单克隆抗体制备典型实例
单克隆抗体制备流程图
单抗制备流程1975年,Kohler和Milstein发现将小鼠骨髓瘤细胞和绵羊红细胞免疫的小鼠脾细胞进行融合，形成的杂交细胞既可产生抗体,又可无限增殖，从而创立了单克隆抗体杂交瘤技术.这一技术上的突破不仅为医学与生物学基础研究开创了新纪元，也为临床疾病的诊、防、治提供了新的工具。
制备单克隆抗体包括动物免疫、细胞融合、选择杂交瘤、检测抗体、杂交瘤细胞的克隆化、冻存以及单克隆抗体的大量生产，要经过几个月的一系列实验步骤，下面按照制备单克隆抗体的流程顺序，逐一介绍其实验方法。
一、细胞融合前准备（一) 免疫方案选择合适的免疫方案对于细胞融合杂交的成功，获得高质量的McAb至关重要。
一般要在融合前两个月左右确立免疫方案开始初次免疫，免疫方案应根据抗原的特性不同而定.1.颗粒性抗原免疫性较强，不加佐剂就可获得很好的免疫效果。
下面以细胞性抗原为例的免疫方案:初次免疫1×10７／0.5ml ip （腹腔内注射)↓2～3周后第二次免疫1×10７／0。
5ml ip↓3周后加强免疫（融合前三天）1×10７／0.5ml ip或iv（静脉内注射）↓取脾融合2.可溶性抗原免疫原性弱，一般要加佐剂,常用佐剂：福氏完全佐剂，福氏不完全佐剂.要求抗原和佐剂等体积混合在一起，研磨成油包水的乳糜状，放一滴在水面上不易马上扩散呈小滴状表明已达到油包水的状态。
商品化福氏完全佐剂在使用前须振摇,使沉淀的分枝杆菌充分混匀。
初次免疫 Ag 1~50μg 加福氏完全佐剂皮下多点注射│(一般0.8～1ml 0.2ml／点)↓3周后第二次免疫剂量同上，加福氏不完全佐剂皮下或ip│(ip剂量不宜超过0.5ml)↓3周后第三次免疫剂量同上，不加佐剂,ip│（5～7天后采血测其效价,检测免疫效果）↓2～3周后加强免疫，剂量50～500μg为宜，ip或iv↓3天后取脾融合目前,用于可溶性抗原（特别是一些弱抗原）的免疫方案也不断有所更新，如①将可溶性抗原颗粒化或固相化，一方面增强了抗原的免疫原性,另一方面可降低抗原的使用量。
单克隆抗体的制备及应用实验原理
单克隆抗体的制备及应用实验原理1. 简介单克隆抗体是指由单一B细胞克隆扩增得到的抗体，在医学研究和生物制药等领域具有重要的应用价值。
本文将介绍单克隆抗体的制备方法及其在实验中的应用原理。
2. 单克隆抗体的制备方法单克隆抗体的制备需要经历以下几个步骤：2.1 免疫原的选择免疫原的选择是单克隆抗体制备的第一步。
通常选择与所需抗体结构最为相似的蛋白质作为免疫原，可以是纯化的蛋白质、重组蛋白、细胞表面抗原等。
2.2 免疫动物的免疫选择适当的免疫动物，常见的包括小鼠、大鼠、兔子等。
将免疫原与免疫佐剂混合注射到动物体内，触发免疫反应，使得免疫动物产生特异性抗体。
2.3 细胞融合将免疫动物的脾细胞和癌细胞进行融合，常用的癌细胞包括骨髓瘤细胞、淋巴瘤细胞等。
通过融合方法，使得脾细胞和癌细胞融合成为杂交瘤细胞。
2.4 杂交瘤细胞的筛选与培养对融合后的杂交瘤细胞进行筛选，常用的方法包括喷洒法、限稀稀释法等。
筛选出具有单克隆性的杂交瘤细胞后，进行培养、扩增。
2.5 单克隆抗体的纯化将培养得到的杂交瘤细胞进行离心、洗涤等操作，得到含有目标抗体的上清液。
通过柱层析、电泳等方法，对上清液进行纯化，最终得到单克隆抗体。
3. 单克隆抗体的应用实验原理单克隆抗体在实验室中有多种应用，包括免疫组化、免疫印迹、流式细胞术等。
以下将介绍单克隆抗体在这些实验中的应用原理：3.1 免疫组化免疫组化是一种检测组织或细胞中特定抗原表达情况的方法。
通过与组织或细胞中特定分子结合，单克隆抗体可以为我们提供目标抗原的定位和分布情况。
3.2 免疫印迹免疫印迹是一种检测特定蛋白质表达情况的方法。
通过将蛋白质转移到膜上，并与特异单克隆抗体结合，可以用于检测目标蛋白质的存在与定量。
3.3 流式细胞术流式细胞术是一种用于分析和鉴定细胞表面标记物的方法。
通过与特定抗原结合，单克隆抗体可以进行标记，并通过流式细胞仪进行检测和分析。
3.4 免疫沉淀免疫沉淀是一种用于富集目标蛋白质的方法。
单克隆抗体制备方法
单克隆抗体制备方法
1. 嘿，你知道单克隆抗体制备第一步是啥吗？就好像搭房子得先有稳固的地基呀，这第一步就是免疫动物。
