组分加入到反应液中。
反应液配制
确保反应液中的组分充分混匀，以保证PCR扩增的均匀性。
荧光定量PCR原理及应用 ppt课件
2020/12/17
SYBR Greeppnt课件I 工作原理
17
2020/12/17
ppt课件
18
2020/12/17
ppt课件
19
• 一分子的产物生成就伴随着一分子荧光信
号的产生，随着循环数增加，荧光信号不
断积累。
2020/12/17
ppt课件
20
2020/12/17
ppt课件
21
• 模板不存在时形成茎环结构，荧光基团和
2020/12/17
ppt课件
12
• 相对定量：是通过与内参基因Ct值之间的相
差来计算表达基因的差异，也称之为2 -ΔΔCt
•。
2020/12/17
ppt课件
13
2020/12/17
ppt课件
14
• 荧光定量PCR的理论基础：均基于荧光共振
能量转移（FRET)的原理，即当一个荧光基 团与一个淬灭基团的距离邻近时（＜10nm)， 就会发生荧光能量转移，淬灭基团会吸收荧 光基团在激发光作用下的激发荧光，从而使
其发不出荧光。但如果荧光基团一旦与淬灭 基团分开，淬灭作用即消失。
2020/12/17
ppt课件
15
2020/12/17
ppt课件
16
• 在 PCR 反应体系中，加入过量 SYBR
荧光染料， SYBR 荧光染料特异性地 掺入 DNA 双链后，发射荧光信号，而 不掺入链中的 SYBR 染料分子不会发 射任何荧光信号，从而保证荧光信号 的增加与 PCR 产物的增加完全同步。
• CT值：每个反应管内的荧光信号到达设定
的域值时所经历的循环数被称为 CT 值 。
2020/12/17
rtqPCR实验操作 ppt课件
rtqPCR实验操作
荧光实时定量PCR rt-qPCR
定义
实时荧光定量PCR(rt-qPCR)： • 在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧 光信号的变化对PCR过程进行 实时监控，以 此实现对初始模板的定量分析。
Rt-qPCR的应用
• mRNA表达的研究 • 微小残留病变的检测 • 肿瘤耐药基因表达的研究 • 病毒感染的定量监测
4、按照排板的顺序往板内加样本混合物，每 孔18.4微升，加完后rt按qPCR实排验操作板顺序加相应的前
即实验组基因表达相较于对 照组上调或下调的倍数。
rtqPCR实验操作
荧光定量PCR如何减小误差 1、校准生物学误差：内参(管家基因) 2、降低随机误差
rtqPCR实验操作
1、校准生物学误差内参(管家基因)
rtqPCR实验操作
• 在相同的条件下，进行复制扩增，每扩增 一个循环，通过检验荧光来检测每个孔里 目标基因片段的含量，记录每个反应管内 的荧光信号达到设定的域值时所经历的循 环数（样本的域值循环数Ct），次数越多就 说明目标基因在原本的样品里越少，即初 始模板的量越少。
rtqPCR实验操作
logX= n (1+E)+logX0
rtqPCR实验操作
PCR基本原理
•试管中进行的DNA复制反应，依据
1.DNA半保留复制的机理
2.体外DNA分子于不同温度下可变性和复性的性 质
•通过人为控制体外合成系统的温度，使
1.双链DNA变成单链
2.单链DNA与人工合成的引物退火
3.DNA聚合酶使引物沿着单链模板延伸为双链
DNA。
rtqPCR实验操作
• 生物学重复：样品三次重复 • 技术重复：每个样品做3-4个复
荧光实时定量PCR rt-qPCR
定义
实时荧光定量PCR(rt-qPCR)： • 在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧 光信号的变化对PCR过程进行 实时监控，以 此实现对初始模板的定量分析。
Rt-qPCR的应用
• mRNA表达的研究 • 微小残留病变的检测 • 肿瘤耐药基因表达的研究 • 病毒感染的定量监测
4、按照排板的顺序往板内加样本混合物，每 孔18.4微升，加完后rt按qPCR实排验操作板顺序加相应的前
