07第七讲 色谱技术 [Chapter 7 Chromatography]
色谱技术简介
色谱技术简介发布者：杭州科晓化工仪器设备有限公司发布时间：2007年1月30日Audo look6.0下载引言色谱法是1906年俄国植物学家Michael Tswett将含有有色的植物叶子色素和溶液通过装填有白垩粒子吸附剂的柱子，企图分离它们时而发现并命名的。
各种色素以不同的速率通过柱子，从而彼此分开。
分离开的色素形成不同的色带而易于区分，由此得名为色谱法（Chromatography），又称层析法。
其后的一个重大进展是1941年Martin 和Synge 发现了液－液（分配）色谱法[Liquid-Lipuid（partition）Chromatography，简称LIC]。
他们用覆盖于吸附剂表面的并与流动相不混溶的固定液来代替以前仅有的固体吸附剂。
试样组分按照其溶解在两相之间分配。
Martin 和Synge因为这一工作而荣获1952 年诺贝尔化学奖。
在使用柱色谱的早期年代，可靠地鉴定小量的被分离物质是困难的，所以研究发展了纸色谱法（Paper Chromatography，简称PC）。
在这种“平面的”技术中，分离主要是通过滤纸上的分配来实现的。
然后由于充分考虑了平面色谱法的优点而发展了薄层色谱法（Thin-Layer Chromatography，简称TLC），在这种方法中，分离系在涂布于玻璃板或某些坚硬材料上的薄层吸附剂上进行。
在Stah－l于1958年进行了经典性的工作将技术和所用材料加以标准化之后，薄层色谱法方赢得了声誉。
为了帮助提高纸色谱法或薄层色谱法对离子化合物的分离效率，可以向纸或板施加电场。
这种改进了方法分别称作纸上电泳或薄层电泳。
新近发展起来的色谱法气相色谱法是Martin和James于1952 年首先描述的，现已成为所有色谱法中最高级和最广泛使用的一种方法，它特别适用于气体混合物或挥发性液体和固体，即便对于很复杂的混合物，其分离时间也仅为几分钟左右，这已属司空见惯。
高分辩率、分析迅速和检测灵敏等几种优点之综合使气相色谱法成了几乎每个化学实验室要采用的一种常规方法。
色谱分析技术 ppt课件
PPT课件
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填充柱色谱法 GC 毛细管柱色谱法
色谱法
高效液相色谱法 柱色谱 经典液相色谱法
LC 薄层色谱法
平面色谱法 纸色谱
吸附柱色谱 分配柱色谱 离子交换色谱 凝胶色谱
CE 毛细管电泳色谱法
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三、色谱过程
2、点样
（1）样品溶液的制备： 怎样选择溶剂？ 水可以用吗？
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2、点样
（2）点样量： 与薄层板的关系 太多太少的影响
点样基线：距底边2.0cm 样点直径：2-4mm 点间距离：1.5-2.0cm
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2、点样
（3）点样方法： 划线、样品记号点、点样
注：动作要轻， 毛细管或点样器不能混用， 斑点大小适当，可多次点样。
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（二）杂质检查（杂质限量检查）
2、自身稀释对比法（杂质结构不明或无杂质对照品）
样品溶液稀释制成一定浓度的溶液 样品制成一定浓度溶液
按相同的点样量点样
展开后观察斑点颜色深浅和大小
如地西泮中有关物质的检查： 取本品的细粉适量（约相当于地西泮200mg），加丙酮5ml,振
摇，使地西泮溶解，滤过，取滤液作为供试品溶液；精密量取适量， 加丙酮稀释成每1ml中含地西泮0.20mg的溶液，作为对照溶液。点 样展开后，供试品溶液如显杂质斑点，与对照溶液的主斑点比较， 不得更深。
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四、结果计算和判断 （一）定性鉴别
判断依据：Rf值、Rs值 1、查找资料：影响Rf值的因素
吸附剂种类、活度、颗粒大小；展开剂纯度和极性； 薄层厚度；点样量；展开方式、温湿度；展开槽中的预饱 和状态等。 2、对照品比较法：常用。