比如给小老鼠打上特定的抗原，让它的免疫系统开始行动起来！
2. 然后呢，就要融合细胞啦！这就像把两种不同的力量汇聚在一起，产生奇妙的反应。
像骨髓瘤细胞和免疫细胞的融合，多神奇呀！
3. 筛选阳性克隆，哇哦，这可是个精细活儿呀！就好像在一堆沙子里找出金子一样不容易呢。
比如说在众多细胞中找出能产生我们需要抗体的那一个。
4. 接下来得克隆化培养啦！这就好似精心呵护一棵小树苗，让它茁壮成长。
把筛选出来的细胞好好培养，让它不断繁殖。
5. 扩大培养也很重要哟！这不就像把一个小团队发展成一个大部队嘛。
让细胞数量大量增加，为后面做准备。
6. 单克隆抗体的收集，哇，终于等到这一刻啦！就像收获辛勤劳作后的果实一般让人开心呀。
把产生的抗体收集起来。
7. 之后还得对抗体进行鉴定呢，这难道不像是给一件宝贝做个全面检查，看看它是不是真的厉害。
比如检测它的特异性啥的。
8. 纯化抗体也是必不可少的步骤呀，这就好比把杂质去掉，只留下最纯净的精华，让抗体更加好用。
9. 最后可别忘记保存抗体哦，要好好地保护起来，让它随时能发挥作用。
就像把宝贝放在一个安全的地方。
我的观点结论：单克隆抗体的制备真的是一个很神奇的过程，每一步都至关重要，需要我们认真对待才能得到好用的单克隆抗体呀！。
单克隆抗体制备实验步骤
单克隆抗体制备实验步骤
嘿，咱今儿就来唠唠单克隆抗体制备实验这档子事儿哈！
首先呢，得选个好苗子，就像咱挑水果得挑个水灵的，这就是要选对细胞啦。
把咱要的免疫细胞找出来，这可是关键的第一步哟！
然后呢，把这些小家伙放到合适的环境里，让它们好好长。
就好比给花浇水施肥，得让它们茁壮成长呀。
接着呀，得让这些细胞和骨髓瘤细胞来个亲密接触，这就像一场特别的相亲会，得找到最合适的那一对。
这可不是随便凑凑就行的，得精心挑选呢。
之后呢，把它们放在一块儿培养，看着它们融合在一起，就好像看到了新的希望诞生啦。
再然后，就得筛选啦！把那些不符合要求的淘汰掉，留下最棒的融合细胞。
这就像选秀比赛，只有最出色的才能留下来。
接下来，把这些选出来的宝贝们放到合适的地方继续培养，给它们提供最好的条件，让它们不断繁殖。
再往后，还得检测检测它们的能力呢，看看是不是真的厉害。
这就像考试，得检验一下真本事。
等确定了它们确实是我们想要的，那就可以大量生产啦！就像工厂生产产品一样，源源不断地制造出我们需要的单克隆抗体。
你想想，这过程多像培育一个小生命呀，从最开始的挑选，到精心呵护，再到筛选出最优秀的，最后让它发挥大作用。
这单克隆抗体制备实验可不简单，但要是做好了，那可真是了不起呀！它能帮我们解决好多难题呢，在医学、生物学等好多领域都大有用处。
所以呀，可别小瞧了这一系列步骤，每一步都得认真对待，就像对待一件珍贵的宝贝一样。
咱得有耐心，有细心，才能让这个实验成功呀！大家都加油吧，让我们一起在单克隆抗体制备实验的道路上越走越远，创造出更多的奇迹！怎么样，是不是觉得很有意思呀？。
大鼠单克隆抗体的制备
大鼠单克隆抗体的制备
大鼠单克隆抗体的制备主要分为以下几个步骤：
1. 免疫：将大鼠注射进目标抗原，以激发其免疫系统产生特异性抗体。
免疫可以通过多种途径进行，如皮下注射、腹腔注射等。
2. 细胞融合：将大鼠脾细胞（其中包括产生特异性抗体的B 细胞）和癌症细胞（如骨髓瘤细胞）进行融合，得到混杂瘤细胞（hybridoma）。
3. 筛选：利用选择性培养基选择出只有混杂瘤细胞能够生长的细胞克隆。
常用的选择性培养基是含有一种受抑制性物质（如无铁血红素）的培养基，这样只有混杂瘤细胞才能继续生长。
4. 鉴定：通过酶联免疫吸附实验（ELISA）等方法，对每一个混杂瘤细胞克隆进行鉴定，筛选出产生特异性抗体的克隆。
5. 扩大培养：将筛选出的克隆细胞进行大规模培养，以获得足够的抗体。
6. 纯化：通过离心、蛋白A/G亲和层析、凝胶过滤等方法，对培养上清液进行纯化，得到纯的大鼠单克隆抗体。
单克隆抗体制备的具体步骤
单克隆抗体制备的具体步骤
嘿，咱今儿就来唠唠单克隆抗体制备的那些事儿！
你想啊，要制备单克隆抗体，就像盖一座特别的房子。
第一步呢，
得选好材料呀，这就好比选建房子的砖头和瓦片。
咱得先找到合适的
抗原，这抗原就像是房子的基石，得稳稳当当的呢。
