凝胶层析原理
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1 2 Gel
检
装
查
填
好
胶
管
体
柱
是
否
畅
通
上 清
沉
淀
中
紧
已 堆 积
密 堆 积
暂
停
流 洗
X
继
继
续
续
流
流
洗
洗
2、加样 ※使液面和凝胶表面相切，关闭出口 ※加样时尽量不要破坏凝胶面 ※让样品进入凝胶以后在加蒸馏水开始洗脱
三、结果要求：
血红蛋白和二硝基苯-鱼精蛋白的 洗脱体积？
在单位时间内被吸附于吸附剂的某一表面积上的分子和 同一单位时间内离开此表面的分子之间可以建立动态平衡， 吸附层析就是不断地产生平衡与不平衡，吸附与解吸
吸附层析
? 常用的吸附剂
硅胶
氧化铝
碱性:碳氢化合物 中 性:醛,酮,醌,酯,内酯酸 性:酸性色素,醛,酸
活性炭
粉末:吸附力大,流速慢 颗粒:吸附力中,流速易控 锦纶-活性炭:吸附力弱
95% water
■ 凝胶层析法：
分子筛效应：
分子大小不同 , 在凝胶受到的 阻滞作用有差 异,从而造成各 组分在凝胶柱 中的迁移速度 不同得到分离 。 小分子
被延滯
小分子
固 定 相
样品
流 动 相
大分子
较快流出
凝胶层析过程的数理关系
1、柱床体积 (VT) 2、洗脱体积（ Ve）
VT = 1/4 ?D2h
溶质在流动相中的浓度 Cm
特定的温度：常数 K大：被固定相吸附的牢固，随流动相
的移动速度较慢。
纯化生物物质的纯度
取决于混合物中各组分K 值的差异程度
混合物中各组分若 K值相差较大 , 则能 较易地把混合物中的生物物质分离 。 反 之,K值相差较小 ,不易把混合物中的生物物 质分离
32
16
8
4
16
ion-exchange chromatography
（1）吸附层析
? 定义
指混合物随流动相通过吸 附剂时，由于吸附剂对 不同物质的吸附力而使 混合物分离的方法
? 原理
在不同条件下，吸附剂与 被吸附物之间的作用
物理作用的范德华吸附：
无选择性，吸附速度快， 吸附的过程是可逆的
化学吸附： 由原子价力的作 用引起。有选择性，吸附 速度较慢，不易解吸
Ve=Vo+KdVi
Ve –Vo Kd = ————
Vi
特点： （1）与被分离物质分子的 大小和凝胶颗粒孔隙的大 小有关 （2）与柱的长短粗细无关
(1)Ve = Vo
Kd = 0
?分子完全被排阻 于凝胶颗粒之外
?全部分布于流动 相里,
?最先流出。
(2)Ve = Vo + Vi
Kd = 1
?分子完全不被排阻
? 即欲分离物质通过层析柱洗脱下来所需洗脱液的 总体积。
3、外水体积（ V0）即存在于柱床内凝胶外面空隙 之间的水相体积，相应于一般层析法中流动相的 体积。
4、内水体积（ Vi）即凝胶颗粒内部所含水相的体 积，它可从干凝胶颗粒重量和吸水重量求得。
5、凝胶干体积（ Vg）
数理关系
外水体积 V0
存在于柱床内凝胶 外面空隙之间的水 相体积，相应于一 般层析法中流动相 的体积。
四、凝胶层析的缺点 1. 要求 样品和洗脱液的
粘度很低
2.凝胶颗粒网络 孔径大 小非常有限 , 所以可 被纯化的物质的 分子 量范围受到限制
3.凝胶结构 对某些溶质 分子具有吸附作用
五、凝胶的结构与性能
1.葡聚糖凝胶 1959年Porath和Flodin 合成 （商品名为 Sephadex ）
（1）结构： 基本骨架： 葡聚糖（ dextran ） 交联剂： 3-氯代-1 ,2- 环氧氯