色谱分析法概论PPT课件
7.3色谱分离的基本理论>>
7.3.2等温线
➢ 等温线： 在一定温度条件下，组分在固定相和流动相的分配
达到平衡时，在两相中的浓度之比值K为常数，由 此绘制出的cs与cm的关系曲线称为等温线。
c
cs
b
a
b前延峰
K=cs/cm
c
a正常峰
c拖尾峰
cm
俄国植物学家 茨维特
7.1概述>>
7.1.1色谱法的起源和发展
➢ Tswett植物色素分离 实验图示：
样 品：植物色素
固定相：CaCO3颗粒 流动相：石油醚
色谱柱
固定相 碳酸钙
流动相 石油醚
混合色素 叶绿素 叶黄素 胡萝卜素
分离组分
年代
1906 1931
1938
1941 1944 1949 1952 1956 1957 1958 1959 1964 1965
7.2色谱过程与术语>>
7.2.1色谱过程
色谱过程的实质
(1)色谱过程是吸附与 解析的过程；
(2)不同组分极性的差 异导致吸附与解析 的差异；
(3)不同组分向前移动 的过程是差异不断 累积过程，是在动 态中由量变到质变 的过程。
B
A B
BA
B A
B
B
A
B
A
t
流动相 样品液 色谱柱 固定相 检测器 c
年代 1937 1938 1939 1950 1951 1955 1958 1961
1970
1972
表7-2 色谱法起过关键作用的诺贝尔奖研究工作
获奖学科
获奖研究工作
化学
胡萝卜素化学，维生素A和B
色谱法讲义
色谱法讲义第七章色谱分析基础一、概述（一）色谱发展概况最早创立色谱法的是俄国植物学家Tswett。
他在研究植物叶子的色素成分时，将植物叶子的萃取物倒入填有碳酸钙的直立玻璃管内，然后加入石油醚使其自由流下，结果色素中各组分互相分离形成各种不同颜色的谱带。
当时Tswett把这种色带叫做“色谱”（Chromatographie，Tswett于1906年发表在德国植物学杂志上用此名，英译名为Chromatogra- phy），在这一方法中把玻璃管叫作“色谱柱”，碳酸钙叫作“固定相”，纯净的石油醚叫作“流动相”。
在Tswett提出色谱概念后的20多年里没有人关注这一伟大的发明。
直到1931年德国的Kuhn 和Lederer才重复了Tswett的某些实验，用氧化铝和碳酸钙分离了α-，β-，和γ-胡萝卜素，此后用这种方法分离了60多种这类色素。
Martin和Synge在 1940年提出液液分配色谱法（Liquid－Liquid Partition Chromatography），即固定相是吸附在硅胶上的水，流动相是某种有机溶剂。
1941年Martin和Syngee提出用气体代替液体作流动相的可能性，11年之后James和Martin发表了从理论到实践比较完整的气液色谱方法（Gas－Liquid Chromatography），因而获得了1952年的诺贝尔化学奖。
在此基础上，1957年Golay开创了开管柱气相色谱法（Open－Tubular Column Chromatography），习惯上称为毛细管柱气相色谱法（Capillary Column Chromatography ）。
1956年Van Deemter等在前人研究的基础上发展了描述色谱过程的速率理论，1965年Giddings总结和扩展了前人的色谱理论，为色谱的发展奠定了理论基础。
另一方面早在1944年Consden等就发展了纸色谱，1949年Macllean 等在氧化铝中加入淀粉粘合剂制作薄层板使薄层色谱法（TLC ）得以实际应用，而在1956年Stahl 开发出薄层色谱板涂布器之后，才使TLC得到广泛地应用。
色谱法PPT
迎头法 根据展开程序 可分为 顶替法 洗脱法
四、色谱法的特点
1.分离效率高.例如毛细管气相色谱柱（0.1～0.25μm i.d．） 30～50m其理论塔板数可以到 7万～12万.而毛细管电泳柱 一般都有几十万理论塔板数的柱效,至于凝胶毛细管电泳 柱可达上千万理论塔板数的柱效. 2.应用范围广.它几乎可用于所有化合物的分离和测定,无论 是有机物、无机物、低分子或高分子化合物,甚至有生物 活性的生物大分子也可以进行分离和测定. 3.分析速度快.一般在几分钟到几十分钟就可以完成一次复 杂样品的分离和分析.近来的小内径（0.1mm i. d．）、薄 液膜（0.2μm）、短毛细管柱（1～10 m）比原来的方法 提高速度5～10倍. 4.样品用量少.用极少的样品就可以完成一次分离和测定.