然后呢，就该让免疫细胞出马啦！把抗原注射到小鼠体内，让小鼠
的免疫系统动起来，产生抗体。
这小鼠啊，就像个勤劳的小工匠，努
力地工作着。
接着，等小鼠的免疫系统被激发得差不多了，就把它的脾脏取出来。
这脾脏就像是个藏宝库，里面有好多我们需要的宝贝细胞呢。
把脾脏
细胞弄出来后，再和骨髓瘤细胞融合在一起，这融合的过程就好像两
种不同的材料要完美结合在一起，变成一种全新的、更厉害的东西。
融合之后，可不是所有的细胞都能用哦，得经过筛选才行。
这就好
比在一堆沙子里找金子，得仔细挑挑拣拣呢。
把那些能产生我们想要
的抗体的细胞选出来，其他的就淘汰掉。
选出来的细胞还得培养呀，给它们提供一个舒适的环境，让它们好
好长大，多多生产抗体。
这就像照顾小树苗，得给它浇水、施肥，让
它茁壮成长。
最后，经过一系列的步骤，我们就能得到我们心心念念的单克隆抗体啦！这抗体就像是我们盖房子最后的成品，坚固又好用。
你说这单克隆抗体制备是不是很神奇？它就像是一个魔法的过程，把一些看似普通的东西，通过一系列复杂的操作，变成了非常有用的宝贝！这过程虽然有点复杂，但每一步都充满了惊喜和挑战呢。
咱要是能把这单克隆抗体给制备出来，那可真是了不起呀！你难道不想试试吗？。
单克隆抗体制备试验过程
单克隆抗体制备实验过程一、免疫动物免疫动物是用目的抗原免疫小鼠，使小鼠产生致敏B淋巴细胞的过程。
一般选用6-8周龄雌性Balb/c小鼠，按照预先制定的免疫方案进行免疫注射。
抗原通过血液循环或淋巴循环进入外周免疫器官，刺激相应B淋巴细胞克隆，使其活化、增殖，并分化成为致敏B淋巴细胞。
说明：FCA弗氏完全佐剂；FIA,弗氏不完全佐剂；Quickantibody,北京康碧泉公司研制的佐剂。
上表中第四种免疫方法产生的抗体大部份都为IgM,存在亲和力弱等缺点，慎用。
PS1、一般皮下注射每个注射点注射30-50ul左右混有佐剂的抗原，每只小鼠注射6-8个点为宜。
2、腹腔注射时，如果抗原混有弗氏佐剂，建议注射在左侧腹腔，如果采用右侧腹腔注射，则在免疫过程中，很容易导致小鼠脾脏与腹膜粘连的情况，造成后期取出脾脏麻烦。
3、冲击免疫完成后，应在96小时内完成细胞融合，否则相应的B 细胞数量会下降到未冲击前的水平。
二、细胞融合(Cellfusion)【材料和试剂】(1)骨髓瘤细胞悬液选好骨髓瘤细胞株，取体外培养对数生长期细胞或体内生长的肿瘤分离骨髓瘤细胞，制备细胞悬液。
(2)免疫小鼠脾细胞悬液取3天前加强免疫的小鼠，眼眶放血，？分离血清冻存备用。
拉颈处死小鼠，浸泡于75%酒精中3〜5min。
无菌操作取出脾脏，置入盛有5ml不完全培养液的平皿中洗涤，剪去周围的结缔组织，将脾脏移入另一盛有5ml不完全培养液的平皿中的钢网上，先用剪刀剪成3〜5个小块，然后用注射器内芯研磨。
将脾脏细胞悬液移至50ml离心管中，加不完全培养液50ml,1000r/min离心5min,弃上清，再以同法洗涤离心一次。
然后将沉淀细胞重新悬浮于10ml不完全培养液中，计活细胞数，一般一只小鼠可得〜2x108个脾细胞。
(3)饲养细胞将小鼠致死、体表消毒和固定后，用消毒剪镣从后腹掀起腹部皮肤，暴露腹膜。
用酒精棉球擦拭腹膜消毒。
用注射器注射10ml不完全培养基至腹腔，注意避免穿入肠管。
抗cd19单克隆抗体及其制备方法与应用
抗CD19单克隆抗体及其制备方法与应用1. 抗CD19单克隆抗体概述在免疫疗法领域，抗CD19单克隆抗体被广泛应用于治疗B细胞相关的疾病，尤其是B细胞恶性肿瘤和自身免疫疾病。
CD19是B细胞表面的一种标志性蛋白，它在B细胞的发育、激活和功能中扮演重要角色。
抗CD19单克隆抗体可以选择性地杀伤CD19阳性的B细胞，而对其他细胞几乎没有影响，从而成为治疗B细胞相关疾病的有效手段。
2. 抗CD19单克隆抗体的制备方法抗CD19单克隆抗体的制备主要通过以下步骤实现：1.免疫原：首先需要获得CD19的免疫原，常见的方法包括从CD19表达的细胞中提取膜蛋白或人工合成片段。
2.免疫动物：将免疫原注射到小鼠或大鼠等实验动物体内，触发其免疫系统产生抗CD19抗体。
3.融合细胞：从免疫动物中获取B细胞，并将其与瘤细胞或其它细胞融合，形成杂交瘤细胞，这些细胞能够不断产生具有特异性的抗CD19抗体。
