第四节 细菌病的实验室诊断方法

第一篇微生物的基本知识第一章细菌第四节细菌病的实验室诊断方法细菌是自然界广泛存在的一种微生物，细菌性传染病占动物传染病的50%左右，细菌病的发生给畜牧业带来了极大的经济损失。

因此在动物生产过程中，必须做好细菌病的防治工作。

对于发病的群体，及时而准确地做出诊断是十分重要的。

畜禽细菌性传染病，除少数如破伤风等可根据流行病学、临床症状作出诊断外，多数还需要借助病理变化初步诊断，确诊则需在临床诊断的基础上进行实验室诊断，确定细菌的存在或检出特异性抗体。

细菌病的实验室诊断需要在正确采集病料的基础上进行，常用的诊断方法有：细菌的形态检查、细菌的分离培养、细菌的生化试验、细菌的血清学试验、动物接种试验、分子生物学的方法等。

一、病料的采集、保存及运送（一）病料的采集1．采集病料的原则（1）无菌采病料原则病料的采集要求进行无菌操作，所用器械、容器及其他物品均需事先灭菌。

同时在采集病料时也要防止病原菌污染环境及造成人的感染。

因此在尸体剖检前，首先将尸体在适当消毒液中浸泡消毒，打开胸腹腔后，应先取病料以备细菌学检验，然后再进行病理学检查。

最后将剖检的尸体焚烧，或浸入消毒液中过夜，次日取出作深埋处理。

剖检场地应选择易于消毒的地面或台面，如水泥地面等，剖检后操作者、用具及场地都要进行消毒或灭菌处理。

（2）适时采病料原则病料一般采集于濒死或刚刚死亡的动物，若是死亡的动物，则应在动物死亡后立即采集，夏天不宜迟于6～8h，冬天不迟于24h。

取得病料后，应立即送检。

如不能立刻进行检验，应立即存放于冰箱中。

若需要采血清测抗体，最好采发病初期和恢复期两个时期的血清。

（3）病料含病原多的原则病料必须采自含病原菌最多的病变组织或脏器。

（4）采病料适量的原则采集的病料不宜过少，以免在送检过程中细菌因干燥而死亡。

病料的量至少是检测量的四倍。

2．采集病料的方法（1）液体材料的采集方法破溃的脓汁、胸腹水一般用灭菌的棉棒或吸管吸取放入无菌试管内，塞好胶塞送检。

血液可无菌操作从静脉或心脏采血，然后加抗凝剂（每1ml血液加3.8%枸橼酸钠0.1ml）。

若需分离血清，则采血后（一定不要加抗凝剂），放在灭菌的试管中，摆成斜面，待血液凝固析出血清后，再将血清吸出，置于另一灭菌试管中送检。

方便时可直接无菌操作取液体涂片或接种适宜的培养基。

（2）实质脏器的采集方法应在解剖尸体后立即采集。

若剖检过程中被检器官被污染或剖开胸腹后时间过久，应先用烧红的铁片烧烙表面，或用酒精火焰灭菌后，在烧烙的深部取一块实质脏器，放在灭菌试管或平皿内。

如剖检现场有细菌分离培养条件，直接以烧红的铁片烧烙脏器表面，然后用灭菌的接种环自烧烙的部位插入组织中，缓缓转动接种环，取少量组织或液体接种到适宜的培养基。

（3）肠道及其内容物的采集方法肠道只需选择病变最明显的部分，将其中内容物去掉，用灭菌水轻轻冲洗后放在平皿内。

粪便应采取新鲜的带有脓、血、黏液的部分，液态粪应采集絮状物。

有时可将胃肠两端扎好剪下，保存送检。

（4）皮肤及羽毛的采集方法皮肤要取病变明显且带有一部分正常皮肤的部位。

被毛或羽毛要取病变明显部位，并带毛根，放入平皿内。

（5）胎儿可将流产胎儿及胎盘、羊水等送往实验室，也可用吸管或注射器吸取胎儿胃内容物放入试管送检。

（二）病料的保存与运送供细菌检验的病料，若能1～2d内送到实验室，可放在有冰的保温瓶或4～10℃冰箱内，也可放入灭菌液体石蜡或30%甘油盐水缓冲保存液中（甘油300ml，氯化钠4.2g，磷酸氢二钾3.1g，磷酸二氢钾1.0g，0.02%酚红1.5ml，蒸馏水加至1000ml，pH7.6）。

