低密度脂蛋白胆固醇测定方法进展(精)

低密度脂蛋白胆固醇测定方法进展摘要血清或血浆中低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）与冠心病（CDH）发生和动脉粥样硬化损伤呈正相关，而且是美国国家胆固醇教育计划（NCEP）作为脂类疾病分类和风险预测的一个重要指标。

LDL-C也是选择药物治疗和预后方面的一个十分有意义的临床指标，国内外都在研究和开发行之有效、可靠的标准化测定方法。

本文对其有关的测定方法和研究进展作综述。

关键词：低密度脂蛋白胆固醇；方法学；心血管疾病临床和流行病学研究证明血清中LDL-C与冠状动脉粥样硬化有密切的正相关[1]。

在1986年病理学家们就研究证明LDL-C浓度越高时动脉粥样硬化损伤的程度越大，粥样硬化程度小时，测到血清中LDL-C也低[2,3]。

lDL是一组不均一的脂蛋白颗粒，一般认为LDL的漂浮密度为1.006～1.063，且包括了中间密度脂蛋白（LDL）1.006～1.019及Lp(a)1.050～1.080。

LDL中蛋白含量约为20％～25％，主要是载脂蛋白B-100（ApoB-100），而载脂蛋白E（ApoE）和载脂蛋白CⅡ（ApoCⅡ）含量很少。

胆固醇的含量约是血清中总量的三分之二。

LDL是通过受体途径进行降解，如过量时可以导致巨噬细胞和其他吞噬细胞变成泡沫细胞，这被认为是与动脉粥样硬化有关的因素。

因此，LDL-C的测定结果直接影响到分类和治疗。

美国的NCEP专家组以LDL-C浓度将成人、小孩、青少年各分为：成人在3.37mmol/L(1300mg/L)以下为合适水平，在3.37～4.12mmol/L(1300～1590mg/L)间作为中危水平，高于4.14mmol/L(1600mg/L)时作为高危水平；小孩和青少年在2.85mmol/L(1100mg/L)以下为合适水平，在2.85～3.34 mmol/L(1100～1290mg/L)为中危水平，高于 3.37mmol/L(1300mg/L)为高危水平[4]。

为提高LDL-C测检水平，国内外对LDL-C测定方法进行广泛的研究并不断改善，现将有关方法研究进展综述如下： 1 等密度和密度梯度超速离心法血清中的各种脂蛋白的分离是LDL-C测定的一个重要环节。

由于各种脂蛋白的大小、密度和组成及功能都有很大的不同。

超速离心技术就是利用脂蛋白各种成分的密度不同将它们分离，是脂蛋白分离的主要方法。

1950年Delalla和Gofman首次报道等密度超速离心法。

在实验室中一般采用βQuantification（βQ）法，它利用1.006的临界分离液，在离心力为10900g时离心18h，将血浆分成上下两部分，上清液为VLDL和乳糜颗粒，下面为IDL、LDL和HDL。

用试管切开技术将上下液体分开。

下面部分再采用化学沉淀法将HDL和LDL及IDL分开，分别用酶法测定胆固醇。

这方法已被临床实验室作为参考方法。

而且还可以根据需要改变分离液密度，当密度提高为1.019，可以将IDL与LDL和HDL分开，也可提高到1.21，分离出HDL等。

但在选择脂蛋白分离切点系指它们与缓冲液混和物的密度，而不是脂蛋白自身的密度。

另外有报道用密度梯度超速离心法[5]。

这种方法是将血清加入到已有不同密度梯度的分离液中，进行超速离心后，血清中脂蛋白的各种成份可以转移到各自相等密度的相等的区域。

这种方法可以一次将脂蛋白中的各种成份分离。

而不足之处是要求离心时间很严格，分开各种组份较困难。

根据离心转子的不同，可以分为水平转子，垂直转子以及固定角度转子。

水平转子在实验中已被证明分离效果最好，但要求离心时间长（17～66h）；垂直转子可以缩短时间（45min～3h），由于转动距离小，会有微量丢失；在等密度超速离心中首选固定角度转子，如在密度梯度超速离心中使用时，离心时间要比垂直转子稍长。

