胶体金试纸条的制备_图文
胶体金试纸条检测技术PPT课件
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胶体金标记的原理：胶体金在碱性条件下带 负电荷，与蛋白质分子的正电荷基团藉静电 吸引而形成牢固结合。
胶体金标记技术（Immunogold labeling technique）是以胶体金作为示踪标记物应 用于抗原抗体反应的一种新型免疫标记技术。
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二、胶体金试纸条诊断技术的原理
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H5亚型AIV尿 囊液阳性结果
阴性对照
H5ＡIV细胞 毒阳性结果 阴性对照
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最常用的是双抗夹心法检测抗原检测线质检线吸收垫样品垫硝酸纤维素膜连接垫胶体金垫底板测定时将试纸条下端浸入液体标本中下端吸水材料即吸取液体向上端移动流经c处时使干片上的免疫金复合物复溶若标本中有待测特异抗原即可与免疫金复合物中的抗体结合此抗原抗体复合物流至测试区即被固相抗体捕获在膜上显出红色反应线条t
胶体金试纸条诊断技术
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一、简 介
胶体金试纸条诊断是采用胶体金免疫层析 技术研制而成，该技术是90年代初在免疫渗 滤技术的基础上建立的一种简易快速的免疫 学检测技术，最先用于人绒毛膜促性腺激素 （ HCG） 的 测 定 和 乙 型 肝 炎 病 毒 表 面 抗 原 （HBsAg）等检测。
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胶体金颗粒对蛋白质有很强的吸附功 能，而不被坏其生物活性，可以与蛋白质 等（葡萄球菌A蛋白、免疫球蛋白）等非 共价结合，形成胶体金标记物。
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➢胶体金的质量判定标准
胶体金检测试纸生产工艺
胶体金检测试纸生产工艺本项目主要从事犬、猫传染病抗体胶体金检测试纸的生产，以微孔滤膜为固相载体，膜上包被已知抗体，待加入检测样本后，经毛细管虹吸作用或微孔滤膜的渗滤作用，使标本中的抗体与膜上包被的抗体或抗原结合，再通过胶体金标记物与复合物反应，可形成肉眼可见的红色产物。
目前应用最为广泛的胶体金免疫技术有侧向横流模式，又称金标免疫层析法（ImmUnOgoIdChrOmatograPhyASsay,GICA ）O金标免疫层析法试纸条主要是通过毛细管虹吸作用反应,它由以下几部分组成:样品垫、胶体金垫、NC 膜（硝酸纤维素膜）、吸水滤纸、以及PVC 底板，NC 膜（硝酸纤维素膜）上包括一条检测线（T 线）和一条质控线（C 线）一次层叠起来，如下图所示：图3 金标免疫层析法示意图在吸水材料的牵引下，待测抗原在试条上向上走，首先与金标抗体结合成抗原抗体复合物，抗原抗体复合物上行到检测线时，被测抗原的另一结合位点与包被在此处的单抗结合，形成两个抗体结合一个抗原（双抗体夹心）的金标复合物，因有金颗粒在此沉积，故T 线显红色。
未结合抗原的金标抗体上行到C 线时，与“抗金标抗体”结合，所以C 线也显红色。
检测结果判定：T 线与C 线均显线，表明检测结果为阳性；C 线显线，T 线不显，表明结果为阴性。
若C 线不显线，则检测结果无效。
工艺流程如下所示：NC«（跚咬纤假素膜）PVC 底板 测试线（TtK 1）M 析方向样品稀释液噪声：N ；一般固体废物：不合格品(S1)；废防粘纸(S2)；边角料(S3)；废包装物(S4)；危险废物：废一次性滴管(S5)玻璃器具清洗废水(S6)；玻璃器具淋洗废水(S7)；超声波清洗废水(S8)、超声波冲洗废水(S9)o图4胶体金检测试纸生产过程示意图工艺流程简述： (1)检测：外购硝酸纤维素膜、金结合垫、吸水垫、样品垫均人工目视进行检验。
①硝酸纤维素膜：人工目视干燥后的包被膜表面应洁净、无污染、破损等，如有，需用笔标出。
胶体金的制备及其应用PPT课件
金标记在电镜水平的应用，主要方法包括： 包埋前染色、包埋后染色、免疫负染色、双标记 技术和原位杂交技术等。