供细菌学检验的病料，最好及时由专人送检，并带好说明，内容包括：送检单位、地址、动物品种、性别、日龄、送检的病料种类和数量、检验目的、保存方法、死亡日期、送检日期、送检者姓名、并附临床病例摘要（发病时间、死亡情况、临床表现、免疫和用药情况等）。

二、细菌的形态检查细菌的形态检查是细菌检验技术的重要手段之一。

在细菌病的实验室诊断中，形态检查的应用有两个时机，一是将病料涂片染色镜检，它有助于对细菌的初步认识，也是决定是否进行细菌分离培养的重要依据，有时通过这一环节即可得到确切诊断。

如禽霍乱和炭疽的诊断有时可通过病料组织触片、染色、镜检即可确诊（图1-36、1-37）。

另一个时机是在细菌的分离培养之后，将细菌培养物涂片染色，观察细菌的形态、排列及染色特性（图1-38、1-39），这是鉴定分离菌的基本方法之一，也是进一步生化鉴定、血清学鉴定的前提。

常用的染色方法本章第一节已讲述，包括单染色法和复染色法，应用时可根据实际情况选择适当的染色方法，如对病料中的细菌进行检查，常选择单染色法，如美蓝染色法或瑞氏染色法，而对培养物中的细菌进行染色检查时，多采用可以鉴别细菌的复染色法。

当然，染色方法的选择并非固定不变。

形态检查的具体操作详见实训三、四。

三、细菌的分离培养（视频四）细菌的分离培养及移植是细菌学检验中最重要的环节，细菌病的诊断与防治以及对未知菌的研究，常需要进行细菌的分离培养。

细菌病的临床病料或培养物中常有多种细菌混杂，其中有致病菌，也有非致病菌，从采集的病料中分离出目的病原菌是细菌病诊断的重要依据，也是对病原菌进一步鉴定的前提。

不同的细菌在一定培养基中有其特定的生长现象，如在液体培养基中的均匀浑浊、沉淀、菌环或菌膜，在固体培养基上形成的菌落和菌苔等。

细菌菌落的形状、大小、色泽、气味、透明度、黏稠度、边缘结构和有无溶血现象等，均因细菌的种类不同而异，根据菌落的这些特征，即可初步确定细菌的种类。

将分离到的病原菌进一步纯化，可为进一步的生化试验鉴定和血清学试验鉴定提供纯的细菌。

此外，细菌分离培养技术也可用于细菌的计数、扩增和动力观察等。

细菌分离培养的方法很多，最常用的是平板划线接种法，另外还有倾注平板培养法、斜面接种法、穿刺接种法、液体培养基接种法等，内容详见实训六。

四、细菌的生化试验细菌在代谢过程中，要进行多种生物化学反应，这些反应几乎都靠各种酶系统来催化，由于不同的细菌含有不同的酶，因而对营养物质的利用和分解能力不一致，代谢产物也不尽相同，据此设计的用于鉴定细菌的试验，称为细菌的生化试验。

一般只有纯培养的细菌才能进行生化试验鉴定。

生化试验在细菌鉴定中极为重要，方法也很多，下面介绍几种常用的生化试验的原理，具体操作见实训七，部分生化试验的结果见图1-40、1-41、1-42。

1．糖分解试验不同细菌对糖的利用情况不同，代谢产物不尽相同，有的不分解，有的分解只产酸，有的分解既产酸又产气。

而且这种分解能力因是否有氧的存在而异，在有氧的条件下称为氧化，无氧条件下称为发酵。

试验时往往将同一种细菌接种相同的糖培养基一式两管，一管用液体石蜡等封口，进行“发酵”，另一管置有氧条件，培养后观察产酸产气情况。

（图1-43、1-44）目前，“糖发酵”一词泛指有氧及厌氧条件下细菌对糖的分解反应，如不加特别说明，均是有氧条件。

2．维-培试验又称V-P试验，由Voges和Proskauer两学者创建，故名。

大肠杆菌和产气肠杆菌均能发酵葡萄糖，产酸产气，两者不能区别。

但产气肠杆菌能使丙酮酸脱羧，生成中性的乙酰甲基甲醇，后者在碱性溶液中被空气中的分子氧所氧化，生成二乙酰，二乙酰与培养基中含胍基的化合物反应，生成红色的化合物，即为V-P试验阳性。