这两种方法对实验室要求条件高，一般实验室都难以应用。

虽然现在有很多改良方法，克服了传统方法的部分缺点，但分离的效果仍不能同传统方法比。

所有的超速离心法都有它们的局限性，它们所测得的结果仍是NCEP作为分类和治疗的指标。

2谱法根据脂蛋白分子的大小和亲和性有很大的不同，利用层析技术对脂蛋白进行分离。

目前有多种色谱仪和分离柱被用于脂蛋白的分离。

而琼脂糖层析技术和Toya soda的高压凝胶层析技术使用最普遍。

这种方法是非破坏性，可以回收各种成份，有报道[6]LDL-C的回收率可以达到80％～98％，但稳定性较差。

目前这种技术也在不断完善，但要求实验条件高，操作繁琐，时间长，仪器昂贵，难以在临床实验室应用。

3电泳电泳技术是基于脂蛋白分子所带的电荷和分子量大小不同进行分离，早期这种技术在临床实验室普遍用于定性分析，直接观察血清脂蛋白谱。

现在已不再推广使用，大量实验证明电泳电量法所得的结果不能令人满意，并且发现与常规实验测得的结果有误差。

有报道[7]肝硬化胆道阻塞病人的血清脂蛋白谱显示正常，而血清胆固醇浓度追忆忼于25.9mmol/L(10g/L)。

因此还应进行总胆固醇（TC）测定。

因为亲脂性染料不能和游离胆固醇以及磷脂结合。

另外，可以与超速离心法和化学沉淀法联合使用，经分离后，进行某一组份纯度分析。

免疫与电泳技术结合，可以大大提高准确度；以及全自动电泳分析仪出现，在常规实验室进行脂蛋白定量分析将成为可能。

4 化学沉淀法 4.1 肝素沉淀法肝素在pH值5.12柠檬酸缓冲液中可以沉淀LDL，使LDL与其它脂蛋白分离，然后进行胆固醇测定。

这种方法pH值很重要。

pH值必须使LDL颗粒的脂蛋白所带电荷刚为正值。

由于VLDL和LDL等电点分别为4.7和5.4，pH值5.12±0.02时LDL刚好可以完全沉淀，而VLDL不沉淀。

肝素沉淀法与定量电泳法有很好的一致性，但当TG含量大于4.58mmol/L(4000mg/L)时，一致性相对降低。

在Ⅲ型血浆脂蛋白增高症的病人血清中加沉淀剂时VLDL和Lp(a)与LDL发生共同沉淀，导致结果出现偏差。

这种方法在TG低时，它有很好的精密度，变异系数小于3.5％。

与等密度超速离心法比较，当TG浓度大于2.0mmol/L(1750mg/L)时，肝素法出现结果偏离[4]。

近年Armstrong等[8]实验证明降低pH值到4.85时Lp(a)沉淀。

4.2 聚乙烯硫酸（PVS）沉淀法含有EDTA的PVS可将血清中LDL沉淀。

PVS沉淀LDL是非离子相互作用，pH值影响较小，pH值在3～8范围内均可以沉淀。

因此，并不需要精确的pH值。

沉淀剂中EDTA与血清中二价离子结合，阻止VLDL共同沉淀，而聚乙二醇独甲醚（PEGME）加速LDL形成小球，可缩短沉淀时间。

Assmann等[9]实验证明PVS 法可以将LDL同HDL、VLDL和LpX分离，但Lp(a)则完全同LDL共同沉淀，实际结果应包括Lp(a)所含的胆固醇。

当血清中TG浓度小于4.2mmol/L（3680mg/L）时，与超速离心法有很好的一致性，但当TG大于4.6mmol/L(4070mg/L)时，PVS法所得结果偏低，且随TG浓度的升高误差也随着增大。