实验证明，该法样本用量少、检测速度快、 对比明显、操作简单、敏感性和特异性高，既可 用于抗原检测，也可用于抗体检测，因此，可同 时适用于科研和诊断。
• 目前电镜水平的免疫金染色(IGS)，光镜水平的 免疫金银染色(IGSS)，以及肉眼水平的斑点免疫 金染色技术日益成为科学研究和临床诊断的有力 工具
免疫胶体金技术的基本原理
• 免疫金标记技术(Immunogold labelling techique) 主要利用了金颗粒具有高电子密度
的特性，在金标蛋白结合处，在显微镜下可见黑 褐色颗粒，当这些标记物在相应的配体处大量聚 集时，肉眼可见红色或粉红色斑点，因而用于定 性或半定量的快速免疫检测方法中，这一反应也 可以通过银颗粒的沉积被放大，称之为免疫金银 染色。
主要内容
• 概述 • 免疫胶体金技术的基本原理 • 胶体金的特性 • 胶体金的制备方法 • 胶体金的鉴定和保存 • 免疫胶体金制备和保存 • 免疫胶体金应用
概述
• 胶体金溶液：胶体金溶液是指分散相粒子直径
在l—150 nm之间的金溶胶，属于多相不均匀体系， 颜色呈桔红色到紫红色。
• 1971年胶体金作为标记物开始用于免疫组织化 学,Faulk等应用电镜免疫胶体金染色法(IGS)观察 沙门氏菌,此后他们把胶体金与多种蛋白质结合；
下述标记步骤最为常见：
• ①用0.1mol/L K2CO3或0.1mol/L HCl调节金溶胶至所需pH( 标记ＳＰＡ时调到pH6.0)。
链霉素胶体金免疫层析试纸条的技术报告
链霉素胶体金免疫层析试纸条的技术报告1 胶体金的制备1.1玻璃器皿的准备玻璃器皿表面的少量污染会干扰金颗粒的生成，一切玻璃容器应绝对清洁，用前经过酸洗，硅化。
硅化过程一般是将玻璃容器浸泡于含5％二氯二甲硅烷的氯仿溶液中1min，室温干燥后蒸馏水冲洗，再干燥备用。
专用的玻璃器皿以第一次生成的胶体金稳定其表面，弃去后以双蒸馏水淋洗，可代替硅化处理。
将玻璃器皿用酸液浸泡72小时后，取出，用洗洁精洗涤和大量自来水冲洗，蒸馏水浸泡24h后用去离子水冲洗三次，37℃温箱烘干后备用。
1.2 柠檬酸三钠还原法制备胶体金溶液在胶体金免疫层析试验中，检测信号是由于金颗粒在检测线或质控线上聚集而成，所以如果金颗粒太小就不能产生足够的颜色信号，如果太大又会遇到空间位阻问题。
空间位阻可以阻止小分子蛋白质接近金颗粒的zeta电位，例如IgG 分子(160 000 DaLtons)大约8nm，约有4nm可以与金颗粒的表面结合，其最适的标记金颗粒为40nm，而对小分子抗原来说，可以使用20nm的胶体金颗粒进行标记。
取0.01％氯金酸水溶液100mL用恒温电磁搅拌器加热至沸腾，持续搅拌的情况下加入1％柠檬酸三钠水溶液3.5mL，继续搅拌加热10min，溶液呈透亮的红色。
室温冷却，用去离子水恢复到原体积，4℃保存。
1.3 胶体金的质量鉴定1.3.1 肉眼观察用肉眼观察制备的胶体金，其颜色为酒红色、均匀度较好无杂质、透明度较高。
1.3.2 紫外扫描鉴定取冷却后的胶体金溶液进行400～600nm紫外扫描，确定最大吸收峰波长，观察最大吸收峰的峰形、峰宽。
紫外扫描的最大吸收峰波长为520nm，根据回归方程Y= 0. 4271X + 514. 56计算得到胶体金颗粒粒径为12.74nm。
由图谱可以看出最大吸收峰的峰宽较小,说明胶体金颗粒分布比较均匀1.3.3 透射电镜鉴定透射电镜下观察胶体金颗粒的大小是否均匀一致，有无椭圆形及多角形。
拍片放大后测量胶体金颗粒直径大小，取多个点计算胶体金颗粒的平均直径。
胶体金介绍ppt课件-PPT课件
3、PVC板 PVC板是用来承载膜、金子、 辅料等成分的底板，它是试纸 条的骨架。 PVC板的标准：板上的粘性 要适中；板的长度要合乎规格； 板的硬度也要达到一定的标准。
评价一个试剂的标准
评价一个试剂好坏的标准有： 1、灵敏度 2、特异性 3、背景 4、吸样和上样 5、和对照试剂比较 6、市场反馈 7、检验机构的评价
结果判读
怀孕
与常规诊断方法相比
优点 快速：全部检测过程仅需 3-10分钟。 简便：不需其它任何仪器设备，操作也极其简单，无需专 业人员，携带方便，可随时随地进行。 廉价：单个测试条成本极低 可单份检测：对标本既能成批检测，又可单份检测，可立 刻拿到结果，不必等待。 稳定性好：金标试剂稳定，可长期保存。 检测标本种类多：既可用于查血，又可用于检尿或唾液， 因而适合各种检查 缺点 定量问题 灵敏度问题
试纸条组成结构
胶体金垫 样品垫 控制线（C线） 吸水滤纸
