基因重组

插入序列——IS
DNA分子经过重金属染色之后利用电镜观察，可以看到，环一茎一环的结 构是非常明显的。
复合转座子
❖复合式转座子（composite transposon） 是一类带有某些抗药性基因（或其他宿主基因） 的转座子，其两翼往往是两个相同或高度同源的 IS序列，
IS Resistance Gene(s) IS
λ噬菌体： attP 大肠杆菌： attB/ attλ
POP’ BOB’
1. 整和： BOB、+ POP、Int
POB’
IHF
BOP’+
2. 切除： BOP、+ POBI、nIHt,XFis POP
BOB+
位点专一性重组反应的定向特征取决
于重组位点的识别。
λ噬菌体的整合与切除
通过attP和attB间的相 互重组，环状的噬菌体 DNA转换为整合的原 噬菌体，原噬菌体通过 attL和attR间的相互重 组而切除
藏珠馆
第三章 可移动的遗传因子 和染色体外的遗传因子
染色体外遗传物质 ——质粒
定义和命名
❖ 质粒一般是指细菌染色体外的环状DNA分子。 质粒的命名：一个小写字母 p 加 2-3 个大写字母 和数字，如 pJP4，pDTG1。
能否通过接合作用传 递
拷贝数多少 相容性
分类
接合性质粒 非接合性质粒 严紧型质粒 松弛型质粒
DNA是以线状分子的形式进行转移，完成 转移后再形成环状DNA
形成有复制功能的质粒
质粒DNA的特征
3）相容性
▪ 两种结构相似密切相关的质粒不能稳定共存于一个宿 主菌的现象称为质粒的不相容性。
▪ 几种不同的质粒同时共存于一个菌细胞内则称相容性。
质粒 pBR322
pUC pACYC colE1
复制子 pMB1 pMB1 p15A colE1
单链DNA取代双链分子
RecA
中的同源链
RecA 单链取代反应
• 单链取代反应过程
包裹 DNA
联会前
互补序 列定位
联会阶段
置换 产生异源双
链DNA
后联会阶段
SSB：单链结 合蛋白，解开 参与重组的单 链DNA中的二
级结构
RecA 单链取代反应
源自文库
RuvAB
RuvA可识别 Holliday连接 的结构； RuvB是一种 ATPase，它 可发动迁移反 应。
在重组反应中活性最为明显的是由大肠杆菌染色体上rec基 因和ruv基因编码的一些酶。
RecBCD
RecA
RuvAB
RuvC
核酸酶 解旋酶 ATPase
RecBCD
作用 提供带有游离末端
的单链区
RecBCD
chi位点：5′GCTGGTGG3′
RecA 单链取代反应
前提条件
单链区
游离 3’末端
互补区
复制性转座的过程
Tn3转座子转座两步反应的简单示意图
第一步 由基因tnpA的表达产物催化， 含有转座子的质粒与目标质粒 融合形成共合体。在共合体的 形成过程中，转座子发生复制。 第二步 由tnpR的表达产物催化共合体 分解成两个质粒：已经整合了 转座子的目标质粒和供体质粒。
复制性转座的过程
第一步：两个质粒在图中标记的a-h处断裂产生自由末端。
重组的结果决定于重组位点 的位置和方向
参与基因表达的调节，发育 过程中程序性DNA重排
二、位点特异性重组
特异位点重组的结果依赖于重组位点的位置和方向
A 重组位点反方向位于同一DNA分子，重组结果发生倒位。 B 重组位点同方向位于同一DNA分子，重组发生切除；
位于不同分子， 重组发生整合
λ噬菌体的整合与切除
λ噬菌体DNA通过其attP位点和大肠杆菌DNA 的attB位点之间专一性重组而实现整合过程。
一段15bp的同源序列 位点专一性的蛋白质因子
保守性重组 不需要RecA 蛋白质的参与
λ噬菌体的整合与切除
位点专一性重组的核苷酸序列
❖1. POP’:O为15bp(核心)富含A-T的非对称序列； P为-160 ~ 0的160bp序列 P’为0 ~ 80的80bp序列, 共240bp
免疫球蛋白重排
VDJ重排
Ig基因均保留着各自的种 系构型，如重链和轻链的V 区均来自每一基因库中的多 基因片段。单一基因处段经 过选择性编码，并由DNA 重排组成功能性基因。
VDJ重排