4.提取与纯化：从培养基中提取并纯化目标抗体，经过一系列的纯化步骤，最终得到高纯度的抗CD19单克隆抗体。
3. 抗CD19单克隆抗体的临床应用抗CD19单克隆抗体作为治疗B细胞相关疾病的新战略，已在临床上取得了显著的成果。
以CAR-T细胞疗法为代表的治疗手段，就是通过将患者自身的T细胞进行基因改造，使其表达抗CD19单克隆抗体，从而实现对恶性B细胞的杀伤。
在自身免疫疾病的治疗中，抗CD19单克隆抗体也展现出了良好的疗效。
通过选择性地清除异常活化的B细胞，可以有效地控制自身免疫疾病的发作和进展。
4. 个人观点和理解抗CD19单克隆抗体作为一种新型的免疫治疗药物，不仅在临床上展现出了显著的疗效，而且为免疫疗法领域带来了新的活力和希望。
在未来，随着对其作用机制和临床应用的进一步深入研究，相信抗CD19单克隆抗体会在更多疾病的治疗中发挥重要作用，并为患者带来更好的治疗效果。
结语通过对抗CD19单克隆抗体的概述、制备方法和临床应用的全面探讨，我们对其在治疗B细胞相关疾病中的重要作用有了更深入的理解。
单克隆抗体的制备及应用ppt课件
29
现在学习的是第29页，共39页
XXXXXXXXXXXXXXXXXX
蛋白质提纯
先用待提纯蛋白质制成单抗，再将单抗固定在惰性固相 基质上，制 成层析柱。而后倒入混合液，当混合液流经单抗时，相应的蛋白质 与单抗特异性结合，杂质则随洗脱剂流走。再用特殊的洗脱剂将蛋 白质洗脱下来，则可将蛋白质提纯。
次黄嘌呤核 苷酸
TK+
胸腺嘧啶
胸腺嘧啶
脱氧核苷酸
DNA
现在学习的是第16页，共39页
• 小鼠HGPRT-骨髓瘤细胞（Sp2/0）
• 融合后的细胞在HAT选择培养基中结局
+ Sp2/0
B
Sp2/0 Sp2/0 BB
Sp2/0 B
死亡
死亡 存活
现在学习的是第17页，共39页
杂交瘤细胞的筛选及克隆化
18
19
现在学习的是第19页，共39页
XXXXXXXXXXXXXXXXXX
有限稀释法
3
4
43
42
22
m
32
44
m
14 1
4
3
3
3
3
3
4
44
3
33
现在学习的是第20页，共39页
大量制备及纯化
大量制备
21
现在学习的是第21页，共39页
XXXXXXXXXXXXXXXXXX
纯化方法
1、盐析 2、凝胶过滤 3、离子交换层析 4、亲和层析法
33
现在学习的是第33页，共39页
XXXXXXXXXXXXXXXXX
增强抗原的免疫原性
单克隆抗体制备过程
注射器抽取腹水 ，得大量单克隆抗体
2） 体外培养法
一段时间后
将杂交瘤细胞置于培养瓶中进行培养
收集培养上清液，
离心去除细胞及其碎片
得到单克隆抗体
单克隆抗体的应用
1、作为亲和层析的配体 2、作为生物治疗的定向武器 3、作为免疫抑制剂 4、作为研究工作中的探针 5、增强抗原的免疫原性
单个克隆所产生。
HT是次磺嘌呤（Hypoxanthine，10mmol/L）和胸腺嘧啶核苷（Thymidine，1.6mmol/L） 的混合剂，溶解后用培养液稀释，作为DNA补救合成途径的补充剂用于杂交瘤筛选培养基 的添加剂和营养添加剂以克服细胞内残留氨基喋呤（Aminopterin）对DNA经典合成途径的
单克隆抗体的制备
一、B淋巴细胞与骨髓瘤细 胞的获取
免疫小鼠
注射特定抗原
脾脏中B细胞
骨髓瘤细胞 细胞培养
骨髓瘤细胞
二、细胞融合
在外力(诱导剂或促融剂)作用下,两个或两个以上的异源(种、属间)细胞或 原生质体相互接触,从而发生膜融合、胞质融合和核融合并形成杂种细 胞的现象称为细胞融合或细胞杂交。
骨
B
抑制作用。
分离单个细胞进行克隆化培养
上清液 中检测 到所需 的X抗 体
检查菌落
上清液中检 测到所需的 X抗体
如何检测抗体？
• 检测各孔分泌的特异性抗体的方法一般以快速、简便、特 异、敏感为原则，并考虑抗原的性质和抗体的类型不同， 选择不同的筛选方法。最常用的方法是ELISA(即 酶联免 疫吸附剂测定 )，此外也可用放射免疫测定、免疫荧光检 测及细胞毒性试验。 ELISA常用的四种方法
髓 瘤
细 胞
EPG诱导法
细 胞
单克隆抗体的制备方法
一、单克隆抗体的概念和原理免疫反应是人类对疾病具有抵抗力的重要因素。