丙烷使葡聚糖之间通过醚键 交联聚合而成的 三维空间网 状结构
（2）特点：
交联度： ? 交联剂越多
交联度越大 网孔结构越紧密 ? 交联剂越少 交联度越小 网孔结构越疏松
化学性质：
稳定,不溶于 水、盐、弱酸、 碱和一般有机溶 剂, 耐热耐碱不 耐强酸
（2）特点：
Sephadex的分级范围
G10 <700 G15 <1,500 G25 1,000-5,000 G-50 1,500-30,000 G-75 3,000-70,000 G100 4,000-150,000 G150 5,000-400,000 G200 5,000-800,000
16
12
2
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K=1
8
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8
2
1
2
3
4
5
100
10
1
90
18
0.1
0.01
K=0.1
2.7
0.36
81
24.3
4.86
72.9
29.16
65.61
凝胶层析
Gel Chromatography
凝胶过滤 （gel filtration ）(Porath, Flodin, 1959) 分子筛层析（ molecular sieve chromatography ）
1958年，Stein和Moore研制出氨基酸分析仪，确定了核糖核 酸的分子结构 1967年，Horvvath和Huber等研制了高效液相色谱(highperformance liquid chromatography,HPLC)仪
1975年，Small等提出离子色谱
20世纪80年代，超临界色谱
20世纪90年代，毛细管电泳（1809年Re?ss第一次电泳实验）
21世纪，联用技术、大分子色谱分离、制备色谱可望取得更 大的发展
层析法进行时有两个相，一个相 称为固定相，另一相称为流动相。
支持物
含待分离物质
二.层析技术的分类
1. 按两相所处的状态分类
气
气-固
相 以气体作为流动相
层
气-液
析
液 液-固
相
以液体作为流动相
层 液-液
析源自文库
2.按层析的机制可分为
? 吸附层析adsorption chromatography ? 分配层析partition chromatography ? 凝胶层析gel chromatography ? 亲和层析affinity chromatography ? 离子交换层析
一、原理：
血红蛋白 二硝基苯 -鱼精蛋白 Sephadex G-50 孔径
Kd=0
64,480 2,000-12,000 1,500-30,000
Kd=1
二、操作注意点：
1、装柱 ※先用蒸馏水赶走层析柱中的死体积
※凝胶不能有气泡和分层现象 ※装柱结束后要保持凝胶表面平整
■ 凝胶柱的装填方法：
Gel
NaCl
Elution volume (ml)
测分子量
Ve
log Mr
对同一类型的化合物,洗 脱特性与组分的分子量 有关,流过凝胶柱时,按 分子量(MW)大小顺序流 出,MW大的走在前面,Ve 与MW的关系可用下式表 示:
Ve = K1 - K2lgMW
K1,K2 为常数, MW为分 子量
实验： 凝胶层析法分离蛋白质
?完全向凝胶颗粒内 部扩散
?在两相分配的比值 为1,最后流出.