在B淋巴细胞分化期 间，重链基因首选组合， 并分成两个阶段进行重排， 第一阶段为DH与JH基因 连接，第二阶段才是DH －JH与VH基因片段连接。
质粒DNA的特征
1）具有自我复制的能力 ▪ 拷贝数低者，复制往往与染色体的复制 同步，称为紧密型质粒。 ▪ 拷贝数高者，与染色体的复制不相关， 称松弛型质粒。
2）可转移性
质粒DNA的特征
供体细胞与受体细胞有效接合，形成供体 和受体对
蛋白质与DNA单链缺口处的5末端结合， 转移过程开始，缺口处称为转移起始区
重组体，若上下切则形成重组体。
两个DNA分子需要在对应 链相同位置上发生断裂
双链断裂启动重组。
双链断裂修复模型
双链断裂修复模型
双链断裂修复模型
两个联结体都在1 或2为剪切，产生
补丁产物 补丁+补丁=补丁 剪接+剪接=补丁
双链断裂修复模型
两个联结体在不 同位置上剪切， 形成交换产物
同源重组的酶
一旦形成复合转座子，IS序列就不能再单独移动，因为它们的功能被 修饰了，只能作为复合体移动。
复合转座子
复合转座子
复制性转座
非复制性转座
保守型转座
复制性转座的过程
Tn3转座子的结构 tnpA和tnpR两个基因是转座过程中必需的 res是转座过程的分解反应中重组发生的位点 bla基因编码一种内酰胺酶， 反向重复序列位于转座子的两端。 图中箭头代表每一个基因转录的方向。
Holliday结构：同源重组中连接两个DNA双链的交换中间 物含有4股DNA链，在连接处为了转换配对所形成交叉链 的连接点
Holliday模型
以E.coli的同源重组为例，了解同源重组机制的Holliday模型。
断裂
联接体
迁移
拆分
1
2
3
4
配对DNA双 链间同源链在 相对应位点断 裂，形成的切 口使得游离末 端可以移动。
复制性转座的过程
第二步 自由末端a和f以及g和d两两相接，而 末端b、c、e和h仍然保持为自由末端。 第三步 其中两个自由末端b和C分别作为 DNA復制 第四步 复制持续进行，直到末端b和C分别 与末端e和h相遇为止。这些末端进一 步连接形成完整的共合体。
注意：这时整个转座子（蓝色）已经被复制了一次。
Holliday模型
小结：
➢ 同源非姐妹染色单体DNA中两个方向相同的单链，在 DNA内切酶的作用下，在相同位置同时切开；
➢ 切开的单链交换重接，形成交联桥结构 ➢ 交联桥沿配对DNA分子“移动”。两个亲本DNA分子间
造成一大段异源双链DNA（ Holliday结构） ➢ 交联桥旋转1800，形成Holliday异构体； ➢ 通过两种方式之一切断DNA单链，若左右切，则形成非
❖转座子转座后可影响所在位置基因的表达。
插入序列——IS
插入序列——IS
Stanley Cohen过实验提供了一种转座子末端反向重复序列的图形证明 含有转座子的重组质粒DNA双链会被分开，并让它们各自退火，这样便可形成 茎环结构，反向重复序列会形成茎部，而被茎部分开的两个环分别是转座子的 内部基因（绿色）和原来的质粒序列（紫色和红色）。
引言
减数分 裂期
不同基因型 遗传物质彼 此能够转移
时间
地点
造成基因 型变化的 基因交流
过程
条件
作用
细胞核 线粒体 叶绿体
保证遗传 多样性
同源重组
大片段交换 需要RecA蛋白的介入
转座重组
依赖DNA交错剪切和 复制，需要转座酶， 解离酶
遗传重组主要类型
双股DNA 间的物 质交换
位点专一性
发生在特异位点 需蛋白的催化 涉及交错切割
拷贝数 15～20 500～700 10～12 15～20
质粒DNA的特征
4）编码的基因产物能赋予细菌某些特性
1）分子量小，稳定 2）可大量扩增，容易分离 3）可携带小于10kb外源DNA 4）带有选择性标记 5）含多克隆位点 （MCS) 6）容易转化
工程质粒
pBR322
pUC18/19
可移动遗传因子 转座子
异常重组
重组对中很少或没 有序列同源性
遗传重组主要类型
类型
同源 位点特异性
转座 异常
需同源序列
+ +
－ －
需RecA蛋白
需序列特异性 的酶
+
－
－
+
－
＋
－
？
同源重组
同源重组指发生在两条双链DNA的同源序列之间，涉及的 是大片段同源DNA序列的交换。