当动物体受抗原刺激后可产生抗体。
抗体的特异性取决于抗原分子的决定簇，各种抗原分子具有很多抗原决定簇，因此，免疫动物所产生的抗体实为多种抗体的混合物。
用这种传统方法制备抗体效率低、产量有限，且动物抗体注入人体可产生严重的过敏反应。
此外，要把这些不同的抗体分开也极困难。
近年，单克隆抗体技术的出现，是免疫学领域的重大突破。
（1）单克隆抗体的基本概念抗体主要由B淋巴细胞合成。
每个B淋巴细胞有合成一种抗体的遗传基因。
动物脾脏有上百万种不同的B淋巴细胞系，含遗传基因不同的B淋巴细胞合成不同的抗体。
当机体受抗原刺激时，抗原分子上的许多决定簇分别激活各个具有不同基因的B细胞。
被激活的B细胞分裂增殖形成该细胞的子孙，即克隆由许多个被激活B细胞的分裂增殖形成多克隆，并合成多种抗体。
如果能选出一个制造一种专一抗体的细胞进行培养，就可得到由单细胞经分裂增殖而形成细胞群，即单克隆。
单克隆细胞将合成一种决定簇的抗体，称为单克隆抗体。
（2）单克隆抗体技术的基本原理要制备单克隆抗体需先获得能合成专一性抗体的单克隆B淋巴细胞，但这种B淋巴细胞不能在体外生长。
而实验发现骨髓瘤细胞可在体外生长繁殖，应用细胞杂交技术使骨髓瘤细胞与免疫的淋巴细胞二者合二为一，得到杂种的骨髓瘤细胞。
这种杂种细胞继承两种亲代细胞的特性，它既具有B淋巴细胞合成专一抗体的特性，也有骨髓瘤细胞能在体外培养增殖永存的特性，用这种来源于单个融合细胞培养增殖的细胞群，可制备抗一种抗原决定簇的特异单克隆抗体。
其制备原理示意如下：二、基本方法1. 抗原提纯与动物免疫对抗原的要求是纯度越高越好，尤其是初次免疫所用的抗原。
如为细胞抗原，可取1×107个细胞作腹腔免疫。
可溶性抗原需加完全福氏佐剂并经充分乳化，如为聚丙烯酰胺电泳纯化的抗原，可将抗原所在的电泳条带切下，研磨后直接用以动物免疫。
选择与所用骨髓瘤细胞同源的BALB/c健康小鼠，鼠龄在8～12周，雌雄不限。
单克隆抗体的制备及其应用
4、 第二次免疫 用弗式不完全佐剂和红细胞按照 1:1 的比例进行混合，混合后同样进行磨合。磨合方法及程 度和第一次相同。 取 2mL 佐剂抗原，对兔子进行皮内注射和肌肉注射，肌肉注射 1mL，皮下注射 1mL。在肌 肉注射时不需要多点注射。而在皮下注射时要多点注射。 注射完成后把兔子养 1 周左右。 5、 第三次免疫 用抗原液 2mL 对兔子进行多点皮下注射和肌肉注射。肌肉注射 1mL，皮下注射 1mL。要求 和前几次免疫相同。 注射完成后把兔子养 1 周左右。 6、 第四次免疫 用抗原液 2mL 对兔子进行多点皮下注射和肌肉注射。肌肉注射 1mL，皮下注射 1mL。要求 和第三次注射相同。 注射完成后把兔子养 1 周左右。 7、 采血 此时的兔子体内已经产生了大量针对 A 型血液的抗体。兔子的采血采用心脏采血的方法。 用手固定兔子的后腿和前肢，使兔子侧卧，露出左侧部分。用手找到兔子的心跳最厉害的部 位，再用针头快速扎入即可，如果扎对了位置，是很容易抽出血液的。但不要在动脉或者静 脉采血，这些部位的采血难以保证无菌。 8、 梯度离心 其实兔子血内含有抗 A 型血的抗体和大量产生抗体的浆细胞，通过梯度离心分离出少量的 抗 A 型血的抗体和一些浆细胞。而所产生的抗体由于量过少不具有使用价值。可以通过梯 度离心将兔血清分离出来，用它与 A 型血红细胞相反应，来鉴定抗体的质量。 9、 细胞培养 将从兔子体内分离的浆细胞进行体外培养。在 37°C 条件下、95%的空气加 5%的二氧化碳 的条件下，使用血清培养基，放在三角瓶中培养让细胞贴壁生长。这个过程中一定要注意无 菌，否则就要重新做。 10、 细胞融合
