植物叶绿体色素的提取

植物叶绿体色素的提取、分离、表征及含量

测定

路环 08生化制药技术2班指导教师张业

实验目的

利用化学手段提取和纯化植物叶片中的叶绿素、胡萝卜色素，并利用光谱技术（导数分光光度法、同步荧光法）和高效液相色谱法进行表征和含量测定，让学生初步掌握天然产物的分离提取、鉴定及含量测定等实验技术，提高综合实验能力。

实验原理

高等植物体内的叶绿体色素有叶绿素和胡萝卜色素两类，主要包括叶绿素a（C55H72O5N4Mg）、叶绿素b（C55H70O6N4Mg）β-胡萝卜素（C40H50）和叶黄素（C40H52O2）等4种。叶绿素a和叶绿素b为吡咯衍生物与金属镁的络合物，β-胡萝卜素和叶黄素为四萜类化合物。根据它们的化学特性，可将它们从植物叶片中提取出来，并通过萃取、沉淀和色谱方法将它们分离出来。

叶绿素a和叶绿素b的分子结构相似，他们的吸收光谱、荧光激发光谱和发射光谱重叠，用常规分光光度法和荧光方法难以实现其同时测定。但是利用一阶导数光谱技术和同步荧光技术，清除了叶绿素a、叶绿素b的光谱干扰，可以同时测定它们的含量。

高效液相色谱是在高效分离的基础上对各个色素进行的测定的，对叶绿素和胡萝卜素等天然产物的分系和测定是一种非常有有效的手段。

仪器和试剂

仪器：DU-7HS型或其他类型具有导数功能的自动扫描式分光光度计，荧光分光光度计，TSP高压梯度HPLC仪（包括UV-2000型双光波长吸收检测器和PC1000型色谱工作站）。

试剂：叶绿素a、叶绿素b和β-胡萝卜素纯品为定购产品，甲醇和乙腈为液相色谱淋洗剂，其他试剂均为C.P.或A.R.级。

实验步骤

一、叶绿体色素的提取和色谱分离

1.叶绿体色素的提取

称取干净的新鲜绿叶蔬菜（如菠菜等）10 g，剪碎后放入研钵，假如0.5 g

碳酸镁，将菜叶粗捣烂后加入20 mL丙酮，迅速研磨5 mian。倒入不锈钢滤网器过滤，滤渣再研磨提取1次。合并滤液，转入预先放有20 mL石油醚的分液漏斗中，加入5 mL饱和NaCl溶液和45 mL蒸馏水，摇匀，使色素转入石油醚层。再用2×50 mL蒸馏水洗涤石油醚层2次。往石油醚色素提取液加入无水

Na2SO4除水，并进行适当浓缩，约得10 mL提取液。

2.纸色谱

采用新华1#色谱滤纸，展开剂用CCl4、石油醚-乙醚-甲醇体积比为30:1.0:0.5等。展开方式可以采用上升法、下降法或辐射法等。如为制备少量天然叶绿素a 和叶绿素b纯品，最好采用辐射法。用毛细管在直径为11 cml滤纸中心重复点样3～4次，斑点约为1 cm。吹干后，另在斑点中心加1～2滴展开剂，让样品斑形成一个均匀的样品环。沿着样品环中心穿一个直径约为3 mm的洞，做一条2 cm长的滤纸芯穿过。取直径为10 cm培养皿，其中一个倒入1/3的石油醚-乙醚-甲醇展开剂，放上层析滤纸，盖上另一培养皿，展开。纸色谱分离后，分别将各个色带剪下，用体积比为90:10的丙酮-水溶液溶出，以备配制色素标准液时使用。

3.硅胶薄层色谱

采用5 cm×20 cm硅胶板，105 ℃活化0.5 h。展开剂为石油醚（60～90 ℃）-丙酮-乙醚（体积比为3:1:1）。

4.氧化铝柱色谱

一直径为1.0 cm的加压色谱柱底部放入少量的玻璃丝，分别加入0.5 cm高的海砂、10 cm高的色谱中性氧化铝（250目）和0.5 cm高的海砂。加入25 mL 石油醚，用双联球打气加压浸湿氧化铝填料。整个洗脱过程应保持液面高于氧化铝填料。将2.0 mL植物色素提取液加到色谱柱顶部。流完后，再加少量石油醚洗涤，使色素全部进入氧化铝柱体。加入25 mL石油醚-丙酮（体积比为9:1）溶液，适当加压洗脱出第一个有色组分——橙黄色的β-胡萝卜素溶液。然后约用50 mL石油醚-丙酮体积比为7:3的溶液洗脱出第二个黄色带——叶黄素溶液和

第三个色带——叶绿素a（蓝绿色）。最后用石油醚-丙酮体积比为1:1的溶液洗脱叶绿素b（黄绿色）组分。收集各色带后，放入棕色瓶低温保存。

5.样品纯度的鉴定

色谱法分离得到的样品组分，可用吸光谱（400～700nm）和荧光光谱进行表征和鉴定。其纯度可通过薄层色谱和后面实验的3种测定技术进行测定。

二、叶绿素a和叶绿素b的同时测定

1.标准溶液系列的配制：应用多波长分光光度法确定用纯品试剂配置或用经分离提纯液配制的标准液的浓度。计算公式为：

叶绿素a：СCh1 a(μg.mL-1)=9.78 A662-0.99 A644

叶绿素b: СCh1 b(μg.mL-1)=21.43 A664-4.65 A662

式中：吸光度A的下标为测定波长。标准溶液系列均采用体积比为9:1的丙酮-水溶液配制，一般采用5种不同浓度的标准溶液绘制工作曲线。

2.样品试液的配置：样品可以是绿色植物叶片，一般取自市场购买的新鲜蔬菜。去0.5 g左右干净新鲜去脉菜叶，准确称量，剪碎，置于研钵中，加入0.5 g固体MgCO3和3 mL体积比为9:1的丙酮-水溶液，研磨至浆状。沥出离心分离。重新研磨提取直至残余的植物组织无色为止。上层溶液收集在50 ml的容量瓶中，以体积比为9:1丙酮-水溶液定容。每份样品应同时提取两份。

3.导数分光光度计法测定

（1）测绘叶绿素a、叶绿素b的吸收光谱（600～700nm）和一阶导数谱图，确定其导数测定波长，参比溶液为体积比为9:1的丙酮-水溶液。

（2）测绘Ch1a和Ch1b的工作曲线：对5种不同浓度的叶绿素a和叶绿素b系列标准溶液在确定的波长出进行一节导数光谱测定，用计算机求出各自工作曲线的拟合方程和相关系数。

（3）测定实际样品溶液的叶绿素a叶绿素b含量，换算出蔬菜叶片中他们的含量。

4.同步荧光法测定

（1）荧光激发和发射光谱的测绘

叶绿素a（160ng.mL-1）：采用428nm激发波长，在600～800 nm范围内扫描器荧光发射光谱；采用667nm发射波长，在350-～600 nm范围内扫描其荧光