PVC底板
层析方向 测试线 （T线）
NC膜（硝酸纤维素膜）
胶体金层析法一般原理介绍
（双抗体夹心）
（以HCG检测为例）
视频
早早孕产品形式
图片
形式
试纸条
卡型
笔型
电子验孕笔
价格
最经济
3-5元
5-10元
>$5.0
（国外价格）
使用方法
1.试纸：将试纸条标： “MAX”一端浸入尿液，尿液液面请勿 超过标志线，待尿液爬至观察区后取出试纸条平放。3-5分钟 观察结果，10分钟后无效。 2.用吸管吸取尿液，加入4滴到检测卡的加样孔中，3-5分钟观察 结果，10分钟后无效。 3.将尿液滴加到试纸上或直接淋在检测笔的吸尿棒上，尿液爬上 后平放，10分钟观察。
胶体金试纸条检测技术ppt
测定
过剩的免疫金复合物继续前行， 至 参 照 区 与 固 相 抗 小 鼠 IgG 结 合（免疫金复合物中的单克隆 抗 体 为 小 鼠 IgG）， 而 显出红 色质控线条（R）。
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测定
阴性标本则无反应线条，而仅显示质控线条。
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胶体金快速诊断技术的特点
简捷快速：操作简单，一般只要5-10min 就会出 结果，而其它方法如ELISA需要1-2h，PCR 需要 时间更长。
H5亚型AIV尿 囊液阳性结果
阴性对照
H5ＡIV细胞 毒阳性结果 阴性对照
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➢基础金核 ➢双离子 内层负离子（AuC12－） zeta电位
外层离子层 H+分散在胶体间的溶液中 zeta电位可以使胶体金颗粒之间相互排斥，以维持 胶体金的稳定状态。
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胶体金颗粒对蛋白质有很强的吸附功 能，而不被坏其生物活性，可以与蛋白质 等（葡萄球菌A蛋白、免疫球蛋白）等非 共价结合，形成胶体金标记物。
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二、胶体金试纸条诊断技术的原理
以硝酸纤维素膜为载体，利用了微孔膜的毛细 血管作用，滴加在膜条一端的液体慢慢向另一端 渗移，通过抗原抗体结合，并利用胶体金呈现颜 色（红色）反应，检测抗原/抗体。有三种反应模 式：夹心法，间接法，竞争抑制法。
最常用的是双抗夹心法检测抗原
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胶体金试纸条示意图
样品垫
连接垫 （胶体金垫）
结果易于判定：阴、阳性呈色很明显，肉眼很容易 判断。
特异性好：因为该技术大多用单克隆抗体标记，这 决定了它具有很好的特异性。
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胶体金免疫试纸条工艺流程
胶体金免疫试纸条工艺流程下载温馨提示:该文档是我店铺精心编制而成，希望大家下载以后，能够帮助大家解决实际的问题。
文档下载后可定制随意修改，请根据实际需要进行相应的调整和使用，谢谢!并且，本店铺为大家提供各种各样类型的实用资料，如教育随笔、日记赏析、句子摘抄、古诗大全、经典美文、话题作文、工作总结、词语解析、文案摘录、其他资料等等，如想了解不同资料格式和写法，敬请关注!Download tips: This document is carefully compiled by theeditor. I hope that after you download them,they can help yousolve practical problems. The document can be customized andmodified after downloading,please adjust and use it according toactual needs, thank you!In addition, our shop provides you with various types ofpractical materials,such as educational essays, diaryappreciation,sentence excerpts,ancient poems,classic articles,topic composition,work summary,word parsing,copy excerpts,other materials and so on,want to know different data formats andwriting methods,please pay attention!胶体金免疫试纸条工艺流程一、准备工作阶段。