抗 A 型红细胞单克隆抗体的制备及应用 一、什么是单克隆抗体 单克隆抗体（monoclonal antibody，McAb）是指由一个 B 细胞克隆分化增值的子代细胞（浆 细胞）产生的针对单一抗原的抗体。单克隆抗体只针对一种抗原决定簇，也就是只针对一种 抗原具有特异性结合的特性。具有高效性，往往能够迅速结合并清除侵入体内的抗原。 制备单克隆抗体的基本原理： 我们可以把分离到的 A 型血液纯化，获得大量红细胞，这些红细胞在 A 血型的人体内是不 会产生特异性免疫的， 所以这里不能把纯化的红细胞注入体内进行制备单克隆抗体。 这样我 们可以把这些打入异源动物如兔子的体内， 这样兔子就能产生针对这一红细胞的特异性抗体， 然后经过分离、酶切等就可以获得抗 A 型的单克隆抗体了。要想获得大量的单克隆抗体， 可以将兔体内的浆细胞提取出来与肿瘤细胞杂交， 这样， 杂交的细胞就获得了无限增值的特 性，并且能够分泌特定的单克隆抗体。 二、如何制备具有抗 A 型红细胞的单克隆抗体？ 1、 获得大量 A 型红细胞 从 A 血型的人体内抽取一定量的血液，加入抗凝血剂，在进行梯度离心，分离出纯净的红 细胞。低温保存。离心速度不宜过快或者过久，否则红细胞易破裂发生溶血现象。 2、 免疫前的准备 佐剂是非特异性免疫增强剂， 与抗原一起注射或预先注射入机体内时， 可增强机体对抗原的 免疫应答。目前使用的佐剂有很多种，这里选用弗氏佐剂。弗氏佐剂分为弗氏完全佐剂和弗 式不完全佐剂。 弗式完全佐剂的制备： 在油相中加入死分枝杆菌 （终浓度为 0.25mg/mL） 。 弗式不完全佐剂： 液体石蜡与羊毛脂混合而成，通常为 4:1，配置好后要高压灭菌。 3、 第一次免疫 用弗氏完全佐剂和红细胞按照 1:1 的比例进行混合，混合后进行磨合。磨合可以使用玻璃针 管反复推拉，至佐剂抗原滴入水中既不会产生大面积油花，也不会分层。 取 1mL 佐剂抗原， 对兔子进行多点皮下与皮内注射。 再注射的时候要小心， 不要感染兔子。 在皮下注射应提起兔子的表皮，将针扎入表皮下的空隙内。而皮内注射不需要提起表皮，并 且注射完后会鼓起一个小包。 注射完成后把兔子养 2 周左右。
单克隆抗体制备技术的主要步骤
单克隆抗体制备技术的主要步骤单克隆抗体的制备，就像是一场科学的探险，充满了刺激和挑战，咱们从头说起。
得从小老鼠说起。
这小家伙可不是普通的宠物，而是咱们的英雄。
科学家会给它注射一些特定的抗原，这个抗原就像是个小小的“敌人”，让小老鼠的免疫系统开始工作，嘿，想想就有点好玩。
小老鼠体内开始产生各种抗体，搞得它好像身处战斗的第一线，真是个勇敢的小战士。
得等小老鼠慢慢“发威”，这些抗体就像是它的战斗力，越多越好。
经过一段时间后，咱们就能从小老鼠的体内提取到它的脾脏。
听起来是不是有点吓人？其实这就像是从老鼠身上“挖掘”出宝藏，没什么大不了的。
小老鼠的脾脏里含有大量的B细胞，这些B细胞可是产生抗体的主力军，简直就是抗体工厂。
一旦得到了脾脏，接下来就要把这些B细胞和一些肿瘤细胞融合在一起。
这个步骤可谓是“天生一对”，因为肿瘤细胞能在体外无限增殖，而B细胞则是抗体的“工匠”。
融合之后，咱们就得到了混合细胞，哎哟，真是个“好组合”。
这时候，有些细胞会自顾自地生活，有些则会变得非常专一，开始专门生产一种特定的抗体。
就像一个公司里的员工，有的人忙着做自己的事情，有的人却只关注某一项工作。
经过一番筛选，找到那些生产抗体的细胞，这个过程叫做“克隆”。
从一开始的“乱七八糟”到最后的“精英出战”，真是让人激动！每一批细胞都被放在特定的培养基里，细心照料，让它们茁壮成长。
这些小细胞们在培养基里就像小鱼在水里，游来游去，慢慢地，咱们就能从中筛选出那些最棒的抗体制造者。
咱们就得让这些优质细胞开始大量生产抗体。
把它们放进大大的培养罐里，给它们提供营养，让它们“好好干活”。
这时候，抗体就像流水线上的产品，源源不断地出来，真是让人看得眼花缭乱。
经过几天的忙碌，咱们就能得到一大桶一大桶的抗体，简直是喜从天降。
不过，光有抗体可不行，得把它们从培养液中提取出来。
这就需要一些“化学小把戏”了，用离心机把细胞和培养基分开，然后收集那些抗体。
提取出来的抗体就像是经过千辛万苦的矿工，终于挖到了宝藏。
单克隆抗体制备实验报告
一、实验目的1. 了解单克隆抗体制备的基本原理和实验流程；2. 掌握单克隆抗体制备过程中各步骤的操作方法；3. 通过实验，获得特异性单克隆抗体。
二、实验原理单克隆抗体是由单个B细胞克隆产生的高度均一、仅针对某一特定抗原表位的抗体。
制备单克隆抗体的基本原理是杂交瘤技术，即将具有分泌特异性抗体能力的致敏B细胞和具有无限繁殖能力的骨髓瘤细胞融合，形成杂交瘤细胞，进而培养出单克隆细胞，最终获得单克隆抗体。