dp 0.01k Cg ' 2 (1 k ) Dg
'2
2
采用粒度小的填充物和相对分子质量小的气体（如氢气） 做载气，可使Cg减小，提高柱效。
液相传质过程是指试样组分从固定相的气/液界面
移动到液相内部，并发生质量交换，达到分配平衡，然 后又返回气/液界面的传质过程。
d 2 k' Cl 2 3 (1 k ') Dl
2 f
降低固定液的含量，可以降低液膜厚度，但k值随之变 小，又会使C1增大。 当固定液含量一定时，液膜厚度随载体的比表面积增 加而降低，因此，一般采用比表面积较大的载体来降低液膜 厚度。虽然提高柱温可增大D1，但会使 k’ 值减小，为了保持 适当的C1值，应控制适宜的柱温。
将上面式总结，即可得气液色谱板高方程
2
n有效
16R 1
2 s
[例] 已知物质A和B在一个30.0cm柱上的保留时间分
色谱技术
流动相用强极性溶剂，如水、醇、乙腈或无机盐
缓冲液。最常用的是不同比例的水和甲醇配制的 混合溶剂，水不仅起洗脱作用还可掩盖载体表面 的硅羟基，防止因吸附而至的拖尾现象。
通常在流动相中加入离子对试剂（三氟乙酸）来 增大蛋白质和多肽的疏水性。
4、离子交换色谱（ICE）
以离子交换树脂作为固定相，选择合适的溶剂
（2）抗体连接到载体上
离子交换色谱是最常用的蛋白质分离手段
操作要点：
– 由于蛋白质是两性电解质，在不同的pH值下，其解离 程度是不同的，因此既可以采用阳离子交换，也可以 用阴离子交换，可视具体情况而定 – 由于蛋白质的极性基团很多，为了避免洗脱困难，通 常采用弱阳或弱阴离子交换剂 – 适当调节缓冲溶液的pH值，使蛋白质适当解离，通常 采用的pH值靠近其等电点（不是等电点）
常用的吸附剂
氧化铝 硅胶 活性炭 纤维素 聚酰胺 硅藻土
展开剂的选择
展开剂极性越大，对同一化合物的洗脱能力越大 根据实验结果调整展开剂的极性以获得最佳的分
离的效果
展开剂选择的原则：
（1）对被分离组分应具有一定的解吸附能力，极
性应比被分离物质的极性略小
（2）展开剂应对被分离物质具有一定的溶解能力
信 进样 号
tM
因为这种物质不被固定相吸附或溶 解，故其流动速度将与流动相流动速度 相近。测定流动相平均线速ū时，可用柱
长L与tM的比值计算，即
ū = L/tM
2. 保留时间tR 试样从进样到柱后出现峰极大点时所 经过的时间，称为保留时间，如下图。
信 号
进样
tR
3.调整保留时间tR´ 某组分的保留时间扣除死时间后，称 为该组分的调整保留时间，
色谱分离的技术
7.1.2.2 按固定相形状不同分类
(1)柱色谱
进样量大，回收容易。 除用于分析外，还广泛用于生物样品 的制备和工业生物产品的分离与纯化。
(2)纸上色谱 广泛用于定性与定量分析，不用于制备和生产。
(3)薄层色谱
主要用于分析，也可用于小量样品的制备。
7.1.2.3 其他分类方法
(1) 根据流动相的物态分类 气相色谱 、液相色谱和超临界色谱
Ve Vo K d Vi
或
(7-29) (7-30)
Ve Vo Kd Vi
Kd＝1，溶质分子完全不被排阻， 可自由进入所有凝胶颗粒微孔。 Kd＝0，溶质分子完全被排阻于凝胶颗粒微孔之外，最先被洗脱。 对于中等分子，能进入部分凝胶空间，0＜Kd＜1。 当具有不同分子量物质的混合液流经凝胶柱时，其Kd值的大小就 决定了物质的流出顺序，即Kd值小的先流出，Kd值大的后流出。
7.1.4.2 吸附色谱
吸附色谱分离就是根据吸附剂(固定相)对不同物质的吸 附力不同而使混合物分离的。
离子交换色谱和亲和色谱也可归类于吸附色谱，前者主要 是静电引力的作用，而后者是生物专一亲和力的作用。
在一定温度下，分离物质在液相和固相中的浓度关系可用吸附 方程式来表示：
Ka A B A B Kd
极高的分辨率;
1944年 出现纸层析;
Chromatography 色谱 色谱法 色谱分析
Vs为固定相的体积 Vm为流动相的体积
注：K与组分的性质、流动相的性质、固定相的性质 以及柱温有关next
图示
分离机制 利用组分在流动相和固定相间溶解度差别实现分离 连续萃取过程 back
2.固定相和流动相
要求：
固定相→机械吸附在惰性载体上的液体,常用的固 定液有水、稀硫酸、甲醇、甲酰胺等强极性溶剂 载 体→惰性物质，无吸附性性质稳定，不与固 定相和流动相发生化学反应常用的有吸水硅胶、 纤维素、多孔硅藻土等。
色谱法的用途
用途：色谱法已广泛用于各个领域，是多组 分混合物首选的分离分析方法。以《中国药 典》2005版为例，一部收载中药1146个品种， 用薄层色谱进行鉴别或含量测定的有1523项， 用高效液相色谱进行定量分析的有479种518 项，用气相色谱进行检测的有47种。二部收 载的有1967个品种，采用高效液相色谱法的 品种有848种。现在色谱法已形成一门专门 的科学。
一、色谱过程、分离原理及特点 二、色谱流出曲线和有关概念 三、分配系数与色谱分离
一、色谱过程、分离原理及特点
㈠色谱过程 指被分离组分在两相中的“分配”平衡过 程 以吸附色谱为例见图示 吸附→ 解吸→再吸附 →再解吸 →反复多 次洗脱→被测组分分配系数不同→ 差速迁 移 → 分离
图示
分配系数的微小差异→吸附能力的微小差异 微小差异积累→较大差异→吸附能力弱的组分先 流出；吸附能力强的组分后流出back
流动相→必须与固定相不为互溶石油醚、醇类、 酮类、酯类、卤代烷及苯等。
3.洗脱顺序
正相色谱 固定相极性大于流动相极性,主要分 离极性样品.极性弱的组分先被洗脱，极性强的 组分后被洗脱。
液相色谱技术Chromatography共95页文档
4th M测定
原理：
mabloM g
挑 选 标 准 蛋 白 质 ： cyt C(12500), Mb(16900), 胰凝乳蛋白(23200),卵白蛋 白(45000)和Hb(64500).