(3) 0 <Kd <1 Ve = Vo +ViKd
?为溶质以某种程度 向凝胶颗粒内扩散
Kd=0 0＜Kd<1 Kd=1
洗脱体积
三.凝胶层析的优点
1. 凝胶是一种不带电 荷的惰性载体，结 构稳定
2.操作条件较温和 。
3. 样品得率高 , 重复 性好 ,可进行大量样 品的分离纯化
聚酰胺
锦纶66或锦纶6
酰
胺基团
对
酚,DNP-氨基酸, 醌,羧酸
氢键：羟基与羰基
磷酸钙
唯一用于生物活性物质 羟基磷灰石
（2）分配层析
——利用不同组分 在流动相和固定相中的分 配系数不同 而进行分离的方法。
3.按制备量分类
? 柱层析colum chromatography 进样量大且容易回收
? 薄层层析thin layper chromatography 小量样品，快速， 操作简便
品稀释 , 柱长而窄 , 则 柱的管壁效应较大 ,会 造成拖尾现象
2.样品的选择： 量适当, 粘度小
3.洗脱液的选择： 每种样品分离所用的缓 冲洗脱液应根据 使样品 稳定的原则使用
七、应用
1.分离纯化 2.脱盐 3.测分子量
? Desalting in a simple column
Albumin
L L
Mobile Stationary phase phase
流动相 固定相
样本分子依其分子极性 选择亲和两相之一
吸附层析
Liquid - Solid
分配层析
Liquid - Liquid
3、层析的发展
? 1903年
俄国植物学家
茨维特
发表了有关填充以菊根粉的玻璃柱分离植 物色素，以石油醚冲洗，得到黄色、绿色区
Sephadex glucose
■
Sepharose agarose
各
Sephacryl glucose + acrylamide
种
Sephacel cellulose
层 析
胶 体
Bio-Rad
：
BioGel P acrylamide
BioGel A agarose
六.其它条件选择
1.柱的选择 柱短而粗,则易使样
带;
1931 年， Kuhn 采用柱色谱分离了类胡萝卜素 1941年， Martin 和Synge 提出分配色谱法 1944年， Martin 等又提出纸色谱法 1952年， Martin 和James 发明了气液色谱法 1955年，第一台商品气相色谱问世，标志着现代
色谱分析的建立 1956年，Stahl系统研究了薄层色谱法 (TLC)
小结
名称
醋酸纤维 素电泳 琼脂糖凝 胶电泳
PAGE
原理
电极缓 冲液
支持介 质
电泳形 式
加样方 式
染色液
分辨率
IEF
SDSPAGE
层析
CHROMATOGRAPHY
一、概述
1、定义
层析(又名色谱 )
一种利用混合物中 各组分的 物理化学性质 间的差异 ，使各组分在 层析两相中以不同程度 分配，借此将各组分分 离。
吸水性 ? G类的型号 表示每克干凝胶吸
水量（ml ）x10 如G-50
每克干凝胶吸 水量为5ml
2.琼脂糖凝胶（商品名为Sepharose)
? 大孔凝胶 ? 工作范围的下限几乎是 Sephadex 的上限 ? 可分离MW40万以上的物质 ? 可用来分离核酸及病毒。
3.聚丙烯酰胺凝胶
Pharmacia
(Hjertén, Mosbach, 1962)
排阻层析 （exclusion chromatography ）(Pedersen,
1962)
指混合物随流动相经固定相的层析柱时， 混合物中各组份按其分子大小不同而被分离 的技术。
一、基本原理
固定相（凝胶）
? ——三维空间网状结构
A good gel for gel filtration contains about
2、物理化学性质间的差异
分子极性 分子大小 分子形状 离子亲和力 分子亲和力 吸附能力
凝胶层析
离子交换层析 亲和层析
吸附层析
■ 层析分析法的基本原理：
A
B
C
非 极 性
两相系统
极 性
