血红蛋白电泳及其临床应用

血红蛋白电泳及其临床应用

鄢盛恺

中国医学科学院中国协和医科大学北京协和医院检验科，北京100730

早在60多年前Pauling等（1949）在研究镰状红细胞贫血患者的血红蛋白（hemoglobin，Hb）时就发现其与正常人不同，证实这种异常的Hb在缺氧条件下是产生红细胞镰变和溶血性贫血的原因，并提出了“分子病”这一新概念。引起了人们对Hb结构异常及异常Hb与遗传性贫血之间关系的重视。近年来，由于生化技术和分子生物学技术的不断发展，相继发现和鉴定了许多新型异常的Hb。电泳技术作为分离与鉴定Hb最简便、准确的方法之一，广泛用于临床遗传性贫血（如地中海贫血）、异常血红蛋白病等疾病的临床诊治。

1 概述

Hb的主要生理功能是将氧气从肺部运送到组织，同时将组织释放的二氧化碳带回到肺部完成氧气和二氧化碳的交换。Hb是由珠蛋白和亚铁血红素连接成的一种结合蛋白质。每一个Hb是由4个多肽链组成，而每一肽链又和一个铁卟啉结合。和血红素连接的珠蛋白是一种组蛋白，每一个珠蛋白分子由4条肽链组成，每一条肽链和一个血红素结合，构成一个Hb单体或称为亚单位。因此，每个Hb分子是由4个Hb单体聚合而成的四聚体。

现在已知人类的红细胞中存在3种正常的Hb，即HbA、HbA2和HbF。从正常Hb中已发现α、β链、γ和δ4种不同肽链。这些Hb由均由一对α链和一对非α链组成。正常成人Hb的非α链称为β链，而胎儿Hb中的非α链称为γ链。HbA含量最多，它由两条α链和两条β链组成；HbA2（占3%）由两条α链和两条δ链组成。HbF正常含量是Hb的2%，由两条α链和两条γ链组成。

除HbA、HbA2和HbF外其他的各种Hb常被称为异常Hb。全世界目前已报道的异常Hb达450余种，而且每年还有新的发现。如美国最常见的两种Hb变异体是HbS和HbC，而Hb Lepore，HbE，HbA2 G-philadelphia等几类很少见。现已证实这些异常Hb的不同之处不在于亚铁血红素部分，而在于珠蛋白部分化学结构的差异。主要类型有：⑴肽链中氨基酸的顺序略有差异。此类型最为多见，约占90%。如HbS（HbA→HbS是由于α2β2→α2β2S），HbC（HbA→HbC是由于α2β2→α2β2C）；⑵各肽链的重新组合或某些正常肽链的缺失。如HbH（HbA→HbH是由于α2β2→β4），Hb Bart’s（HbA→Hb Bart’s 是由于α2γ2→γ4）；⑶Hb肽链的融合。如Hb Lepore是δ链的一半（N端）与β链的一端（C端）融合而成；⑷肽链中氨基酸增多，可在中间嵌入或在C端延长。等。以前发现的Hb皆以英文字母命名，由A~Q（B除外，加上S）。随着新发现的Hb越来越多，字母不够用，现规定从Q以后的字母不能再用以命名，而以发现地或实验室命名。

临床实验室常用的分离和鉴定Hb的方法有醋酸纤维素薄膜电泳、琼脂糖凝胶电泳、柱层析和一些有关的化学试验。地中海贫血是一种常染色体显性遗传病，是我国南方最常见和危害最大的遗传病之一。应用电泳法鉴别患者血液中Hb的类型及含量对于贫血类型的临床诊断及治疗具有重大意义。全自动电泳分析系统的引进将为临床诊断地中海贫血及异常Hb病提供准确的实验室方法和依据。近年来分子生物学技术已用于因异常Hb引起的遗传性疾病的基因诊断中。

