苯酚降解菌分离浅谈

实验目的
掌握从土壤中分离苯酚降解菌的方法 掌握梯度平板法分离纯化细菌的方法 掌握革兰染色的方法
实验原理
取湖水污泥，在黑暗环境下的细菌富集， 将细菌在不断增加苯酚浓度的培养液中培 养，得到苯酚耐受菌或者降解菌。 分离出细菌，在苯酚培养液中培养进行 4-氨基安替比林分光光度法测定，比较苯酚 的前后含量确定其是不是降解菌。 特性测定本实验只做革兰染色 具体细菌种属的鉴定通过核酸进行
实验材料
• 1、耐酚培养基 ( g/L ) :酵母膏5.00g,蛋白胨 10.00g,NaCl10.00g，蒸馏水1L，PH7.0 • 琼脂16g，121℃灭菌20min。 • 2、苯酚无机盐培养( PMM,g/L ) :NH3 NO3 1.00,KH2 PO4 1.50,K HPO4 0.50,NaCl0.50,MgSO4 7H2O 0.10,pH7.0～ 7.2,苯酚作为碳源,浓度根据需要添加,固体 培养基加2.0%的琼脂.
实验方法
• 3.最优降解苯酚细菌鉴定 • 革兰染色显微镜下观察 • 用接种针挑取少许幼龄培养物，涂布在干净玻片 上的一滴无菌水中，风干固定。 • 用结晶紫的混合液染色1-2min后，用水洗。 • 碘液作用1min，水洗，吸干。 • 用95%的乙醇溶液脱色，流滴至洗脱液至无色(约 30s)。 • 用复红液复染约2-3min，水洗，风干，用油镜观 察。
实验方法
• 2降酚菌的分离纯化： • 1、梯度平板法 • ①制备梯度平板：12ml不含苯酚的无菌耐 酚培养基倾斜于一直径9cm的培养皿中，立 即将此培养基协防形成斜面，并刚好遮住 底。待凝固后，平放，再加入12ml含苯酚 固体培养，完全遮住下层。 • ②稀释涂布分离： • 样品液稀释：将富集的培养基做10倍系列 稀释（至10^-3）
实验材料
• 3、苯酚培养液：苯酚25-75mg，尿素0.1g， 微量元素10ml，蒸馏水90ml，PH7.0Baidu Nhomakorabea7.2， 121℃灭菌20min。 • 4、革兰染色所需试剂 结晶紫、碘液、95%乙醇、复红、香柏油 PH计，温度计，黑布，接种环，酒精灯， 显微镜
实验方法
• 一、细菌的富集和分离 • 1、从校园小河污泥中取污泥，称取5.00g加到50ml含有 25mg/L苯酚的PMM培养基中。 • 2、于30℃,.220r/min摇床5d培养后，分别添加3次苯酚无 机培养液。 • 隔3天后第一次添加PMM培养液，使苯酚终浓度分别增加 至100mg/l；隔3天后第二次添加PMM培养液，使苯酚终 浓度分别增加至200mg/l；第三次隔3天后，添加PMM培 养液，使苯酚终浓度分别增加至300mg/l 。 • 3、最后取培养液进行系列稀释后涂布于苯酚浓度为 300mg/L的PMM固体培养基平板上，30℃培养3d后挑取 形态上有差异的单菌落,。 • 以上所有培养均用黑布遮盖。
实验方法
• 样品涂液步平板：用无菌1ml移液管分别吸 取上述10^-3、10^-2、10^-1和原液依次滴 加于相应的平板上，并用无菌涂布棒从平 板中央均匀向四周涂布。 • 细菌培养：30℃恒温箱培养2天 • 降酚菌的纯化：用无菌接种环挑取高浓度 区的菌落接种到PMM培养基上，30℃恒温 培养3天
注意事项
• 1实验人员必须较为清晰的明白实验方法后 才可进行实验 • 2取污泥最好在水流缓的地方，污泥位置稍 微深一点的，细菌才多，机会才打 • 3用到苯酚时，使用手套、口罩防止中毒。
预期结果
经过几天培养后培养液变浑浊 在涂布分离中能观察到单细胞菌落 革兰染色可能为红色也可能为蓝色
本实验的困难
湖水污泥微生物中苯酚降解菌的 分离与特性测定
实验意义
苯酚是染料、农药、医药等行业 的重要生产原料和中间体,是工业废水 中的常见污染物之一。由于它具有较 强的生物毒性,许多国家已将其列入重 点污染物名单之中,并且采取各种措施 来消除环境中的苯酚污染。而且它的 水体污染很难去除。 所以在这些措施中,生物修复是一种低 成本的环境友好型污染消除方式,它的 关键是获得具有苯酚降解功能的微生 物。
• 实验技术不成熟，甚至不会，可能实验结 果没有是由于实验技术的原因，所以组员 要自己课下学习。 • 实验的未知性：目前分离的苯酚降解菌都 是在苯酚污染的环境中的分离出来的，学 校湖中的污泥不确定是否会分离出目的菌。 • 苯酚的毒性
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