关于常用分子生物学技术课件

核酸分子杂交 (nucleic acid hybridization ) 在DNA复性过程中，如果把不同DNA
单 链 分 子 放 在 同 一 溶 液 中 ， 或 把 DNA 与 RNA放在一起，只要在DNA或RNA的单 链分子之间有一定的碱基配对关系，就可 以在不同的分子之间形成杂化双链 (heteroduplex) 。
三、Western 印迹
将待检测蛋白质（或酶）经SDSPAGE电泳并染色后，转移到滤膜上固定， 再用“抗体-抗原”免疫反应或“DNAprotein”结合反应鉴别滤膜上的蛋白质。
三种 印迹比较
1. DNA印迹技术 (Southern blotting) 检测DNA
2. RNA印迹技术 (Northern blotting) 检测RNA
关于常用分子生物 学技术
第一节 分子杂交技术
具有互补序列两条单链核酸分子 在一定条件下 按碱基互补配对原则退 火形成双链的过程。杂交的双方是待 测核酸和已知核酸序列，已知核酸序 列称探针。
1、DNA变性的概念 在某些理化因素作用下，DNA双链
解开成两条单链的过程。
2、DNA变性的本质 双链间氢键的断裂！
3. 蛋白质的印迹分析 (Western blotting) 检测蛋白质
三 种 印 迹 技 术 的 比 较
四、原位杂交 (in situ hybridization)
1、定义： 将标记探针与细胞或组织中核酸按碱基配对原
则进行特异性杂交，并应用组织化学或免疫组织 化学方法在显微镜下进行细胞内定位或基因表达 的检测技术称原位杂交（hybridization in situ)。 2、操作步骤：
3’
子链延长
3’ 解旋酶解链酶
5’
PCR技术简史
• DNA的复制 • 核酸体外扩增的设想 • 聚合酶链反应的发明
1、基因芯片
基因芯片概念：基因芯片，也叫DNA芯片， 是将大量特定序列的DNA片段（分子探针）有序 地固定在经过处理后的尼龙膜、玻璃片、硅片等 支持物上 ，从而能快速、准确地对大量DNA分 子序列进行测定和分析的一种类似电脑的芯片。
原理：利用碱基的互补配对原则（DNA分子 杂交）
材料：分子探针，尼龙膜，玻璃片，硅片
载片的清洁与处理；组织与细胞的固定；探针； 湿盒
荧光原位杂交
五、生物芯片chip
生物芯片（biochip）是近年来在生命科学领域中迅速发 展起来的一项高新技术。
是将核酸、多肽或蛋白质分子、组织切片和细胞等制成探 针，以预先设计的方式有序地、高密度地排列在玻片或硅片等载 体上，构成二维分子阵列，然后与待测生物样品靶分子杂交，通 过检测杂交信号实现快速、高效和高通量样品检测。因该技术常 用玻片或硅片等材料作为固相支持物，且在制备过程中模拟计算 机芯片的制备技术，所以称之为生物芯片。其原理也是分子杂交 技术。
生物芯片技术的特点
微型化
高通量—提高信息量 平行化—提高信息的可比性 微量化—降低待检样品用量 自动化—提高工作效率 低成本—可迅速普及推广
生物芯片使用步骤
芯片制作
样品处理
把探针固定于载体表面 目标分子富集
分子间的杂交 结果检测与数据分析
生物芯片分类
（1）基因芯片 （2）蛋白质芯片 （3）细胞芯片 （4）组织芯片
制作基因芯片的大致步骤
基因芯片应用
可在基因组水平进行基因表达和发现研 究、突变、序列测定等，已方泛应用于基因 组研究和人类疾病的诊断等多领域。
应用基因微矩阵芯片研究宫颈 癌相关基因表达
DNA微点阵已广泛和流行的 用于疾病诊断、基因组比较、 以及新型癌症的分类。
2、蛋白质芯片
蛋白质芯片（protein chip）, 又称蛋白质微阵列， 是指以蛋白质或多肽作为配基，将其有序地固定在 固相载体的表面形成微阵列；用标记了荧光的蛋白 质或其它分子与之作用，洗去未结合的成分，经荧 光扫描等检测方式测定芯片上各点的荧光强度，来 分析蛋白质之间或蛋白质与其它分子之间的相互作 用关系。
4、组织芯片
组织芯片, 又称组织微阵列，是将不同生物体的组 织按预先设计或研究需要排列在固相载体上所形成 的组织微阵列。 组织芯片最大的优势在于可以对大量组织标本同时 进行检测，只需一次实验过程即可完成，缩短时间， 减少误差，提高了可比性。
第二节 目的基因制备技术
一、聚合酶链式反应（PCR）
概念 聚 合 酶 链 反 应 （ polymerase chain
reaction，PCR）是一种体外扩增特异DNA片 断的技术,能在短时间内获得数百万个特异 DNA序列的拷贝。
（一）PCR技术简史
• DNA的复制 • 核酸体外扩增的设想 • 聚合酶链反应的发明
DNA 解旋解链
5’
ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC 合成引物 TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG
限制性酶切割
限制片段
DNA分子
琼脂糖电泳
带有DNA片段的凝胶
用缓冲液转移 DNA
至膜（尼龙膜或硝酸 纤维素滤膜）上凝胶滤膜转膜吸附有DNA 片段的膜
杂交、显影
Southern 印迹杂交的技术流程
从凝胶上转移DNA
二、Northern 印迹
应用DNA探针检测特异 mRNA的一种杂交技术，主 要用于分析mRNA的转录或 mRNA分子大小。其方法类 似于Southern印迹杂交。
• 蛋白质芯片技术在医学中的应用 – 特异性抗原抗体的检测 – 生化反应的检测 – 疾病诊断 – 对疾病分子机制的研究 – 药物筛选及新药的研制开发
3、细胞芯片
又称细胞微阵列，是以活细胞为研究对象的一种生 物芯片，在芯片上完成对细胞的捕获、固定、平衡、 运输、刺激及培养的精确控制，并通过微型化的化 学分析方法，实现对细胞样品的高通量、多参数、 连续原位信号检测和细胞组分的理化分析等。
变性
复性
DNA-DNA 杂交双链分子
核酸分子杂交
探针技术
探针 (probe) 一小段用同位素、生物素或荧光染料
标标记其末端或全链的已知序列的多聚 核苷酸，与固定在NC膜上的核苷酸结合， 判断是否有同源的核酸分子存在。
一、Southern印迹
此技术由Southern 1975年首先设 计。被检测对象为DNA。