三、实验材料1. 实验动物：Balb/c小鼠；2. 细胞：SP2/0骨髓瘤细胞；3. 抗原：待筛选的抗原；4. 试剂：弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂、氢氧化铝佐剂、细胞培养液、抗生素、无菌操作器具等。
四、实验步骤1. 动物免疫（1）首免：将抗原与弗氏完全佐剂混合，通过多点注射法注射给Balb/c小鼠，剂量为150-200g/只。
（2）加强免疫：在首免后2-3周，重复首免过程。
2. B细胞提取（1）无菌操作，处死小鼠，取脾脏，制成单细胞悬液。
（2）用细胞分离液分离B细胞。
（3）洗涤、计数，调整细胞浓度。
3. 细胞融合（1）将B细胞与SP2/0骨髓瘤细胞按一定比例混合，加入聚乙二醇（PEG）诱导细胞融合。
（2）将融合细胞在含有抗生素的细胞培养液中培养。
4. 杂交瘤细胞筛选（1）在培养液中加入抗原，筛选出能分泌特异性抗体的杂交瘤细胞。
（2）将筛选出的杂交瘤细胞进行克隆化培养，获得单克隆细胞。
5. 单克隆抗体制备（1）将单克隆细胞在培养液中扩大培养，收集上清液。
（2）对上清液进行抗体检测，鉴定抗体特异性。
（3）采用适当方法纯化抗体，如亲和层析、离子交换层析等。
五、实验结果1. 成功获得特异性单克隆抗体。
2. 抗体特异性经ELISA等方法验证，与待筛选抗原具有高度特异性。
3. 抗体亲和力良好，可用于后续实验。
六、实验总结本次实验成功制备了特异性单克隆抗体，掌握了单克隆抗体制备的基本原理和实验流程。
在实验过程中，应注意以下几点：1. 动物免疫时，抗原与佐剂的混合比例、注射剂量、注射次数等要严格控制。
单克隆抗体的制备
单克隆抗体的制备1975年Kohler和Milstein发现将小鼠骨髓瘤细胞与和绵羊红细胞免疫的小鼠脾细胞进行融合，形成的杂交瘤细胞既可产生抗体，又可无性繁殖，从而创立了单克隆抗体杂交瘤技术。
这一技术上的突破使血清学的研究进入了一个高度精确的新纪元。
免疫细胞化学的技术关键之一是制备特异性强、亲合力大、滴度高的特异性抗体，由于每种抗原都有几个抗原决定簇，用它免疫动物将产生对各个决定簇的抗体，即多克隆抗体。
单克隆抗体则是由一个产生抗体的细胞与一个骨髓瘤细胞融合而形成的杂交廇细胞经无性繁殖而来的细胞群所产生的，所以它的免疫球蛋白属同一类型，质地纯一，而且它是针对某一抗原决定簇的，因此特异性强，亲合性也一致。
单克隆抗体（McAb）的特性和常规血清抗体的特性比较见2-3。
单克隆抗体的制备方法如下：一、动物的选择与免疫1．动物的选择纯种BALB/C小鼠，较温顺，离窝的活动范围小，体弱，食量及排污较小，一般环境洁净的实验室均能饲养成活。
目前开展杂交瘤技术的实验室多选用纯种BALA/C小鼠。
2材料：PBS，抗原，完全和不完全弗氏佐剂，纯种品系小鼠(6-8周)，22-G注射针头，带塞的3ml注射器，双头带塞的连接器，无菌剪刀，剃须刀片，解剖刀片，木质涂棒步骤1)准备等体积PBS含25-100ug抗原和弗氏完全佐剂的乳化液(200-400ul/鼠)。
用双头带塞的连接器连接两个注射器，一个注射器装抗原，另一个装佐剂。
来回推压注射器使得其内容物从一侧到另一侧注射器，推压5-10min直到得到稳定的乳化液。
2)初次免疫：用22-G的针给小鼠腹腔注射(每个抗原3-5只小鼠)。
3)二次免疫:3周后，用等体积的含10-50ug抗原的PBS和不完全弗氏佐剂配制成(200-400ul)的乳化液再次腹腔注射。
4)第二次免疫后7天，用无菌剪刀或剃须刀片切掉小鼠尾巴0.5cm采血，收集100-200ul血装于1.5ml的EP管中。
用拇指和食指积压尾巴可以方便采血。
单克隆抗体制备——单抗生产25
单克隆抗体
腹水生产法
目前最常见的单克隆抗体生产主要是细胞培养发酵法和小鼠腹水生产法；细胞发酵生产法由于受到实验条件和生产成本的影响，一般的实验室还是更青睐于小鼠的腹水生产法。
小鼠腹水生产法一般要先给小鼠腹腔注射降植烷、液体石蜡或者弗氏不完全佐剂，目前弗氏不完全佐剂应用的最多。
并不是所有的细胞株注入小鼠的腹腔都能顺利产生腹水的，不产腹水除了跟细胞株、小鼠有关系外，还有很多不明原因，基于以上原因，Frdbio推出腹水强力诱导剂。
小鼠腹水生产
