水果及其制品中果胶含量的比色法测定条件优化_庞荣丽
合集下载
相关主题
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
1 材料和方法
1.1 材料 标准物质：半乳糖醛酸（分析纯）。 试验样品：香蕉；猕猴桃；桃；甜樱桃；橙汁；葡萄 汁。 试剂：无水乙醇（优级纯）；氢氧化钠（分析纯）；
硫酸（优级纯，与咔唑-无水乙醇溶液不应产生颜色 反应）；咔唑（分析纯）。
仪器：水浴振荡器；离心机；分光光度计。 1.2 方法 1.2.1 方法原理 用无水乙醇沉淀试样中的果胶， 在碱性条件下，经水解后生成半乳糖醛酸，后者在硫 酸中与咔唑试剂发生缩合反应，生成紫红色络合物， 该络合物在 525 nm 处有最大吸收，其吸收值与果胶 含量成正比，以半乳糖醛酸为标准物质，标准曲线法 定量。 1.2.2 样品预处理 称取 1.0 g~5.0 g（精确至 0.001 g）试样于 50 mL 刻度离心管中，加入少量滤纸屑，再 加入 35 mL 约 75 ℃的无水乙醇， 在 85 ℃水浴振荡 器中加热 10 min，充分振荡。 冷却，再加无水乙醇使 总体积接近 50 mL， 在 4 000 r·min-1 的条件下离心 15 min，弃去上清液。 在 85 ℃水浴中用 67%乙醇溶 液洗涤沉淀，离心分离，弃去上清液，此步骤反复操 作，直至上清液中不再产生糖的穆立虚反应为止，保 留果胶沉淀 A。 同时做试剂空白试验。 1.2.3 果 胶 提 取 液 的 制 备 将 果 胶 沉 淀 A 用 去 离 子水全部洗入 100 mL 容量瓶中。加入 1.0 mol·L-1 氢 氧化钠溶液 5.0 mL，用水稀释至刻度，混匀。 至少放 置 15 min，并不时摇荡。 过滤，保留滤液 B，用于比色 测定。 1.2.4 标准系列配制 以 1 000 mg·L-1 的半乳糖醛 酸溶液为标准储备溶液， 制备系列质量浓度为 0.0、 20.0、40.0、60.0、80.0、100.0、120.0 mg·L -1 的 标 准 使 用溶液。 1.2.5 测定 移 取 1.0 mL 滤 液 B 于 25 mL 玻 璃 试
分光光度计在 525 nm 波长处测量其吸光度，绘制标
准曲线比较定量（按上述方法同时做空白试验，用空
白调 0）。
1.2.6 结果计算 样品中果胶含量以半乳糖醛酸质
量分数 ω 计，单位为 g·kg-1，按公式（1）进行计算：
ω= ρ×V
（1）
m×100
式中： ρ—滤液 B 中半乳糖醛酸质量浓度， 单位为
Study on the colorimetry determination conditions of pectin in fruits and derived products
PANG Rong-li1， ZHANG Qiao-lian2， GUO Lin-lin1， FANG Jin-bao1*， XIE Han-zhong1， LI Jun1， LUO Jing1， WU Feng-kui1
（1Zhengzhou Fruit Research Institute， CAAS/ Monitor & Test Center of Fruit and Nursery Stock Quality ， the Ministry of Agriculture， Zhengzhou， Henan 450009 China； 2Department of Landscape & Horticulture， Xuchang Vocational Technical College， Xuchang， Henan 461000 China）
果胶广泛分布于水果、蔬菜等植物中，未成熟果 实内的原果胶在细胞壁内与纤维素和半纤维素结合 在一起[1]，不溶于水。当果实成熟时，原果胶变为可溶 性果胶[2]，能溶于水，但不溶于乙醇和乙醚。 新鲜水 果、植物的根、叶和绿茎中果胶含量特别丰富，由于 含有亲水基团，果胶与水有强大的结合力，是有力的 凝 胶 化 剂 ，广 泛 应 用 于 食 品 、制 药 和 化 妆 品 等 行 业 [3]。
70 mg·L-1 100 mg·L-1 1.5 1.2 0.9 0.6 0.3 0.0 0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1.0 咔唑-乙醇溶液加入量 Carbazole - ethanol solution/mL
2期
庞荣丽等: 水果及其制品中果胶含量的比色法测定条件优化
303
滴定终点，应用范围也受到限制，而 HPLC、GC 和流 动分析法都要求用特定的检测仪器， 并且运行成本 较高。目前，已有关于比色法对果胶含量进行测定的 研究报道[10-11]，但没有针对水果及其制品中果胶的测 定方法标准。 我们按照国家有关测定方法标准的要 求，对测定和显色条件进行了试验，以期为制定水果 及其制品中果胶物质的测定方法标准提供科学依 据。