特征——进行同源重组的基本条件： 1） 在交换区具有相同或相似的序列：涉及同源序列间的 联会配对，且交换的片段较大； 2）单链DNA分子或单链DNA末端是交换发生的重要信号 3） 双链DNA分子之间互补碱基进行配对 4） 需要重组酶 5） 异源双链区的形成:涉及DNA分子在特定的交换位点发 生断裂和错接的生化过程；存在重组热点。
减数分裂时的染色单体之
间的交换，细菌的转化，
转导，接合，噬菌体重组
❖ 同源重组是同源依赖性的，而非 序列依赖性。所以任何两个具有 同源性的DNA分子可以通过此过程 进行重组。
❖ 同源重组有两个基本功能：遗传 混合和DNA修复。
❖ 同源重组见于减数分裂时的染色 体分配，DNA修复，转座等过程。
同源重组的分子机制
❖免疫球蛋白基因重排(Ig gene rearrangement)是通过一组V(D)J重组酶 (recombinase)的作用而实现的。
VDJ重排
各基因片段 （或其组合）
V基因 D基因 J基因 V×J（×D）连接组合 重链-轻链连接组合 H ×κ
H ×λ
重链 H
100-1000 20 6
1 2000-12 0000 6 ×106-6 ×107
7.2 ×1057.2 ×106
轻链 κλ 100 10 00 56
500 60
免疫球蛋白基因重排
一.转座子的发现
DNA transposable element
二. 定义
❖原核生物和真核生物基因组中存在着可以 从一个部位转移到另外一个部位的DNA序 列，这些序列称为转座子( transposon)。
❖病毒、细菌和真核细胞的质粒或基因组都 含有转座子，大多数转座子在插入新位点的 过程中依赖其特异的插入序列。
链交换(RecA+SSB) 缺口弥合（Holliday连结体）
分支移位(RuvA+RuvB) 分开(RuvC)
二、位点特异性重组
发生在一个特定的短的(20～ 200 bp)DNA序列内
特异的酶(重组酶)和辅助因子 对其识别和作用
位点特异性重组 指不依赖于DNA序列的同源性， 而依赖于能与某些酶相结合的特 异DNA序列的重组。
有切口的单链 分别与另一条 双链中的互补 链配对，由 DNA连接酶 封闭切口
原来的碱基对 被解开再形成 新的碱基对， 这个过程称为 分支迁移。
中间体拆分： 片段重组体 拼接重组体
Holliday模型
Holliday模型
Holliday模型
Holliday模型
Holliday模型
Holliday模型
RuvC
剪切只发生在与5‘ A/T-T-T-G/C符合的一致性序列的位点
同源重组的酶
在重组反应中活性最为明显的是由大肠杆菌染色体上rec基 因和ruv基因编码的一些酶。
RecBCD
RecA
RuvAB
RuvC
同源重组的途径
缺口靠近X (RecBCD)和DNA展开 RecA和SSB覆盖
侵入另一双链，D环形成 寻找同源区
四.转座效应
① 转座引起插入突变 ② 转座产生新的基因 ③ 转座产生的染色体畸变 ④ 转座引起的生物进化.
遗传重组
引言
❖广义： ▪ 广义的遗传重组指任何产生新的基因组合，从 而造成基因型变化的过程。包括独立分配或交 换
❖狭义： ▪ 狭义的遗传重组仅指涉及DNA分子内的断裂并 重新连接而造成基因重新组合的过程，即基因 交换
❖2. BOB’:B为-11 ~0序列 B’为0 ~11序列 共23bp
λ噬菌体的整合与切除
Int,IHF 和Xis 在 attP 上的结合位点
λ噬菌体的整合与切除
Λ噬菌体的插入、切除 拓扑异构酶I的活性
对整合起促进作用
与Int 结合成复合物，使BOP’ 和 POB’结合，促进重组
λ噬菌体的整合与切除
复制性转座的过程
第五步和第六步 转座子两个拷贝上的res位点之 间发生交叉重组，形成两个独 立的质粒，每个都含有一个拷 贝的转座子。
非复制性转座的过程
与制性转座所不同的是，在箭头指示的位点发生新的断裂。这样就 产生了丢失转座子的供体粒，而转座子与目标质粒相连，填补转座产生 的缺口和连接断痕，这样便形成了整合了转座子的新的目标质粒。供体 质粒的自由末端要么重新连接，要么就不连接，质粒被降解。