每次分离样本 都要做一次选择
One Plate of
非 极 性
极 Separation 性 (理论板数)
样本
L
S
样本
■ 层析法的演变过程：
圆形滤纸
长条滤纸
加展开液
柱层析
薄层层析 (TLC)
容量变大
容量更大
纸层析
薄层层析
三.层析的一般原理
1.分配系数 Partition coefficient 表示一种物质在两种特定相（流动相和固定相）
中分配程度 溶质在固定相中的浓度 Cs
K= ———————————— = ——
凝胶干体积Vg 内水体积Vi
柱床体积VT
颗粒内部所含水相 的体积它可从干凝 胶颗粒重量和吸水 重量相减求得。
凝胶体积以及颗粒内 外间隙体积的总和。
VT = 1/4 ? D2h VT = Vg + V0 + Vi
6、分配系数（ Kd ）：
每个溶质分子在流动相和固定相之间有一 个特定的分配系数（ Kd）
检
装
查
填
好
胶
管
体
柱
是
否
畅
通
上 清
沉
淀
中
紧
已 堆 积
密 堆 积
暂
停
流 洗
X
继
继
续
续
流
流
洗
洗
2、加样 ※使液面和凝胶表面相切，关闭出口 ※加样时尽量不要破坏凝胶面 ※让样品进入凝胶以后在加蒸馏水开始洗脱
三、结果要求：
血红蛋白和二硝基苯-鱼精蛋白的 洗脱体积？
在单位时间内被吸附于吸附剂的某一表面积上的分子和 同一单位时间内离开此表面的分子之间可以建立动态平衡， 吸附层析就是不断地产生平衡与不平衡，吸附与解吸
吸附层析
? 常用的吸附剂
硅胶
氧化铝
碱性:碳氢化合物 中 性:醛,酮,醌,酯,内酯酸 性:酸性色素,醛,酸
活性炭
粉末:吸附力大,流速慢 颗粒:吸附力中,流速易控 锦纶-活性炭:吸附力弱
95% water
■ 凝胶层析法：
分子筛效应：
分子大小不同 , 在凝胶受到的 阻滞作用有差 异,从而造成各 组分在凝胶柱 中的迁移速度 不同得到分离 。 小分子
被延滯
小分子
固 定 相
样品
流 动 相
大分子
较快流出
凝胶层析过程的数理关系
1、柱床体积 (VT) 2、洗脱体积（ Ve）
VT = 1/4 ?D2h
溶质在流动相中的浓度 Cm
特定的温度：常数 K大：被固定相吸附的牢固，随流动相
的移动速度较慢。
纯化生物物质的纯度
取决于混合物中各组分K 值的差异程度
混合物中各组分若 K值相差较大 , 则能 较易地把混合物中的生物物质分离 。 反 之,K值相差较小 ,不易把混合物中的生物物 质分离
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4
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ion-exchange chromatography
（1）吸附层析
? 定义
指混合物随流动相通过吸 附剂时，由于吸附剂对 不同物质的吸附力而使 混合物分离的方法
? 原理
在不同条件下，吸附剂与 被吸附物之间的作用
物理作用的范德华吸附：
无选择性，吸附速度快， 吸附的过程是可逆的
化学吸附： 由原子价力的作 用引起。有选择性，吸附 速度较慢，不易解吸
Ve=Vo+KdVi
Ve –Vo Kd = ————
Vi
特点： （1）与被分离物质分子的 大小和凝胶颗粒孔隙的大 小有关 （2）与柱的长短粗细无关
(1)Ve = Vo
Kd = 0
?分子完全被排阻 于凝胶颗粒之外
?全部分布于流动 相里,
?最先流出。
(2)Ve = Vo + Vi
Kd = 1
?分子完全不被排阻
? 即欲分离物质通过层析柱洗脱下来所需洗脱液的 总体积。
3、外水体积（ V0）即存在于柱床内凝胶外面空隙 之间的水相体积，相应于一般层析法中流动相的 体积。
4、内水体积（ Vi）即凝胶颗粒内部所含水相的体 积，它可从干凝胶颗粒重量和吸水重量求得。
5、凝胶干体积（ Vg）
数理关系
外水体积 V0