在开展胶体金免疫试纸条的制作之前，需要进行充分的准备。
胶体金试纸条检测技术PPT优秀版
质检线
吸收垫
背衬 （底板）
检测线Biblioteka 硝酸纤维素膜测定测定时将试纸条下端浸入液体 标本中，下端吸水材料即吸取 液体向上端移动，流经C处时使 干片上的免疫金复合物复溶， 并带动其向膜条渗移。
测定
若 标 本 中 有 待 测 特 异 抗 原 ， 即 可与免疫金复合物中的抗体结 合，此抗原抗体复合物流至测 试区即被固相抗体捕获，在膜 上显出红色反应线条（T）。
胶体金试纸条检测技术
一、简 介
胶体金试纸条诊断是采用胶体金免疫层析 技术研制而成，该技术是90年代初在免疫渗 滤技术的基础上建立的一种简易快速的免疫 学检测技术，最先用于人绒毛膜促性腺激素 （ HCG） 的 测 定 和 乙 型 肝 炎 病 毒 表 面 抗 原 （HBsAg）等检测。
胶 体 金 （ Colloidal gold） 是 氯 金 酸
病毒性疾病：传染性法氏囊病、禽流感、新城疫、 胶体金试纸条诊断是采用胶体金免疫层析技术研制而成，该技术是90年代初在免疫渗滤技术的基础上建立的一种简易快速的免疫学检测技术，最先用于人绒毛膜促性腺激素（HCG）
的测定和乙型肝炎病毒表面抗原（HBsAg）等检测。 病毒性疾病：传染性法氏囊病、禽流感、新城疫、犬细小病毒、猪瘟等。
➢基础金核
➢双离子 内层负离子（AuC12－） zeta电位 外层离子层 H+分散在胶体间的溶液中
zeta电位可以使胶体金颗粒之间相互排斥，以维持 胶体金的稳定状态。
胶体金颗粒对蛋白质有很强的吸附功
能，而不被坏其生物活性，可以与蛋白质 等（葡萄球菌A蛋白、免疫球蛋白）等非 共价结合，形成胶体金标记物。
结果易于判定：阴、阳性呈色很明显，肉眼很容易 判断。
特异性好：因为该技术大多用单克隆抗体标记，这 决定了它具有很好的特异性。
PEDV胶体金试纸条制备
PEDV胶体金试纸条制备胶体金(colloidal gold)是由氯金酸(HAuCl4)在还原剂等作用下，聚合成特定大小的金颗粒，并由于静电作用成为一种稳定的胶体状态，利用它在碱性环境下带负电荷的性质，与蛋白质分子的正电荷基团相互吸引而形成牢固结合，可以将胶体金与抗体蛋白以及其他一些蛋白相结合，进行示踪研究。
目前已成为继荧光素、放射性同位素和酶之后，在免疫标记技术中较为常用的一种非放射性示踪剂。
1971年，Faulk和Taylor首先报道了将胶体金与抗体结合，应用于电镜水平的免疫细胞化学研究。
1974年，Romano等用胶体金标记抗球蛋白抗体，建立间接免疫金染色法。
之后，胶体金作为以后总新型免疫标记技术发展很快。
1978年，Geohegan等将胶体金标记抗体用于普通光镜下检测B淋巴细胞表面膜免疫球蛋白，建立了光镜水平的免疫金染色(immunogold staining，IGS)，但是所需的胶体金颗粒必须大于20nm，并且标记物浓度要高，才能获得阳性结果。
1981年Danscher等用银显影方法增强了金颗粒的可见度，并提高了灵敏度。
1983年Holgate等将免疫金染色与银显影技术相结合，称之为免疫金银染色法(immunogold silver staining，IGSS)。
由于IGS和IGSS两种方法具有试剂制备简便，特异性强、灵敏度高、应用范围广，并可以用于双重和多重标记等特点，被广泛应用于医学和细胞生物学研究领域，是目前免疫组织化学技术中常用的敏感方法之一。
近年来胶体金标记技术进一步发展应用于免疫转印、流式细胞术、液相免疫测定、固相斑点金／银染色(dot IGS／IGSS)以及斑点金免疫渗滤测定法(dot immunogold filtration assay，DIGFA)等多种标记免疫检测方法。
本实验中应用柠檬酸钠还原法制备颗粒大小为20nm．30nm大小的胶体金，用于与制备纯化的抗体相结合，为制备检测·猪流行性下痢(PEDv)病毒试纸条做准备。
胶体金试纸条检测技术PPT课件