条件：在凝胶介质分级范围内.
作图：
6）优点
1st 如其他色谱相比，操作简便，介质价廉易得；适合于 大规模生产；
7）缺点
1st 分离仅限于分子量的差别，选择性低，处理量少； 2nd 经GFC洗脱后，产品被稀释。因此需浓缩单元操作。
离子交换色谱
以离子交换树脂作为固定相，选择合适的 溶剂作为流动相，使溶质按照其离子交换 亲合力的不同而得到分离的方法
原理 (ion exchanger chromatography, IEC)
操作与原理：含有不同组分的溶液， 通过网状结构的凝胶粒子(a)， 小分子扩散进入凝胶相，大分 子被排阻于凝胶相外，加入洗 脱剂后溶液向下推移，大分子 及剩余的小分子进入下层新的 凝胶相中，重复上述扩散和排 阻。这样最先流出的为最大的 分子，最后流出的为最小分子， 分段收集可以获得按分子量大 小分布的各组分。
缺点：洗脱体积大,溶质洗脱不尽
2nd 线性梯度洗脱(linear gradient elution)
线性梯度洗脱的优缺点
优点：流动相I/pH 连续变化，不易出现干扰峰，操作范围广； 缺点：需要特殊的浓度梯度设备，如梯度混合器。
3 rd 阶梯洗脱法(stepwise elution)
优点：无须特殊设备，操作简单； 缺点：流动相浓度不断变化，易出现干扰峰，容易出现多 组分洗脱峰重叠的现象。
V 2 V 1 V t V 0 m 2 m 1
色谱法(chromatography)概念、特点和分类
色谱法（chromatography）概念、特点和分类1903年，俄国科学家M.C.ЦВЕТ首创了一种绿叶中分离多种不同颜色色素成分的方法，命名为色谱法(chromatography)，由于翻译和习惯的原因，又常称为层析法。
近百年来，色谱法不断发展，形式多种多样。
50年代开始，相继出现了气相色谱、液相色谱、高效液相色谱、薄层色谱、通透色谱、离子交换色谱、凝胶色谱、亲和色谱、金属螯合色谱等。
几乎每一种色谱法都已发展成为一门独立的生化技术，在生化领域内得到了广泛的应用。
色谱技术因操作较简便，设备不复杂，样品量可大可小，既可用于实验室的科学研究，又可用于工业化生产。
它与光电仪器、电子计算机结合，可组成各种各样的高效率、高灵敏度的自动化分离分析装置。
这充分显示色谱技术的强大生命力，它是近代生物化学发展的关键技术之一。
一、色谱法的概念和特点色谱法是利用混合物中各组分的理化性质的差异(吸附力、溶解度、分子形状和大小、分子极性、分子亲和力等)，使各组分以不同程度分布在两个相中，其中一个相叫固定相(stationnary phase)，另一相流过此固定相叫作流动相(mobile phase)。
由于各组分受流动相作用产生的推力和受固定相作用产生的阻力的不同，使各组分产生不同的移动速度，使得结构上只有微小差异的各组分得到分离。
再配合相应的光学、电学、电化学和或其他相关检测手段，对各组分进行定性和定量分析。
色谱法是一种物理化学分离分析方法。
它既是一种极好的分离纯化的方法，也是一种进行精确定性、定量分析的方法。
在色谱分析中，通常是根据色谱峰的位置来进行定性分析，根据色谱峰的面积或高度进行定量分析的。
色谱法的特点是：1．具有极高的分辨效力：只要选择好适当的色谱法(色谱类型、色谱条件)，它就能很好地分离理化性质极为相近的混合物，如同系物、同分异构体，甚至同位素，这是经典的物理化学分离方法不可能达到的。
2．具有极高的分析效率：一般说来，对某一混合组分的分析，只需几十分钟，乃至几分钟就可完成一个分析周期。
液相色谱法
（2）平面色谱法（Planar Chromatography）
按平面色谱材料不同可分为: 薄 层 色 谱 法 （ Thin Layer
相之间发生反复多次的分配过程。 色谱分离过程是不同物质分子在相对运动的两相之间，多次
分配平衡而得到分离的过程。
2.分配系数（distribution coefficient）K
在一定的温度和压力下，某个组分在固定相（S）与流 动相（m）中达到分配平衡时的浓度之比，称为该组分 的分配系数，即，K = Cs/Cm 。
按流动相分
按机理分
气相色谱（GC） 液相色谱（LC） 超临界流体色谱（SFC） 吸附色谱 分配色谱 离子交换色谱 排阻色谱 亲和色谱
三、色谱分离过程
（一）、色谱法的基本步骤
1、制备成色谱床：根据试样分析目的选择固定相，按操作 形式的要求制备成色谱床（装填成色谱柱，或涂铺到薄层 板上等）。 2、进样（或点样）。将处理好的样品以一定方式加到固定 相的一端。 3、洗脱或展开。将流动相以一定速率载运样品连续通过固 定相，使样品各组分在两相相对运动中彼此分离。 4、收集从色谱床上分离的各组分，进行检测（定性、定量 分析）。
气相色谱仪
气相色谱仪结构示意图
薄层色谱法
1956年出现薄层色谱法。
薄层色谱法
凝胶过滤色谱法
1959年出现凝胶过滤色谱法。
高效液相色谱法
1968年前后产生高效液相色谱法。
高效液相色谱仪
超临界流体色谱法(Supercritical Fluid，SCF)
色谱技术 [Chapter 7 Chromatography]
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Strategy/AC/1998/JB/Å. Danielsson
Three Phase Strategy - Ranking of Chromatography Techniques