冷却方式（室温自然冷却、自来水浴快速冷却）、显色
后稳定时间（0~105 min）等为显色条件试验。
1.4 准确度与精密度试验
以香蕉、猕猴桃、桃、甜樱桃、橙汁、葡萄汁等为
试材，对方法的准确度与精密度进行研究。
2 结果与分析
2.1 显色条件的选择 2.1.1 最佳吸收波长的确定 吸收波长在比色定量 方法中是最关键的。 按试验方法，在显色温度 85 ℃， 加热时间 20 min， 硫酸加入量 5.0 mL，0.1%咔唑无 水乙醇溶液用量 0.25 mL 条件下，在 360~700 nm 波 长内， 对果胶水解产物半乳糖醛酸在硫酸溶液中与 咔唑试剂发生缩合反应后， 生成的紫红色络合物进
mg·L-1；V—果胶沉淀 A 定容体积， 单位为 mL；m—
试样质量，单位为 g。
1.3 显色条件试验
设吸收波长 （360~700 nቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ）、0.1%咔唑-无水乙
醇 溶 液 用 量 （0.0~1.0 mL）、硫 酸 用 量 （1.0~9.0 mL）、
显色温度（40~100 ℃）、显色时加热时间（0~40 min）、
要从植物中分离出天然果胶难度大，因此，传统的果 胶定量测定都采用间接方法， 以测定果胶水解后生 成的各种产物的含量为基础，然后转换为果胶含量， 主要有重量法、容量法、比色法[4-6]。近年来，又陆续出 现 了 高 效 液 相 色 谱 法 （HPLC）[7]、 气 相 色 谱 法 （GC）[8]、 流动分析法[9]等。其中重量法操作繁冗、不稳定、回收 率低，容量法测定时，若样品中有颜色则不容易确定
收稿日期： 2011－07－13 接受日期: 2011－10－18 基金项目： 农业部 2006 年农业行业标准制修定项目（农财发[2006]64 号） 作者简介： 庞荣丽，女，副研究员，硕士。 Tel: 0371-66816453， E-mail: prlpang@163.com 觹 通讯作者。 Author for correspondence． Tel: 0371-65330995，E-mail: fangjinbao@caas.net.cn
管中。 另分别移取 1.0 mL 各个浓度的半乳糖醛酸标
准系列溶液于玻璃试管中。 于试样及标准溶液中各
加入 0.25 mL 0.1%咔唑-无水乙醇溶液，产生白色絮
状沉淀，不断摇动试管，再快速加入 5.0 mL 硫酸。 立
刻将试管放入 85 ℃水浴振荡器内加热 20 min，取出
后放入自来水浴中使之迅速冷却，在 1.5 h 时间内用
Abstract: In order to research the determination method of pectin content in fruits and derived products， coloring conditions of sulfuric acid-carbazole colorimetry including absorption wavelength， amount of carbazole-ethanol solution and sulfuric acid， temperature， reaction time， and stabilization time after coloring were optimized using galacturonic acid as standard substance. The results showed that the optimum coloring conditions were adding 0.25 mL 0.1% carbazole -ethanol solution and adding 5.0 mL sulfuric acid quickly to 1.0 mL filtrate， water bathing for 20 min at 85 ℃， cooling down quickly with running tape water bath， and measuring at 525 nm wavelength within 1.5 h after coloring. Under the conditions， it had wide linear range standard curve， good correlation， high precision and accuracy，and were in line with relevant standards. Key words: Pectin； Colorimetry； Sulfuric acid； Carbazole