即实验组基因表达相较于对 照组上调或下调的倍数。
rtqPCR实验操作
荧光定量PCR如何减小误差 1、校准生物学误差：内参(管家基因) 2、降低随机误差
rtqPCR实验操作
1、校准生物学误差内参(管家基因)
rtqPCR实验操作
• 在相同的条件下，进行复制扩增，每扩增 一个循环，通过检验荧光来检测每个孔里 目标基因片段的含量，记录每个反应管内 的荧光信号达到设定的域值时所经历的循 环数（样本的域值循环数Ct），次数越多就 说明目标基因在原本的样品里越少，即初 始模板的量越少。
rtqPCR实验操作
logX= n (1+E)+logX0
rtqPCR实验操作
PCR基本原理
•试管中进行的DNA复制反应，依据
1.DNA半保留复制的机理
2.体外DNA分子于不同温度下可变性和复性的性 质
•通过人为控制体外合成系统的温度，使
1.双链DNA变成单链
2.单链DNA与人工合成的引物退火
3.DNA聚合酶使引物沿着单链模板延伸为双链
DNA。
rtqPCR实验操作
• 生物学重复：样品三次重复 • 技术重复：每个样品做3-4个复
实时荧光定量PCR技术原理ppt课件
样本处理与RNA提取
外界刺激 –10min – 可检测的表达改变 样品离开定义环境 –2min– 裂解、固定细胞 TRIzon（酚、异硫氰酸胍） 裂解液 （氰酸胍，异硫氰酸胍， SDS） 液氮 RNA保存液 小心DNA污染！ 使用DNase 阴性对照
逆转录
逆转录引物选择 下游应用：是否检测其它基因？ Abundant RNA的干扰：mRNA or total RNA？ 检测灵敏度是否足够？
传统PCR检测
Real-time qPCR
激发光
发射光
-- 在PCR反应体系中加入荧光基团。 -- 荧光基团在激发光的作用下，产生波长更长的发射光。 -- 利用荧光信号的变化动态监测整个反应过程。
荧光基团
扩增曲线（primary curve）
扩增曲线： 随着PCR反应的进行，扩增产物不断累积，荧光信号强度不断增加。每经过一个循环，收集一次荧光信号，通过荧光强度的变化监测扩增产物量的变化，从而得到扩增曲线图。 纵坐标：Rn（荧光值） 横坐标：cycle number（循环数）
lgX0与Ct值呈线性关系 根据Ct值可以计算出样本中起始模板所含有的拷贝数 起始拷贝数越多，Ct值越小。
Rn vs. Cycle number-- 扩增曲线
LogDNA vs. Ct -- 标准曲线
.
未知
104
103
106
105
102
10
标准曲线 (standard curve)
标准曲线分析 -- 对已知或未知样本进行系列浓度梯度稀释
主要内容
Real-time qPCR的定量原理
2
Real-time qPCR的检测方法
3
Real-time qPCR的基本概念
外界刺激 –10min – 可检测的表达改变 样品离开定义环境 –2min– 裂解、固定细胞 TRIzon（酚、异硫氰酸胍） 裂解液 （氰酸胍，异硫氰酸胍， SDS） 液氮 RNA保存液 小心DNA污染！ 使用DNase 阴性对照
逆转录
逆转录引物选择 下游应用：是否检测其它基因？ Abundant RNA的干扰：mRNA or total RNA？ 检测灵敏度是否足够？
传统PCR检测
Real-time qPCR
激发光
发射光
-- 在PCR反应体系中加入荧光基团。 -- 荧光基团在激发光的作用下，产生波长更长的发射光。 -- 利用荧光信号的变化动态监测整个反应过程。
荧光基团
扩增曲线（primary curve）
扩增曲线： 随着PCR反应的进行，扩增产物不断累积，荧光信号强度不断增加。每经过一个循环，收集一次荧光信号，通过荧光强度的变化监测扩增产物量的变化，从而得到扩增曲线图。 纵坐标：Rn（荧光值） 横坐标：cycle number（循环数）
lgX0与Ct值呈线性关系 根据Ct值可以计算出样本中起始模板所含有的拷贝数 起始拷贝数越多，Ct值越小。
Rn vs. Cycle number-- 扩增曲线
LogDNA vs. Ct -- 标准曲线
.