（图1-45）大肠杆菌不能生成乙酰甲基甲醇，故为阴性。

3．甲基红试验又称MR试验，在V-P试验中，产气肠杆菌分解葡萄糖，产生的2分子的丙酮酸转变为1分子中性的乙酰甲基甲醇，故最终的酸类较少，培养液pH＞5.4,以甲基红(MR)作指示剂时,溶液呈橘黄色,为阴性；大肠杆菌分解葡萄糖时，丙酮酸不转变为乙酰甲基甲醇，故培养基的酸性较强，pH≤4.5，甲基红指示剂呈红色，为阳性。

（图1-46）4．枸橼酸盐利用试验某些细菌能利用枸橼酸盐作为唯一的碳源，能在除枸橼酸盐外不含其他碳源的培养基上生长，分解枸橼酸盐生成碳酸盐，并分解其中的铵盐生成氨，使培养基由酸性变成为碱性，从而使培养基中的指示剂溴麝香草酚蓝由草绿色变为深蓝色为阳性；不能利用枸橼酸盐作为唯一碳源的细菌在该培养基上不能生长，培养基颜色不改变，为阴性。

（图1-47）5．吲哚试验又称靛基质试验，有些细菌能分解蛋白胨水培养基中的色氨酸产生吲哚，如在培养基中加入对二甲基氨基苯甲醛，则与吲哚结合生成红色的玫瑰吲哚，为吲哚试验阳性，否则为阴性。

（图1-48）6．硫化氢试验某些细菌能分解培养基中的胱氨酸、甲硫氨酸等含硫氨基酸，产生硫化氢，与加到培养基中的醋酸铅或硫酸亚铁等反应，生成黑色的硫化铅或硫化亚铁，使培养基变黑色，为硫化氢试验阳性。

（图1-49）7．触酶试验触酶又称接触酶或过氧化氢酶，能使过氧化氢快速分解成水和氧气。

有的细菌能产生此酶，在细菌培养物上滴加过氧化氢水溶液，见到大量的气泡产生为阳性。

（图1-50）8．氧化酶试验氧化酶又称细胞色素酶、细胞色素氧化酶C或呼吸酶。

该试验用于检测细菌是否含有该酶。

原理是氧化酶在有分子氧或细胞色素C存在时，可氧化四甲基对苯二胺，出现紫色反应。

9．脲酶试验脲酶又称尿素酶。

细菌如有脲酶，能分解尿素产生氨，使培养基的碱性增加，使含酚红指示剂的培养基由粉红色转为紫红色，为阳性。

（图1-51）细菌生化试验的主要用途是鉴别细菌，对革兰氏染色反应、菌体形态以及菌落特征相同或相似的细菌的鉴别具有重要意义。

其中吲哚试验（indole test）、甲基红试验（methl red test）、V-P试验、枸橼酸盐利用试验（citrate utilization test）四种试验常用于鉴定肠道杆菌，合称为IMViC试验。

例如大肠杆菌对这四种试验的结果是+ + - -，而产气杆菌则为- - + +。

五、动物接种试验实验动物有“活试剂”或“活天平”之誉，是生物学研究的重要基础和条件之一。

动物试验也是微生物学检验中常用的技术，有时为了证实所分离菌是否有致病性，可进行动物接种试验，最常用的是本动物接种和实验动物接种，内容详见实训十二。

六、细菌的血清学试验血清学试验具有特异性强、检出率高、方法简易快速的特点，因此广泛应用于细菌病的诊断和细菌的鉴定。

常用的血清学试验有凝集试验、沉淀试验、补体结合试验、免疫标记技术等。

如我们生产中常用凝集试验来进行鸡白痢和布氏杆菌病的检疫。

血清学试验的详细内容及操作见第十一章和实训十三～十七。

在细菌病的实验室诊断或细菌的鉴定中，除应用上述介绍的方法外，迅速兴起和发展起来的分子生物学技术也在广泛应用。

如：传统的猪链球菌检测方法为细菌分离法，至少需要3d时间。

如果采用先进的PCR新技术，可将检测猪链球菌的时间缩短至1.5h 左右。