摘 要：为研究水果及其制品中果胶测定方法，以半乳糖醛酸为标准物质，对硫酸-咔唑比色法测定水果及其制品中 果胶含量的比色条件如吸收波长、咔唑-无水乙醇溶液用量、硫酸用量、显色温度、显色时间、显色后稳定时间等进行 了优化和系统研究。 结果表明，最佳显色条件为在 1.0 mL 滤液中，加入 0.25 mL 0.1%咔唑-无水乙醇溶液，迅速加入 5.0 mL 硫酸，在 85 ℃水浴中加热 20 min，自来水浴中冷却，显色后 1.5 h 内在 525 nm 波长条件下测定。 在此条件下， 标准曲线线性范围广、相关性良好，精密度和准确度高，均符合相关标准要求。 关键词： 果胶； 比色法； 硫酸； 咔唑 中图分类号：S66 文献标志码：A 文章编号：1009－9980（2012）02－0302－06
果 树 学 报 2012，29（1）: 302~307 Journal of Fruit Science
水果及其制品中果胶含量的比色法测定条件优化
庞荣丽 1，张巧莲 2，郭琳琳 1，方金豹 1*，谢汉忠 1，李 君 1，罗 静 1，吴丰魁 1
（1 中国农业科学院郑州果树研究所/农业部果品及苗木质量监督检验测试中心（郑州），郑州 450009； 2 许昌职业技术学院园林园艺系，河南许昌 461000）
50 mg·L-1 90 mg·L-1
吸光度 A
波长 Warelength/nm 图 1 半乳糖醛酸吸收曲线 Fig. 1 Galacturonic acid absorption curve
吸光度 A 吸光度 A
304
果树
行吸收波长扫描，结果见图 1。 可以看出，50 mg·L-1 和 90 mg·L-1 的半乳糖醛酸溶液表现出一致的规律， 即与咔唑试剂发生缩合反应后， 生成的紫红色络合 物 在 394 nm 附 近 和 525 nm 附 近 处 各 有 1 个 吸 收 峰， 在 525 nm 附近吸光度最大。 因此本方法选择 λmax=525 nm 作为合适的工作波长。 2.1.2 咔唑无水乙醇溶液用量的确定 咔唑无水乙 醇溶液为显色剂，其加入量严重影响显色效果。按试 验方法，在显色温度 85 ℃，加热时间 20 min，硫酸加 入量 5.0 mL 条件下，改变 0.1%咔唑-无水乙醇溶液 用量，测其吸光度 A，重复 3 次，结果见图 2。 可以看 出，无论是 70 mg·L-1 还是 100 mg·L-1 的半乳糖醛酸 溶液， 在咔唑-无水乙醇溶液用量为 0.20~0.35 mL 时吸光度较大，用量为 0.25 mL 时吸光度最大。 故选 择咔唑-无水乙醇溶液最佳用量为 0.25 mL。
1.1 材料 标准物质：半乳糖醛酸（分析纯）。 试验样品：香蕉；猕猴桃；桃；甜樱桃；橙汁；葡萄 汁。 试剂：无水乙醇（优级纯）；氢氧化钠（分析纯）；
硫酸（优级纯，与咔唑-无水乙醇溶液不应产生颜色 反应）；咔唑（分析纯）。
仪器：水浴振荡器；离心机；分光光度计。 1.2 方法 1.2.1 方法原理 用无水乙醇沉淀试样中的果胶， 在碱性条件下，经水解后生成半乳糖醛酸，后者在硫 酸中与咔唑试剂发生缩合反应，生成紫红色络合物， 该络合物在 525 nm 处有最大吸收，其吸收值与果胶 含量成正比，以半乳糖醛酸为标准物质，标准曲线法 定量。 1.2.2 样品预处理 称取 1.0 g~5.0 g（精确至 0.001 g）试样于 50 mL 刻度离心管中，加入少量滤纸屑，再 加入 35 mL 约 75 ℃的无水乙醇， 在 85 ℃水浴振荡 器中加热 10 min，充分振荡。 冷却，再加无水乙醇使 总体积接近 50 mL， 在 4 000 r·min-1 的条件下离心 15 min，弃去上清液。 在 85 ℃水浴中用 67%乙醇溶 液洗涤沉淀，离心分离，弃去上清液，此步骤反复操 作，直至上清液中不再产生糖的穆立虚反应为止，保 留果胶沉淀 A。 同时做试剂空白试验。 1.2.3 果 胶 提 取 液 的 制 备 将 果 胶 沉 淀 A 用 去 离 子水全部洗入 100 mL 容量瓶中。加入 1.0 mol·L-1 氢 氧化钠溶液 5.0 mL，用水稀释至刻度，混匀。 至少放 置 15 min，并不时摇荡。 过滤，保留滤液 B，用于比色 测定。 1.2.4 标准系列配制 以 1 000 mg·L-1 的半乳糖醛 酸溶液为标准储备溶液， 制备系列质量浓度为 0.0、 20.0、40.0、60.0、80.0、100.0、120.0 mg·L -1 的 标 准 使 用溶液。 1.2.5 测定 移 取 1.0 mL 滤 液 B 于 25 mL 玻 璃 试
分光光度计在 525 nm 波长处测量其吸光度，绘制标
准曲线比较定量（按上述方法同时做空白试验，用空
白调 0）。
1.2.6 结果计算 样品中果胶含量以半乳糖醛酸质
量分数 ω 计，单位为 g·kg-1，按公式（1）进行计算：
ω= ρ×V
（1）
m×100
式中： ρ—滤液 B 中半乳糖醛酸质量浓度， 单位为