分子筛凝胶色谱原理
Desalting proteins
proteins salts
(Hydrophobic Interaction Chromatography）
Hydrophobic interaction chromatography is a liquid chromatography technique that separates biomolecules according to their hydrophobicity
色谱系统的基本组成
色谱分离的基本概念
分配系数
可由Langmuir方程得出
Kd
Kd---分配系数
q c
q、c---溶质在固相和液相中的浓度
保留时间（tR）和保留体积（VR） 反应样品在柱子中的保留或阻滞能力，是色谱过
程的基本热力学参数之一
阻滞因子Rt 阻滞因子是在色谱系统中溶质的移动速度和标准物（与 固定相没有亲和力的流动相 Kd=0）的迁移率之比
疏水作用层析
Mechanism of HIC
A 280 0.04 AU
Na2SO4 1.0 M
疏 水 层 析 操 作
凝胶色谱填料
葡聚糖凝胶
Sephadex G-系列
聚丙烯酰胺凝胶
Sephacryl系列
琼脂糖凝胶
Sepharose系列
Superose系列
亲和色谱（Affinity chromatography）
色谱法（Chromatography）
⾊谱法（Chromatography）⾊谱法（C h r o m a t o g r a p h y）引论§1概述⼀、⾊谱法⾊谱法早在⼆⼗世纪初由俄国科学家建⽴，并⽤来分离植物⾊素。
后来不仅⽤于分离有⾊物质，还⽤来分离⽆⾊物质，并出现了各种类型的⾊谱法。
许多⽓体、液体和固体样品都能找到合适的⾊谱法进⾏分离和分析。
⽬前⾊谱法已⼴泛应⽤于许多领域，成为⼗分重要的分离分析⼿段。
各种⾊谱法共同的特点是具备两个相，有⼀相不动，称为固定相；另⼀相携带样品移动，称为流动相。
当流动相中样品混合物经过固定相时，就会与固定相发⽣作⽤，由于各组分在性质和结构上有差异，与固定相相互作⽤的类型、强弱就会有差异，因此在同⼀推动⼒下，不同组分在固定相滞留时间长短不同，从⽽按先后不同的次序从固定相中流出。
现以填充柱内进⾏的吸附⾊谱为例来说明⾊谱分离过程。
⾊谱柱内紧密⽽均匀的固定相，流动相则连续不断地流经其间，将样品⼀次性注⼊⾊谱柱后，各组分就被固定相所吸附，流动相不断地流⼊⾊谱柱。
当流动相流过组分时，已被吸附在固定相上的样品分⼦⼜溶解于流动相（此过程称为解吸）⽽随流动相向前移动，已解吸的组分遇到新的吸附剂颗粒，⼜再次被吸附。
如此在⾊谱柱内不断地发⽣吸附、解吸、再吸附、再解吸的过程。
不同组分其分⼦结构不同，在固定相上的吸附⼒也不同，随流动相向前移动的速度也就不同，最后从⾊谱柱内流出的时间不同，分别⽤容器盛接，就达到了分离的⽬的。
各组分间的性质差异即使很⼩，通过改进措施，如加长⾊谱柱，也可将它们分离。
⼆、⾊谱法分类1．按两相状态分类流动相为⽓体的⾊谱法称为“⽓相⾊谱法”（GC），其中固定相是固体吸附剂的称为⽓固⾊谱（GSC），固定相为液体的称为⽓液⾊谱（GLC）。
流动相为液体的⾊谱法称为“液相⾊谱法”（LC），同上，液相⾊谱法也可分成液固⾊谱（LSC）和液液⾊谱（LLC）。
2．按分离机理分类根据组分与固定相的作⽤，可分为：吸附⾊谱法、分配⾊谱法、离⼦交换⾊谱法、凝胶⾊谱法等。
色谱法 分离分析技术论文
色谱分离技术及其应用摘要：色谱法（chromatography）是用于分离多组分有机混合物的一种高效分离技术，色谱分析技术已成为药物分析学科领域中最基本也是最重要的研究手段和方法，具有广阔的应用前景。
海洋真菌及其代谢产物中的某种化学成分是天然药物和天然食品添加剂的重要来源。
由于某些有效的成分往往含量较低，并与许多其他化学成分并存，其提取分离是一项繁琐而艰巨的工作。
色谱技术的发展与应用，对于各类有机物化学成分的分离、纯化与鉴工作起着重大的推动作用。
色谱法（chromatography）是用于分离多组分有机混合物的一种高效分离技术，色谱分析技术已成为药物分析学科领域中最基本也是最重要的研究手段和方法，具有广阔的应用前景。
关键字：色谱法；分离鉴定；药物提取Chromatographic separation technology and its application Abstract：Chromatography is a highly efficient separation technology which is used to isolate multi-component organic mixture. Chromatography technology has become one of the most important and fundamental research tools and methods in drug analysis area. It has broad application prospects. The chemical compositions of marine fungus and their metabolites is an important source of some natural medicine and natural food additives. Because