当血清TG低时，PVS法与其它所有方法都有很好的一致性，且有好的精确度，变异系数小于3.0％。

4.3 多环表面活化法本法采用pH值6.10的异吡唑缓冲液中非特异两歧性聚合物使LDL沉淀，然后将沉淀物重新溶解直接测定LDL-C或有TC与上清液胆固醇之差计算出。

Moss等报道[10]此法与超速离心法和电泳法有很了的一致性，但与其他化学沉淀法一样受血清中的TG浓度影响。

5 Friedewald公式计算法1972年Friedewald和Levy等首次提出用公式计算：LDL－C＝TC－(HDL－C＋VLDL－C），而VLDL－C＝TG×0.45(mmol/L)或VLDL－C＝TG×0.20(mg/L)。

此公式是基于TG和比率恒定的情况与其它方法有很好的相关性，并要求空腹血清。

如Ⅲ型血浆脂蛋白增高症的病人血清VLDL－C/TG变化很大，且TC、TG、HDL－C测定结果的准确性直接影响到LDL－C结果。

如血活中TG升高时，LDL－C结果偏低，Ⅲ型血浆脂蛋白增高症病人的LVDL－C/TG的比率高达到0.947(mmol/L)[11,12]。

因此此公式在临床上的运用要求血清TG的浓度小于4.52mmol/L(4000mg/L)，否则会提供错误结果，会对分类和治疗作出误导。

6 免疫结合分离法这种方法根据血清脂蛋白中所含有载脂蛋白的种类和数量的差异，制备有关载脂蛋白的抗体，通过免疫结合，达到相应物质的沉淀，得到所需的结果。

由于LDL含绝大部分ApoB-100，达到98％；而ApoA-I和apoE却很微量。

1993年Leary 等[13]提出采用羊的多克隆抗Apo-A1和ApoE血清与乳胶颗粒结合，形成致敏剂，然后与脂蛋白的VLDL、HDL、IDL、乳糜颗粒等结合沉淀，分离出LDL并用酶法测定胆固醇。

与βQ法作比较，空腹和非空腹血都有很好的一致性，相关系数分别为0.96和0.98，日内变异系数小于3％，日间变异系数小于4％，后来Castellani等[14]采用Sigma提供的试剂进行实验，结果TG高于4.29mmol/L(3800mg/L)和HDL-C2.55mmol/L(990mg/L)时不影响LDL-C结果。

而McNamara等[15]则认为上清液放在-80℃冰冻时间越长，结果变化越大，如放置26周后，结果改变达-13.66±5.35%。

而Pisani等[16]采用200μl试剂加入30μl血清或血浆旋转混匀，在室温放置5～10min，离心分离上清液作LDL-C测定。

且用本方法和βQ法分别对177份血清进行测定，两方法的相关系数为0.980；分别对29份甘油三酯高于4.52mmol/L(4000mg/L)的血清进行测定。

相关系数为0.927。

本方法有很好精密度，日内和日间变异系数均小于3%。

这种方法不要求用空腹血清，而且对高乳糜微粒血症、高TG血症和Ⅲ型血浆脂蛋白增高症病人血清一样可以精确测定。

这种方法被美国NCEP专家们推荐为常规实验室测定的方法。

由上可知，目前测定LDL-C的各种方法仍存在各自的优缺点，密度梯度超速离心法仍是目前认定的参考方法，国外也有把等密度超速离心法和化学沉淀法相互结合的βQ法作为金标准。

化学沉淀法设备简单。

较易开展，但它们共同的一个特点，结果的准确度与TG的水平有关，而且分离不够完全。

Friedewald公式计算法，要求空腹血清，且血清的TG、乳糜微粒浓度低时结果才能可靠。

近年还有报道[17]此公式还受其它疾病的影响，化学沉淀法和Friedewald法得到LDL-CA结果，还包括Lp(a)-C的浓度，近年有报道[18]LDL-C和Lp(a)是反映血管疾病的两个独立因素，并提出应分别测定，让LDL-C和Lp(a)各自更好提供冠心病以及动脉粥样硬化的临床意义。