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2 Hb电泳

2.1 原理Hb的分离和鉴定方法很多，其中以电泳法最为常用且最为重要，很多异常Hb都是首先用电泳法发现的。其原理是Hb中的珠蛋白和其他蛋白质一样为两性电解质，在不同的缓冲液中可带正或负电荷，在电场中向阴极或阳极移动。由于不同的蛋白质之间（正

常Hb与异常Hb）其等电点、分子大小、形状及所带电荷的不同，其移动速率不同（电泳迁移率不同），在一定的支持介质中可借以分离。不同的电泳方法具有不同的电场强度、pH、缓冲液或支持物。

2.2 常用方法最常用的方法是碱性缓冲液电泳。早期用醋纤膜作为支持介质，在碱性环境下（pH8.4~8.6）可快速分离HbA、HbA2和HbF及其他多种变异体。可是不能将HbS 与HbD和HbG分开，因为后3种Hb 在这一电泳系统中具有相同的迁移率。同样，在碱性条件下，HbC、HbE、HbO与HbA2也有相同的迁移率。1976年美国疾病预防与控制中心（CDC）和美国临床实验室标准化委员会（NCCLS）曾推荐用醋酸纤维素薄膜电泳（Helena 实验室的方法与之基本相同）作为异常Hb检测的初级试验。现多用分辨率更高的琼脂糖凝胶进行电泳分析。而酸性缓冲液（pH6.0~6.2）电泳可用来分离那些在碱性缓冲液电泳中不能分离开的Hb，如HbS及HbC。在此酸性条件下，HbD、HbO（或HbE）与HbS及HbC 可明显的分开。电泳后Hb可用丽春红S、酸蓝或氨基黑10B进行染色，将电泳区带与已知的对照比较，并用光密度计进行扫描定量。对于一些特殊的Hb如HbS、HbA2、HbF和不稳定Hb（如HbM、HbH、HbE等）可分别采用溶解度试验、柱层析法、碱变性法（Singer 法）及不稳定试验（异丙醇试验）进行鉴定。珠蛋白链电泳、等电聚焦和氨基酸序列分析可用来证实稀有的Hb存在，多用于研究。目前已有多种自动化电泳分析仪可应用于临床常规Hb电泳，如Helena 公司的REP、SPIEF等型号，Sieba公司的HYDRASYS。其中碱性缓冲液电泳为常用筛选方法。

2.3 电泳结果

2.3.1 碱性缓冲液电泳在碱性缓冲液中所有Hb均向阳极移动，其移动顺序为：HbH>HbA3> HbA1>HbF>HbS/HbD/HbG>HbC，HbA2/HbC/HbE/HbO>CA1>CA2（CA1为碳酸酐酶1，CA2碳酸酐酶2）。正常人可见4条区带：HbA>HbA2>CA1>CA2（若用联苯胺染色，CA1与CA2则不显色）。在点样处有一条蛋白带，它是非Hb成分，为细胞基质和膜蛋白。

2.3.2 酸性缓冲液电泳在酸性缓冲液中，HbA、HbD、HbE和HbG向阴极移动，而HbF 比它们更靠近阴极。HbC向阳极移动得最快，HbS也向阳极移动，但比较接近点样点。2..3.3 结果报告有两种报告方式：⑴定性：将染色后的电泳胶片用质控胶片对比即可判断胶片有无Hb。⑵定量：染色后的电泳胶片用光密度计扫描，报告各条带的百分比值。各区带参考值，根据不同年龄有不同的范围。例：

正常成人：Hb（A+F）94.5%~98.5%

HbA2 2.5%~3.5%

新生儿(1个月)：HbA 12%~40%

HbF 6%~93%

HbA2 0.1%~1.0%

婴儿（3个月）：HbA 1.00%—65.00%

HbF34.3%—82.95%

HbA2 0.04—2%

婴儿(6个月)：HbA 86%~98%

HbF 0.84%~10.7%

HbA2 0.87%~2.9%

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3 临床意义

足月的初生婴儿血液中的约70%~80%的Hb为HbF，同时也存在少量的HbA和HbA2。