of the low contents of some active ingredients and co-existence with many other chemical elements, their extraction and isolation is a tedious and difficult task. Development and application of chromatographic technique is playing a significant role in promoting the separation, purification and identification of various organic chemical components.Keywords：Chromatography;Isolation and identification;drug extraction1.色谱法概况色谱法（chromatography）又称色层法、层析法，是用于分离多组分有机混合物的一种高效分离技术。
仪器分析 第7章 高效液相色谱法
由非极性固定相和极性流动相所组成的 液相色谱体系，与正相 HPLC 体系正好相反。 其代表性的固定相是十八烷基键合硅胶 (ODS 柱），代表性的流动相是甲醇和乙腈。 是当今液相色谱的最主要分离模式。
液-液分配色谱固定相的液体往往容易溶解到流 动相中去，所以重现性很差，不大为人们所采用。 后来发展起来的键合固定相以化学键合的方法 将功能分子结合到惰性载体上，固定相就不会溶解 到流动相中去了。
(3)工作温度： 气相色谱一般都在较高温度下进行的，而 高效液相色谱法则经常可在室温条件下工作。
高效液相色谱法主要类型
类 型 液固吸附色谱 主要分离机理 吸附能，氢键 主要分析对象或应用领域 异构体分离、族分离，制备
液液分配色谱 凝胶色谱 离子交换色谱
手性色谱 亲和色谱
疏水分配作用 溶质分子大小 库仑力
由于离子对化合物A-B+具有疏水性，因而 被非极性固定相（有机相）提取。组分离 子的性质不同，它与反离子形成离子对的 能力大小不同以及形成的离子对疏水性质 不同，导致各组分离子在固定相中滞留时 间不同，因而出峰先后不同。
B. 键合相反相离子对色谱法
离子对色谱法类型很多，根据流动相和 固定相的极性可分为反相离子对和正相离子 对色谱法。其中以键合相离子对色谱法最重 要。这种色谱法的固定相采用非极性的疏水 键合相［如十八烷基键合相（ ODS ）等］， 流动相为加有平衡离子（反离子）的极性溶 液（如甲醇—水或乙睛—水）。
抑制柱离子色谱的原理：
以阴离子分析为例：
分析柱反应：
R—Cl + NaOH R—OH + NaCl
抑制柱反应： + NaOH
R—Na + H2O
以阳离子分析为例：
演示文稿色谱课件
敏度高，而对不含碳物质无响应。
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7.2.3 色谱理论基础
1、气相色谱流出曲线
流动相带着组分通过色谱柱到达监测器时，由记录仪 得到的信号－时间曲线。
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2、色谱术语
基线：无试样通过检测器时，检测到的信 号即为基线。 基线漂移：基线随时间定向缓慢地变化。
基线
基线漂移
净化器:主要用来提高载气纯度。
稳压恒流装置:稳定载气流速。
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进样系统
包括进样装置和气化室
Dissolved in an organic solvent.
Injected into the carrier gas flow by syringe or valve.
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高效毛细管电泳法等。
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第二节 气相色谱法(GC)
Gas Chromatography
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7.2.1 概述
1、气相色谱法的特点
（1）分离效率高： 复杂混合物，有机同系物、异构体。手性异构体。
（2） 灵敏度高： 可以检测出μg.g-1(10-6)级甚至ng.g-1(10-9)级的物质量.
分离系统
气相色谱的分离系统是色谱柱，常 用的色谱柱有填充柱和毛细管柱两 种：填充柱是以固体吸附剂或涂渍 了固定液的载体颗粒填充到柱管内形成的柱子；毛细管柱内没
有填充颗粒，是将固定相涂渍或者以化学键合方式附着到管 内壁上。由于混合物各组分的分离在这里完成，所以它是色 谱仪中最重要的部件之一。
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调整保留时间（tR ＇）：tR＇= tR－tM
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B、用体积表示的保留值 保留体积（VR）：VR = tR×F0
色谱法的理论与实践
分配色谱（partition ~） 利用分配系数旳差别.