Study on the colorimetry determination conditions of pectin in fruits and derived products
PANG Rong-li1， ZHANG Qiao-lian2， GUO Lin-lin1， FANG Jin-bao1*， XIE Han-zhong1， LI Jun1， LUO Jing1， WU Feng-kui1
（1Zhengzhou Fruit Research Institute， CAAS/ Monitor & Test Center of Fruit and Nursery Stock Quality ， the Ministry of Agriculture， Zhengzhou， Henan 450009 China； 2Department of Landscape & Horticulture， Xuchang Vocational Technical College， Xuchang， Henan 461000 China）
果胶广泛分布于水果、蔬菜等植物中，未成熟果 实内的原果胶在细胞壁内与纤维素和半纤维素结合 在一起[1]，不溶于水。当果实成熟时，原果胶变为可溶 性果胶[2]，能溶于水，但不溶于乙醇和乙醚。 新鲜水 果、植物的根、叶和绿茎中果胶含量特别丰富，由于 含有亲水基团，果胶与水有强大的结合力，是有力的 凝 胶 化 剂 ，广 泛 应 用 于 食 品 、制 药 和 化 妆 品 等 行 业 [3]。
70 mg·L-1 100 mg·L-1 1.5 1.2 0.9 0.6 0.3 0.0 0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1.0 咔唑-乙醇溶液加入量 Carbazole - ethanol solution/mL
2期
庞荣丽等: 水果及其制品中果胶含量的比色法测定条件优化
303
滴定终点，应用范围也受到限制，而 HPLC、GC 和流 动分析法都要求用特定的检测仪器， 并且运行成本 较高。目前，已有关于比色法对果胶含量进行测定的 研究报道[10-11]，但没有针对水果及其制品中果胶的测 定方法标准。 我们按照国家有关测定方法标准的要 求，对测定和显色条件进行了试验，以期为制定水果 及其制品中果胶物质的测定方法标准提供科学依 据。
冷却方式（室温自然冷却、自来水浴快速冷却）、显色
后稳定时间（0~105 min）等为显色条件试验。
1.4 准确度与精密度试验
以香蕉、猕猴桃、桃、甜樱桃、橙汁、葡萄汁等为
试材，对方法的准确度与精密度进行研究。
2 结果与分析
2.1 显色条件的选择 2.1.1 最佳吸收波长的确定 吸收波长在比色定量 方法中是最关键的。 按试验方法，在显色温度 85 ℃， 加热时间 20 min， 硫酸加入量 5.0 mL，0.1%咔唑无 水乙醇溶液用量 0.25 mL 条件下，在 360~700 nm 波 长内， 对果胶水解产物半乳糖醛酸在硫酸溶液中与 咔唑试剂发生缩合反应后， 生成的紫红色络合物进
mg·L-1；V—果胶沉淀 A 定容体积， 单位为 mL；m—
试样质量，单位为 g。
1.3 显色条件试验
设吸收波长 （360~700 nቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ）、0.1%咔唑-无水乙
醇 溶 液 用 量 （0.0~1.0 mL）、硫 酸 用 量 （1.0~9.0 mL）、
显色温度（40~100 ℃）、显色时加热时间（0~40 min）、
要从植物中分离出天然果胶难度大，因此，传统的果 胶定量测定都采用间接方法， 以测定果胶水解后生 成的各种产物的含量为基础，然后转换为果胶含量， 主要有重量法、容量法、比色法[4-6]。近年来，又陆续出 现 了 高 效 液 相 色 谱 法 （HPLC）[7]、 气 相 色 谱 法 （GC）[8]、 流动分析法[9]等。其中重量法操作繁冗、不稳定、回收 率低，容量法测定时，若样品中有颜色则不容易确定
收稿日期： 2011－07－13 接受日期: 2011－10－18 基金项目： 农业部 2006 年农业行业标准制修定项目（农财发[2006]64 号） 作者简介： 庞荣丽，女，副研究员，硕士。 Tel: 0371-66816453， E-mail: prlpang@163.com 觹 通讯作者。 Author for correspondence． Tel: 0371-65330995，E-mail: fangjinbao@caas.net.cn
管中。 另分别移取 1.0 mL 各个浓度的半乳糖醛酸标
准系列溶液于玻璃试管中。 于试样及标准溶液中各
加入 0.25 mL 0.1%咔唑-无水乙醇溶液，产生白色絮
状沉淀，不断摇动试管，再快速加入 5.0 mL 硫酸。 立
