解及其降解性质粒的研究

　J ou rna l of N anj ing A g ricu ltu ra l U n iversity

一氯苯的微生物厌气降解及其降解性质粒的研究Ξ

罗如新　沈　标　李顺鹏

(南京农业大学微生物学系,南京210095)

摘要　以一氯苯为唯一碳源,从某化工厂废水处理厂的活性污泥中分离得一株一氯苯降解菌,初步鉴定属于气单胞菌属(A ero m onas)。用气相色谱法测得该菌在3周内的氯苯降解率为33%。不同的质粒消除试验结果表明,该菌质粒很稳定。已成功地将质粒转移到大肠杆菌(E.coli JF803)中。该转化子能利用一氯苯为唯一碳源生长,且转化子中有与原菌株电泳迁移率相同的质粒。因此,可以认为该质粒携带有降解一氯苯的基因。关键词　一氯苯;生物降解;质粒

中图分类号　X783

ANAEROB I C B I OD EGRADAT I ON OF CHLOROBENZENE AND PREL I M INARY

STUDY ON THE D EGRADAT IVE PLAS M I D S

L uo R ux in,Shen B iao and L i Shunp eng

(D ep t of M icrob i o logy,N an jing A gric U n iv,N an jing210095)

ABSTRACT　A ch lo robenzene degradative strain w as iso lated from activated sludge by u sing ch lo robenzene as so le carbon sou rce.It w as p reli m inarily iden tified as an A ero m onas.T he degradati on rate of ch lo robenzene w as33%in3w eek s tested w ith gas ch rom atography.D ifferen t m ethods w ere u sed to cu re the p las m ids and it w as found that the p las m ids w ere very stab le.T he p las m id w as tran sferred to E.coli.T he tran sfo rm an t cou ld u se ch lo robenzene as so le carbon sou rce and p las m id w as detected w ith the sam e electropho retic tran s2 ference rate as the o riginal strain.T hu s,it can be confirm ed that th is p las m id po ssesses the necessary gene fo r ch lo robenzene degradati on.

Key words　ch lo robenzene;b i odegradati on;p las m id

微生物对污染物质的代谢、转化及降解作用,是当今环境污染研究中最活跃的领域之一。目前,研究工作已转入对微生物降解代谢途径、酶系的研究和遗传控制的探讨。70年代,研究证实了降解某些烃的酶系基因在质粒上。之后,通过导入质粒来构建具有特殊功能和高效降解能力的遗传工程菌,为降解菌的定向育种开辟了一条新的途径。本项研究针对国内化工行业生产的一氯苯所带来的污染状况,探讨了厌氧条件下微生物对一氯苯的利用能力,并验证了降解质粒的存在,这将为一氯苯的微生物降解研究增添新的内容,并为构建高效工程菌株补充又一菌种来源。

Ξ江苏省科技计划项目(90013)

收稿日期:1996203228

46南京农业大学学报20卷

1　材料与方法

111　样品来源

活性污泥样品采自苏州化工厂废水处理厂。

112　一氯苯厌气降解菌的富集培养、分离和鉴定

富集培养基成分:蛋白胨100g,K2H PO41.0g,葡萄糖1.0g,N aC l1.0g,加水至1L。pH7.0～7.2。无机盐培养基成分:N H4NO31.0g,(N H4)2SO40.5g,M gC l20.5g,KH2PO4 0.5g,K2H PO41.5g,N aC l0.5g,加水至1L。pH7.0～7.2。

在厌氧条件下,150m l富集培养基中加活性污泥5m l进行富集培养(一氯苯50m g L)。每隔一周将富集培养液转接一次(接种量为10%,新鲜培养液中一氯苯依次增加50m g L),转移5次后,一氯苯达到300m g L。然后用无机盐培养基代替富集培养基驯化1周。

以含一氯苯300m g L的固体无机盐培养基进行滚管分离,约1周后出现菌落。厌氧条件下将较大的菌落移入含300m g L一氯苯的液体无机盐培养基中,培养1周后,再滚管分离。连续2次分离后,选择生长最快的菌落移入液体无机盐培养基中。该菌株暂定名为L1。

按常规方法[1,2]对L1菌株进行鉴定。

113　一氯苯的含量测定

用气相色谱法测定一氯苯含量。气相色谱条件为:DC Q F21115%,2.1m,汽化室温度230℃,柱温190℃,N270m l m in。在80m l瓶中装入50m l含300m g L一氯苯的无机盐培养基,厌氧培养。每隔5d取样测定。样品处理方法为:取样1m l,加1m l苯,充分振荡,静止2h 分层;取上层有机相,加少量无水硫酸钠,澄清后测定。

114　L1菌株的质粒检测

按文献[3]的方法进行。

115　L1菌株的质粒消除试验

LB培养基:胰蛋白胨10g,酵母抽提物5g,N aC l10g,加水至1L。pH7.0～7.2。

挑L1菌株单菌落在3m l LB液体培养基中37℃静止过夜。菌悬液用生理盐水稀释至10-5,各取015m l菌液分别转接至5m l含不同浓度消除剂的LB培养液中,37℃培养48h。菌培养液经生理盐水适当稀释后涂布至LB平板上,生长过夜;用牙签分别挑取单菌落点种到LB培养基平板和含一氯苯300m g L的无机盐培养基平板上,培养3～4d,观察结果[4]。在含一氯苯的无机盐培养基平板上不能生长的菌落初步确定为质粒消除的阴性突变子,可从对应的LB平板上挑取。

116　L1菌株质粒D NA转化

按文献[3]的方法进行。

2　结果与讨论

211　细菌的分离鉴定

经鉴定,L1菌株为革兰氏阴性无芽孢杆菌,极生单鞭毛,兼性厌氧,接触酶、氧化酶阳性,硝酸盐还原试验阳性,葡萄糖发酵产酸、产气,肌醇发酵产酸、产气,不液化明胶,水解淀粉,不利用柠檬酸,最适温度30～37℃,最高温度44～45℃。据此,初步将L1菌定为气单胞菌