细菌性疾病：霍乱弧菌、类鼻疽。
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胶体金试纸条示意图
样品垫
连接垫 （胶体金垫）
质检线
吸收垫
背衬 （底板）
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硝酸纤维素膜
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测定
测定时将试纸条下端浸入液体 标本中，下端吸水材料即吸取 液体向上端移动，流经C处时使 干片上的免疫金复合物复溶， 并带动其向膜条渗移。
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测定
若 标 本 中 有 待 测 特 异 抗 原 ， 即 可与免疫金复合物中的抗体结 合，此抗原抗体复合物流至测 试区即被固相抗体捕获，在膜 上显出红色反应线条（T）。
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测定
过剩的免疫金复合物继续前行， 至 参 照 区 与 固 相 抗 小 鼠 IgG 结 合（免疫金复合物中的单克隆 抗 体 为 小 鼠 IgG）， 而 显出红 色质控线条（R）。
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测定
阴性标本则无反应线条，而仅显示质控线条。
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胶体金快速诊断技术的特点
✓质量差的胶体金：溶液呈紫色，大小不一，形状 各异。
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胶体金标记的原理：胶体金在碱性条件下带 负电荷，与蛋白质分子的正电荷基团藉静电 吸引而形成牢固结合。
胶体金免疫试纸条工艺流程
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胶体金试纸条原理
胶体金试纸条原理胶体金试纸条（Colloidal Gold Test Strip）是一种简单、快速、准确的免疫学检测方法，广泛应用于生物医学研究、医学诊断、环境监测、食品安全等领域。
本文主要介绍胶体金试纸条的原理、制备及应用。
一、原理胶体金试纸条原理是基于金纳米颗粒与抗原或抗体的特异性结合作用。
金纳米颗粒在特定条件下呈现紫红色，具有很强的表面等离子体共振吸收波长。
当金纳米颗粒与特异抗原或抗体结合时，其颜色由紫红色变为红色或蓝色，颜色的变化与特异性结合反应形成的复合物的形态、数量有关，可以通过肉眼直接观察到。
二、制备制备胶体金试纸条需要先制备金纳米颗粒溶液，然后将其涂在滤纸或其他纸张上，并固定相应的抗原或抗体作为检测指针。
具体步骤如下：1. 制备金纳米颗粒溶液制备金纳米颗粒溶液的方法有多种，其中较为简单的方法是还原法。
将1 mL的氯金酸钠（10 mM）加入50 mL的去离子水中，搅拌均匀。
将10 mL的氢氟酸（1 mM）加入到氯金酸钠溶液中，并在室温下搅拌1分钟。
加入150 µL的氢氨水（10 mM），搅拌后黄色溶液转变为红紫色，表示金纳米颗粒合成成功。
2. 准备检测纸条将金纳米颗粒溶液用滴管或其他方法均匀地涂在滤纸或其他纸张上，并干燥20分钟。
随后，用荧光素偶联抗体或其他特异性指示剂涂抹到纸条上作为检测指针。
三、应用胶体金试纸条可以用于检测各种生物分子，例如细菌、病毒、抗体、癌细胞、DNA、RNA等，以及药物和毒性物质。
其应用领域包括：1. 生物医学研究胶体金试纸条可以用于研究基因检测、蛋白质检测、药物筛选等领域。
2. 医学诊断胶体金试纸条可以用于一些快速筛查、诊断疾病的场合，比如检测患者的生物样本中是否有某种病原菌，或者病人是否感染某种病毒等。
3. 环境监测胶体金试纸条可以用于监测环境中的各种有害物质，如重金属、农药、酸雨等。
4. 食品安全胶体金试纸条可以检测食品中添加的国家规定禁止使用的物质，如兽药、农药等。
PCT胶体金试纸制备及其原理
2016/6/28
二、胶体金的特性
1、胶体性质
金颗粒直径多在1～100nm，稳定、均匀、呈单一分散的状态悬浮在溶液中；胶体 金对电解质的敏感性，易使胶体金的稳定状态被破坏，使单一分散的胶体金颗粒聚集 成大颗粒，从溶液中沉淀下来。某些蛋白质等大分子物质具有保护胶体金、增强胶体 金稳定性的作用。