刻将试管放入 85 ℃水浴振荡器内加热 20 min，取出
后放入自来水浴中使之迅速冷却，在 1.5 h 时间内用
Abstract: In order to research the determination method of pectin content in fruits and derived products， coloring conditions of sulfuric acid-carbazole colorimetry including absorption wavelength， amount of carbazole-ethanol solution and sulfuric acid， temperature， reaction time， and stabilization time after coloring were optimized using galacturonic acid as standard substance. The results showed that the optimum coloring conditions were adding 0.25 mL 0.1% carbazole -ethanol solution and adding 5.0 mL sulfuric acid quickly to 1.0 mL filtrate， water bathing for 20 min at 85 ℃， cooling down quickly with running tape water bath， and measuring at 525 nm wavelength within 1.5 h after coloring. Under the conditions， it had wide linear range standard curve， good correlation， high precision and accuracy，and were in line with relevant standards. Key words: Pectin； Colorimetry； Sulfuric acid； Carbazole
摘 要：为研究水果及其制品中果胶测定方法，以半乳糖醛酸为标准物质，对硫酸-咔唑比色法测定水果及其制品中 果胶含量的比色条件如吸收波长、咔唑-无水乙醇溶液用量、硫酸用量、显色温度、显色时间、显色后稳定时间等进行 了优化和系统研究。 结果表明，最佳显色条件为在 1.0 mL 滤液中，加入 0.25 mL 0.1%咔唑-无水乙醇溶液，迅速加入 5.0 mL 硫酸，在 85 ℃水浴中加热 20 min，自来水浴中冷却，显色后 1.5 h 内在 525 nm 波长条件下测定。 在此条件下， 标准曲线线性范围广、相关性良好，精密度和准确度高，均符合相关标准要求。 关键词： 果胶； 比色法； 硫酸； 咔唑 中图分类号：S66 文献标志码：A 文章编号：1009－9980（2012）02－0302－06
果 树 学 报 2012，29（1）: 302~307 Journal of Fruit Science
水果及其制品中果胶含量的比色法测定条件优化
庞荣丽 1，张巧莲 2，郭琳琳 1，方金豹 1*，谢汉忠 1，李 君 1，罗 静 1，吴丰魁 1
（1 中国农业科学院郑州果树研究所/农业部果品及苗木质量监督检验测试中心（郑州），郑州 450009； 2 许昌职业技术学院园林园艺系，河南许昌 461000）
50 mg·L-1 90 mg·L-1
吸光度 A
波长 Warelength/nm 图 1 半乳糖醛酸吸收曲线 Fig. 1 Galacturonic acid absorption curve
吸光度 A 吸光度 A
304
果树
行吸收波长扫描，结果见图 1。 可以看出，50 mg·L-1 和 90 mg·L-1 的半乳糖醛酸溶液表现出一致的规律， 即与咔唑试剂发生缩合反应后， 生成的紫红色络合 物 在 394 nm 附 近 和 525 nm 附 近 处 各 有 1 个 吸 收 峰， 在 525 nm 附近吸光度最大。 因此本方法选择 λmax=525 nm 作为合适的工作波长。 2.1.2 咔唑无水乙醇溶液用量的确定 咔唑无水乙 醇溶液为显色剂，其加入量严重影响显色效果。按试 验方法，在显色温度 85 ℃，加热时间 20 min，硫酸加 入量 5.0 mL 条件下，改变 0.1%咔唑-无水乙醇溶液 用量，测其吸光度 A，重复 3 次，结果见图 2。 可以看 出，无论是 70 mg·L-1 还是 100 mg·L-1 的半乳糖醛酸 溶液， 在咔唑-无水乙醇溶液用量为 0.20~0.35 mL 时吸光度较大，用量为 0.25 mL 时吸光度最大。 故选 择咔唑-无水乙醇溶液最佳用量为 0.25 mL。