存在于柱床内凝胶 外面空隙之间的水 相体积，相应于一 般层析法中流动相 的体积。
四、凝胶层析的缺点 1. 要求 样品和洗脱液的
粘度很低
2.凝胶颗粒网络 孔径大 小非常有限 , 所以可 被纯化的物质的 分子 量范围受到限制
3.凝胶结构 对某些溶质 分子具有吸附作用
五、凝胶的结构与性能
1.葡聚糖凝胶 1959年Porath和Flodin 合成 （商品名为 Sephadex ）
（1）结构： 基本骨架： 葡聚糖（ dextran ） 交联剂： 3-氯代-1 ,2- 环氧氯
丙烷使葡聚糖之间通过醚键 交联聚合而成的 三维空间网 状结构
（2）特点：
交联度： ? 交联剂越多
交联度越大 网孔结构越紧密 ? 交联剂越少 交联度越小 网孔结构越疏松
化学性质：
稳定,不溶于 水、盐、弱酸、 碱和一般有机溶 剂, 耐热耐碱不 耐强酸
（2）特点：
Sephadex的分级范围
G10 <700 G15 <1,500 G25 1,000-5,000 G-50 1,500-30,000 G-75 3,000-70,000 G100 4,000-150,000 G150 5,000-400,000 G200 5,000-800,000
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K=1
8
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10
1
90
18
0.1
0.01
K=0.1
2.7
0.36
81
24.3
4.86
72.9
29.16
65.61
凝胶层析
Gel Chromatography
凝胶过滤 （gel filtration ）(Porath, Flodin, 1959) 分子筛层析（ molecular sieve chromatography ）
1958年，Stein和Moore研制出氨基酸分析仪，确定了核糖核 酸的分子结构 1967年，Horvvath和Huber等研制了高效液相色谱(highperformance liquid chromatography,HPLC)仪
1975年，Small等提出离子色谱
20世纪80年代，超临界色谱
20世纪90年代，毛细管电泳（1809年Re?ss第一次电泳实验）
21世纪，联用技术、大分子色谱分离、制备色谱可望取得更 大的发展
层析法进行时有两个相，一个相 称为固定相，另一相称为流动相。
支持物
含待分离物质
二.层析技术的分类
1. 按两相所处的状态分类
气
气-固
相 以气体作为流动相
层
气-液
析
液 液-固
相
以液体作为流动相
层 液-液
析源自文库
2.按层析的机制可分为
? 吸附层析adsorption chromatography ? 分配层析partition chromatography ? 凝胶层析gel chromatography ? 亲和层析affinity chromatography ? 离子交换层析
一、原理：
血红蛋白 二硝基苯 -鱼精蛋白 Sephadex G-50 孔径
Kd=0
64,480 2,000-12,000 1,500-30,000
Kd=1
二、操作注意点：
1、装柱 ※先用蒸馏水赶走层析柱中的死体积
※凝胶不能有气泡和分层现象 ※装柱结束后要保持凝胶表面平整
■ 凝胶柱的装填方法：
Gel
NaCl
Elution volume (ml)
测分子量
Ve
log Mr
对同一类型的化合物,洗 脱特性与组分的分子量 有关,流过凝胶柱时,按 分子量(MW)大小顺序流 出,MW大的走在前面,Ve 与MW的关系可用下式表 示:
Ve = K1 - K2lgMW
K1,K2 为常数, MW为分 子量
实验： 凝胶层析法分离蛋白质
?完全向凝胶颗粒内 部扩散
?在两相分配的比值 为1,最后流出.