1. 提前一周小鼠腹腔注射0.5ml弗氏不完全佐剂。
2. 每只小鼠腹腔注射0.5～1×107处于对数生长期的杂交瘤细胞。
3. 7～15天小鼠腹部逐渐涨大，此时可以采用16号针头通过腹部穿刺抽取腹水，每次可取4～5ml,间隔2天左右可以再行抽取，一般每只老鼠可以抽取2～3次。
4. 抽取的腹水需要及时离心，2,000离心5min,吸取中间水相层。
抽取的腹水含有大量细胞、脂肪和油状弗氏佐剂。
5. 脂质的去处：每10ml腹水加入150mg 二氧化硅，摇动混匀孵育2h，2,000rpm离心20min，取上清。
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“研究对象”
没有硬件，没有软件 有硬件，没软件 硬件软件均有，进行过单抗制备，但未筛选到抗体或未筛选 到合适的抗体 试剂盒开发外包：抗体配对，抗体竞争
LPS脂多糖单克隆抗体制备
客户需求：IgG型抗体 问题所在：LPS为脂类蛋白，有佐剂的功能，每次免疫均为初次免疫， 常规免疫方案无法得到有效的IgG表达 方案解决： 1.通过查阅相关文献，LPS属于超级抗原，本身具有免疫应答作用，同 时该蛋白释放IgG时间较其他蛋白稍晚！ 2.免疫方案：常规免疫2次，使机体产生抗血清；随后在加强免疫后的 第3、5、7、10天进行连续加强免疫；在加强免疫后的第3、5、7、10、 14天采血检测IgG特异抗血清的效价
/view/117180.htm?fr= ala0_1
单克隆抗体制备的基本原理与过 有什么意义？ 程？有什么意义？
哈哈~我们刚考到这题 原理： B淋巴细胞在 抗原的刺激下，能够分化、增殖形成具有针 对这种抗原分泌特异性抗体的能力。B细胞的 这种能力和量是有限的，不可能持续分化增 殖下去，因此产生免疫球蛋白的能力也是极 其微小的。将这种B细胞与非分泌型的骨髓瘤 细胞融合形成杂交瘤细胞，再进一步克隆化， 这种克隆化的杂交瘤细胞是既具有瘤的无限 生长的能力，又具有产生特异性抗体的B淋巴 细胞的能力，将这种克隆化的杂交瘤细胞进
PBS 0.051 0.032 0.047
Ab包被 包被 Ac包被 包被 C包被 包被
0.123 3.501 0.729
“采摘”
蛋白信息——免疫原：来源，大小，缓冲体 系，保存条件，稳定性(是否容易降解)，天然？ 重组？ 筛选原：纯度(纯度越高越能得到高特异的抗 体)？是否进行对筛？ 抗体应用：ELISA？WB？IHC？配对？竞争？
1:1000
1:3000 0.103 3.501 0.334
1:9000 0.055 2.938 0.128
1:27000 0.061 1.879 0.081
1:81000 0.058 0.802 0.058
1:246000 0.079 0.351 0.046
1:738000 0.043 0.12 0.048
单克隆抗体名词解释
抗体主要由机体的B淋巴细胞合成，每个B淋 巴细胞有合成一种抗体的遗传基因。当机体 受抗原刺激时，抗原分子上的许多决定簇分 别激活各个具有不同基因的B细胞。被激活的 B细胞分裂增殖形成该细胞的子孙，即克隆。 如果选出一个合成一种抗体的细胞进行培养， 就可得到由单细胞经分裂增殖而形成细胞群， 即单克隆。单克隆细胞所合成的抗体即为单 克隆抗体。
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1.结果显示，加强免疫后的第10天开始血清效价在下降！ 2.融合时间的选择：常规融合在最终免疫后的3—5天；本项Байду номын сангаас融 合选在最终免疫后的第7天进行融合 3.结果：筛选得到的阳性细胞株均为IgG型
Cry1系列单克隆抗体制备
客户需求：筛选出特异抗Ac的单克隆抗体 问题所在：Ac与对筛蛋白Ab之间交叉严重，常规筛选方法 无法准确的筛选出特异Ac抗体且操作繁琐 方案解决：应用免疫磁珠方法分别将Ac和Ab偶联在免疫免 疫磁珠上，再用该偶联免疫磁珠筛选细胞，排除Ab抗性的细 胞，选择Ac抗性的细胞
1. 先将融合细胞过Ab蛋白-磁珠，排除分 泌Ab蛋白的融合细胞；再将非Ab分泌 细胞过Ac单笔-磁珠筛选出Ac分泌融合 细胞进行培养 2. 经过筛选获得4株分泌Ac单克隆抗体