未知
104
103
106
105
102
10
标准曲线 (standard curve)
标准曲线分析 -- 对已知或未知样本进行系列浓度梯度稀释
主要内容
Real-time qPCR的定量原理
2
Real-time qPCR的检测方法
3
Real-time qPCR的基本概念
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实时荧光定量PCR的定义
PCR技术和荧光检测技术的结合
通过荧光染料或荧光标记的特异性探针，对PCR产物进行 标记跟踪，实时在线监控反应过程，通过仪器和相应的软 件分析结果，对待测样品的初始模板进行定量或定性分析。
克服了普通PCR：1、终点定量重复性不好 2、EB有毒，荧光太贵等缺点
实时荧光定量PCR的定义
如何定量？-ΔΔCt
PCR扩增循环数
3. Ct值与起始模板的关系 研究表明，每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存 在线性关系，起始拷贝数越多，Ct值越小。利用已知起始拷贝 数的标准品可作出标准曲线，其中横坐标代表起始拷贝数的对 数，纵坐标代Ct值。因此，只要获得未知样品的Ct值，即可从 标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。
PCR技术和荧光检测技术的结合
通过荧光染料或荧光标记的特异性探针，对PCR产物进行 标记跟踪，实时在线监控反应过程，通过仪器和相应的软 件分析结果，对待测样品的初始模板进行定量或定性分析。
RT-PCR技术的原理及试验流程
RT-PCR技术的原理及试验流程
RT-PCR技术的原理及试验流程
RT-PCR反应体系 模板 4.5μl Tag mixture 5.0μl F(F’) 0.25μl R(R’) 0.25μl
RT-PCR技术的数据分析
RT-PCR技术的数据分析
相对定量分析方法 -ΔΔCt
前提:目标序列和内参序列的扩增效率接近100％ 且偏差在 5％以内 1、用目标基因的CT值减内参基因的CT值：
ΔCT（test)= CT （target, test) - CT （ref, test) ΔCT（control)= CT （target, control) - CT （ref, control)
RT-PCR技术的数据分析 相对定量通过内标定量
内标（Endogenous Control） 通常是18S、28S、β-actin、GAPDH基因等看家基因
在细胞中的表达量或在基因组中的拷贝数恒定， 受环境因素影响小
内标定量结果代表了样本中所含细胞或基因组数 量
RT-PCR技术的数据分析
PCR分四个阶段
2、用试验样本的ΔCT值减校准样本的ΔCT值：
ΔΔCT= ΔCT（test/control) - ΔCT（calibrator)
3、计算表达水平比率： 相对表达量RQ= 2 –ΔΔCT
RT-PCR技术的数据分析
SYBR Green 熔解曲线分析
RT-PCR技术的应用
• 临床疾病诊断：各型肝炎、艾滋病、禽流感等传染病诊断 和疗效评价；肿瘤标志物及瘤基因检测实现肿瘤病诊断； 遗传基因检测实现遗传病诊断。 • 动物疾病检测：禽流感、猪瘟、沙门菌、大肠埃希菌、胸 膜肺炎放线杆菌、寄生虫病等。 • 食品安全：食源微生物、食品过敏源、转基因、乳品企业 阪崎肠杆菌等检测。 • 科学研究：医学、农牧、生物相关分子生物学定量研究。 • 应用行业：各级各类医疗机构、大学及研究所、检验检疫 局、兽医站、食品企业及乳品厂等。
如何定量？-ΔΔCt
PCR扩增循环数
2. Ct 值的定义 在荧光定量PCR技术中，有一个很重要的概念 — — Ct值。C代表Cycle，t代表threshold，Ct值的含义是： 每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的 循环数（如图所示）。
RT-PCR技术的数据分析
扣 除 背 景 荧 光 后 的 相 对 荧 光 量
Monitoring PCR with TaqMan（ TaqMan法）
RT-PCR技术的原理及试验流程
TaqMan法
RT-PCR技术的原理及试验流程
TaqMan探针法优缺点
RT-PCR技术的数据分析
•绝对定量(Absolute Quantification，AQ)
病原体检测 转基因食品检测 基因表达研究 •相对定量(Relative Quantification，RQ) 基因在不同组织中的表达差异 药物疗效考核 耐药性研究
实时荧光定量PCR(qPCR,RT-PCR) 的原理及应用
实时荧光定量PCR目录 Contents
一、实时荧光定量PCR的定义
二、RT-PCR技术的原理及试验流程 三、RT-PCR技术的数据分析 四、RT-PCR技术的应用
实时荧光定量PCR的定义
电泳 PCR
普 通
PCR
在PCR结束后对 终点产物 进行定量分析
RT-P究表明，每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存 在线性关系，起始拷贝数越多，Ct值越小。利用已知起始拷贝 数的标准品可作出标准曲线，其中横坐标代表起始拷贝数的对 数，纵坐标代Ct值。因此，只要获得未知样品的Ct值，即可从 标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。
RT-PCR技术的数据分析
扣 除 背 景 荧 光 后 的 相 对 荧 光 量
如何定量？-ΔΔCt
PCR扩增循环数
1. 荧光域值（threshold）的设定
在定量PCR中，需要经过数个循环后荧光信号才能够 被检测到，一般以15个循环的荧光信号作为荧光本底 信号。
RT-PCR技术的数据分析
扣 除 背 景 荧 光 后 的 相 对 荧 光 量
荧光染料
SYBR Green I
荧光标记的探针TaqMan探针法
RT-PCR技术的原理及试验流程
Monitoring PCR with the SYBR Green I Dye（SYBR Green 法）
变性
退火
延伸
RT-PCR技术的原理及试验流程
SYBR Green法优缺点
RT-PCR技术的原理及试验流程