(3) 0 <Kd <1 Ve = Vo +ViKd
?为溶质以某种程度 向凝胶颗粒内扩散
Kd=0 0＜Kd<1 Kd=1
洗脱体积
三.凝胶层析的优点
1. 凝胶是一种不带电 荷的惰性载体，结 构稳定
2.操作条件较温和 。
3. 样品得率高 , 重复 性好 ,可进行大量样 品的分离纯化
聚酰胺
锦纶66或锦纶6
酰
胺基团
对
酚,DNP-氨基酸, 醌,羧酸
氢键：羟基与羰基
磷酸钙
唯一用于生物活性物质 羟基磷灰石
（2）分配层析
——利用不同组分 在流动相和固定相中的分 配系数不同 而进行分离的方法。
3.按制备量分类
? 柱层析colum chromatography 进样量大且容易回收
? 薄层层析thin layper chromatography 小量样品，快速， 操作简便
品稀释 , 柱长而窄 , 则 柱的管壁效应较大 ,会 造成拖尾现象
2.样品的选择： 量适当, 粘度小
3.洗脱液的选择： 每种样品分离所用的缓 冲洗脱液应根据 使样品 稳定的原则使用
七、应用
1.分离纯化 2.脱盐 3.测分子量
? Desalting in a simple column
Albumin
L L
Mobile Stationary phase phase
流动相 固定相
样本分子依其分子极性 选择亲和两相之一
吸附层析
Liquid - Solid
分配层析
Liquid - Liquid
3、层析的发展
? 1903年
俄国植物学家
茨维特
发表了有关填充以菊根粉的玻璃柱分离植 物色素，以石油醚冲洗，得到黄色、绿色区
Sephadex glucose
■
Sepharose agarose
各
Sephacryl glucose + acrylamide
种
Sephacel cellulose
层 析
胶 体
Bio-Rad
：
BioGel P acrylamide
BioGel A agarose
六.其它条件选择
1.柱的选择 柱短而粗,则易使样
带;
1931 年， Kuhn 采用柱色谱分离了类胡萝卜素 1941年， Martin 和Synge 提出分配色谱法 1944年， Martin 等又提出纸色谱法 1952年， Martin 和James 发明了气液色谱法 1955年，第一台商品气相色谱问世，标志着现代
色谱分析的建立 1956年，Stahl系统研究了薄层色谱法 (TLC)
小结
名称
醋酸纤维 素电泳 琼脂糖凝 胶电泳
PAGE
原理
电极缓 冲液
支持介 质
电泳形 式
加样方 式
染色液
分辨率
IEF
SDSPAGE
层析
CHROMATOGRAPHY
一、概述
1、定义
层析(又名色谱 )
一种利用混合物中 各组分的 物理化学性质 间的差异 ，使各组分在 层析两相中以不同程度 分配，借此将各组分分 离。
吸水性 ? G类的型号 表示每克干凝胶吸
水量（ml ）x10 如G-50
每克干凝胶吸 水量为5ml
2.琼脂糖凝胶（商品名为Sepharose)
? 大孔凝胶 ? 工作范围的下限几乎是 Sephadex 的上限 ? 可分离MW40万以上的物质 ? 可用来分离核酸及病毒。
3.聚丙烯酰胺凝胶
Pharmacia
(Hjertén, Mosbach, 1962)
排阻层析 （exclusion chromatography ）(Pedersen,
1962)
指混合物随流动相经固定相的层析柱时， 混合物中各组份按其分子大小不同而被分离 的技术。
一、基本原理
固定相（凝胶）
? ——三维空间网状结构
A good gel for gel filtration contains about
2、物理化学性质间的差异
分子极性 分子大小 分子形状 离子亲和力 分子亲和力 吸附能力
凝胶层析
离子交换层析 亲和层析
吸附层析
■ 层析分析法的基本原理：
A
B
C
非 极 性
两相系统
极 性
每次分离样本 都要做一次选择
One Plate of
非 极 性
极 Separation 性 (理论板数)
样本
L
S
样本
■ 层析法的演变过程：
圆形滤纸
长条滤纸
加展开液
柱层析
薄层层析 (TLC)
容量变大
容量更大
纸层析
薄层层析
三.层析的一般原理
1.分配系数 Partition coefficient 表示一种物质在两种特定相（流动相和固定相）
中分配程度 溶质在固定相中的浓度 Cs
K= ———————————— = ——
凝胶干体积Vg 内水体积Vi
柱床体积VT
颗粒内部所含水相 的体积它可从干凝 胶颗粒重量和吸水 重量相减求得。
凝胶体积以及颗粒内 外间隙体积的总和。
VT = 1/4 ? D2h VT = Vg + V0 + Vi
6、分配系数（ Kd ）：
每个溶质分子在流动相和固定相之间有一 个特定的分配系数（ Kd）