空间（分子）排阻色谱（steric exclusion ~）或称凝胶色谱法（gel ~） 利用被测物分子大小不同而造成旳渗透系 数差别.
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5
离子互换色谱（ion exchange ~）
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二、色谱法旳分类
▪ 按流动相与固定相旳分子汇集状态分类 按流动相旳分子汇集状态分类 GC， LC，超临界流体色谱（SFC） 按固定相旳汇集状态分类 气相色谱法（气-固，气-液） 液相色谱法（液-固，液-液）
按操作形式分类 柱色谱，平面色谱，逆流分配
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▪按色谱过程旳分离机制分类
拖尾峰（tailing peak）
前延峰（leading peak）
2024/9/2910来自峰形参数：掌握
对称因子（symmetry factor，fs）
fs =(A+B)/2A； 或用：
拖尾因子（tailing factor，T）来衡量
T=W0.05h/2d1
T=0.95～1.05(正常峰) T＜0.95(前延峰) T﹥1.05(拖尾峰)
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要点： 1.色谱理论 2.色谱分类措施 3.主要术语概念：
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毛细管电色谱（capillary electro- ~） 依托色谱与电场两种作用力，利用分配
系数和电泳速度差别而分离。 毛细管电泳 （capillary electrophoresis）
以高压电场为驱动力，根据样品组分旳 淌度和分配系数而分离。 手性色谱（chiral chromatography）
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多肽的分离纯化
Peptides from All Sources
How does a peptide differ from a protein?
Separation techniques
Peptide Protein
RPC
IEX
GF
GF IEX
RPC
5 / S. Renlund: Peptides from all sources/ ver. 3.1, 980610
分子筛凝胶色谱原理
Desalting proteins
proteins salts
凝胶色谱填料
葡聚糖凝胶 Sephadex G-系列 聚丙烯酰胺凝胶 Sephacryl系列 琼脂糖凝胶 Sepharose系列 Superose系列
(Hydrophobic Interaction Chromatography） Hydrophobic interaction chromatography is a liquid chromatography technique that separates biomolecules according to their hydrophobicity
常用展开剂的洗脱能力及极性比较 见书上151~152
一般吸附色谱的操作程序
根据要分离组分的性质（包括极性、分子量、 分子结构）选择合适的固定相和流动相 吸附操作：选择合适的操作条件（温度、pH值、 流速），进行装柱、平衡、上样，测定穿透样 品含量以调整操作参数 洗脱：采用有机溶剂洗涤、调节pH值以及体系 离子强度，最大限度地回收目标产物
Source RPC
Influence of Particle Size on the Separation effect 30µm 5µm 15µm
离子交换色谱
以离子交换树脂作为固定相，选择合适的溶剂作 为流动相，使溶质按照其离子交换亲合力的不同 而得到分离的方法
常用的离子交换树脂
葡聚糖凝胶型 DEAE-Sephadex A-25，QAE-Sephadex A25，CM-Sephadex C-25，SP-Sephadex C-25 纤维素系列离子交换剂 DEAE-Sephacel Cellex系列 琼脂糖系列离子交换剂 Sepharose系列 Sepharose CL-6B, Sepharose Fast Flow Bio-Gel A 系列交联琼脂糖离子交换剂
Peak 2
SDS-PAGE
Mini Q PC 3.2/3: Glutathione synthetase
分子筛凝胶色谱
在样品通过一定孔径的凝胶固定相时，由于流经 体积的不同，使不同相对分子量的组分得以分离 优点： 操作简便 分离效果好，重复性高，回收率高 分离条件温和 应用广泛 适用于生物大分子的初级分离，脱盐 分辨率低
6
Strategy/AC/1998/JB/Å. Danielsson
Three Phase Strategy
Purity
常用的吸附剂： 氧化铝 硅胶 活性炭 纤维素 聚酰胺 硅藻土
展开剂的选择
展开剂极性越大，对同一化合物的洗脱能力越大 因此，可以根据实验结果调整展开剂的极性以获 得最佳的分离的效果 展开剂选择的原则： （1）对被分离组分应具有一定的解吸附能力，极 性应比被分离物质的极性略小 （2）展开剂应对被分离物质具有一定的溶解能力
其意义在于体现某一种溶质与固定相之间的亲和力大小
洗脱体积 色谱柱中，使溶质从柱中流出所需流动相体积， 为洗脱体积
Ve = Vm + K dVs
不同的溶质，由于和固定相的亲和力的不同，洗 脱体积也有所差异
色谱柱的理论塔板数、塔板高度 反应不同时刻溶质在色谱柱中的分布以及分离度与 柱高之间的关系 理论塔板数的计算方法： tR 2 tR 2 N = 16( ) N = 5.54( ) Wb W1/ 2 N---理论塔板数 tR---保留时间 W1/2---半峰宽 Wb---峰底宽度 L H= 理论塔板高度：L---柱长
Small ligand (<1,000)
Risk of steric interference with binding between matrix and target molecule
Often need spacer arm
Spacer arm
AC ver 990326 30
but watch out for adsorption to the spacer!
色谱分离方法的分类
色谱分离方法很多，种类有四、五十种 但常用于生物大分子分离的色谱方法，按机理分， 有以下几种： 吸附色谱 分配色谱 离子交换色谱 凝胶色谱
色谱系统的基本组成
色谱分离的基本概念
分配系数 可由Langmuir方程得出
q Kd = c
Kd---分配系数 q、c---溶质在固相和液相中的浓度
N
吸附色谱
原理:利用溶质与吸附剂之间的分子吸附力(范德华 力，包括色散力、诱导力、定向力以及氢键)的差 异而实现分离 关键要素：吸附剂和展开剂的选择 吸附剂：氧化铝、硅胶、聚酰胺等，均含有不饱 和的氧原子或氮原子以及能够形成氢键的基团， 如-OH和-NH2
Adsorption chromatography
Chapter 7 色谱技术 Chromatography
本章主要知识点
什么是色谱分离技术？ 色谱分离技术的分类 什么是色谱柱的理论塔板数以及如何计算？ 吸附色谱及其分类和基本原理 什么是分配色谱？ 离子交换色谱的分类及应用
凝胶色谱的分离原理及分类 离子交换及疏水作用层析的原理 高效液相色谱的分离原理及应用 蛋白质分离的常用色谱方法有哪些？
HPLC
HPLC Chromatogram
反相液相色谱
反相液相色谱分离多肽和蛋白质使基于蛋白质 的疏水性，因此通常采用非极性的烷基固定相 作为填料，其表面化学性质和流动相的选择应 最大限度地满足疏水的要求 通常在流动相中加入离子对试剂（三氟乙酸） 来增大蛋白质和多肽的疏水性
载体：微粒多孔硅胶（粒径5μm~20 μm ） Hypersil Spherosil XOB075 固定相：C18、C8烷基链，C8适于分离蛋白质 C18适于分离核酸 苯基 流动相的选择 通常采用有机溶剂，乙腈、异丙醇、正丙醇和 四氢呋喃
分配色谱
原理：利用溶质在固定相和流动相之间的分配系 数不同而分离的方法 要素：固定相、载体、流动相
载体：通常为惰性材料，能吸附固定相液体 载体种类：
硅胶 硅藻土 纤维素 葡聚糖凝胶
固定相：通常选取各组分溶解度大的溶剂作为 固定相 详见P154 流动相可以是极性的（反相色谱法），也可以 是非极性的（正相色谱） *反相色谱固定相是非极性的, 流动相是极性的
疏水作用层析
Mechanism of HIC
A 280 A
280
Na2SO4 1.0 M
Na2SO4 1.0 M
0.04 A 0 0 20 10 min ml
0.0
亲和色谱（Affinity chromatography）
载体活化、配基连接、吸附、洗脱
Steric considerations & spacer arms
Identification: MS, A A Sequence
蛋白的纯化
Protein Purification
Analytical tools
A rapid and reliable assay for the target protein Purity determination (e.g. SDS-PAGE) Total protein determination (e.g. colorimetric method)
Synthetic Peptides
RPC method optimisation
Make test runs at two pH values
pH 2.5
pH 7.0
Make gradient optimisation at both pH values
Scale up and purify
Purity check: RP-HPLC, IEX, CZE 12 / S. Renlund: Peptides from all sources/ ver. 3.1, 980610
Competitive elution
Competitive elution
Binding
+
Release Elution
+
C+T
AC ver 990326 12
CT
蛋白质分离常用的色谱方法
免疫亲和层析 属于吸附色谱中的一种，利用抗原-抗体作用的高 度专一性以及较强的吸附力，实现特殊蛋白质的 分离 免疫亲和层析介质的获得： （1）获得抗体 （2）抗体连接到载体上
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ÄKTA explorer 100色谱系统
ÄKTA explorer 100色谱系统工作流程
纸层析
是一种常用的快速分离、鉴定方法，可用于定 性分析以及确定分离方案，但一般不用于定量 分析 介质：滤纸 操作方法：将试样溶于适当溶剂中，点样于滤 纸的一端；选用适当的展开剂，借助毛细管现 象从点样的一端向另一端流动，展开结束后， 取下滤纸，晾干，染色显迹
保留时间（tR）和保留体积（VR） 反应样品在柱子中的保留或阻滞能力，是色谱过 程的基本热力学参数之一
阻滞因子Rt 阻滞因子是在色谱系统中溶质的移动速度和标准物（与 固定相没有亲和力的流动相 Kd=0）的迁移率之比
溶质的迁移距离 Rf = 流动相在色谱系统中的迁移距离
Am Rf = Am + K d As
UF
Y.-F. Liao et al. (1996) J. Biol. Chem. 271, 28348