2016/6/28
Marker Procalcitonin Interleukin 6 White cell count Endotoxin C-reactive protein HLA-DR Protein C IL-10 HMG-1
Diagnosis +++ ++ ++ ++ ++ + + + ++
Prognosis +++ +++ + ++ ++ +++ ++ ++ ++
2016/6/28
6、配置胶体金
准备的试剂：1% 氯金酸，1%柠檬酸三钠（现配现用），超纯水
步骤：
1、取100ml超纯水于磁力搅拌器上加热至80-90℃； 2、加入2ml氯金酸溶液继续加热至沸腾（保持沸腾10s）（注意：当氯金酸溶液加 入后不可以再用金属温度传感器，以防止损坏传感器，污染溶液）； 3、快速加入（取1%柠檬酸三钠溶液3ml，超纯水定容到10ml）上述烧瓶中，同时 搅拌迅速，使其充分接触反应，继续加热，直至溶液沸腾，将加热温度降至105110 ℃（待确认）保持沸腾反应10min； 4、停止加热，将烧瓶移至避光处，自然冷却至室温。（注意：整个过程都是避光 的）
胶体金试纸条的制备 ppt课件
小的金颗粒。
胶体金合成
制备胶体金试纸条常用的一般是柠檬酸三钠还原法
» 将100ml的0.1％H2AuCl4加入200ml的锥形瓶中，并 将其置于搅拌电热炉上，加入一个磁力条并将溶液 加热至沸腾。
注意事项
（1）氯金酸易潮解，应干燥、避光保存。 （2）氯金酸对金属有强烈的腐蚀性，因此在配制 氯金酸水溶液时，不应使用金属药匙称量氯金酸。
（3）用于制备胶体金的蒸馏水应是双蒸馏水或三 蒸馏水，或者是高质量的去离子水。
（4）是以制备胶体金的玻璃容器必须是绝对清洁 的，用前应先经酸洗并用蒸馏水冲净。最好是经 硅化处理的，硅化方法可用5％二氯甲硅烷的氯仿 溶液浸泡数分钟，用蒸馏水冲净后干燥备用。
（2）目测法：以目测法确定胶体金与待标记蛋白
质用量比例，将标记的蛋白质逐级稀释后（由 5μg～45μg另设对照管），各取等体积顺序加入 一系列装有1ml胶体金的试管中，5min后，在上述 各管内分别加入0.1ml 10%氯化钠，依表顺序进行。
发现 1、2 号管出现黑色沉淀且红色全部褪去，3 号管虽 然能保持红色，但是管底也出现了一定量的黑色沉淀，而
» 向沸腾的溶液中加入1.5ml的0.1％二合水柠檬酸三 钠，Na3C6H5O7.2H2O
» 当获得深红颜色的溶液时停止加热
胶体金的合成
胶体金 1％柠檬酸 粒径 三钠加入量 （nm） （ml）*
16
2.00
24.5 1.50
41
1.00
71.5 0.70
呈色
橙色 橙红 红色 紫色
λmax
518nm 522nm 525nm 535nm
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最终结合（McAb）
• 取100ml金溶液，调整pH值至8.2 • 调整滤过和离心的抗体溶液（0.1μg/μl）至
pH8.2 • 当金溶液在快速搅拌时要逐滴加入定量的
抗体（蛋白最小浓度量加10%即蛋白稳定 量），大约5分钟加完 • 在金标溶液中加入10ml滤过的10％BSA至 终浓度为1%，并轻轻搅拌10分钟。
• 在兽医疫病检测中的应用
Bhakar等应用相应的单抗标金，建立了阿米巴虫抗原检测方法。Kameyama 等以牛病腹泻病毒的 NS3 蛋白制备单克隆抗体，并用胶体金标记单抗制备胶 体金试纸，用于牛病毒性腹泻抗原的检测。Kang等以同样方式建立了猪轮状 病毒胶体金抗原检测方法，并用于腹泻仔猪轮状病毒的鉴别诊断。Li等应用 实验室制备的两种 PRRSV 单抗，以双单抗夹心的模式，组装成 PRRSV 抗 原检测试纸，作为 PRRSV 感染的诊断工具。
135s一般用在双抗体夹心法，180s一般用在竞争法.
吸收垫(Absorbent Pad)：
提供高吸收率、高容量以及相对稳定吸收率的吸 收纸；
吸收纸的作用： 主要表现在控制样品的流速，促进虹吸作用以及 使试剂跨过膜而不仅仅移到膜上。
片材：
不干胶塑料衬底，片材的质量很大程度上影响了 产品的货架期。
• ⑤乙醇—超声波还原法(1980年)可合成6～10nm大小的金 颗粒；
• ⑥硼氢化钠还原法(1982年)可合成3—17nm大小的金颗粒 ；
• ⑦单宁酸—柠檬酸三钠还原法(1985年)可合成3～17nm大 小的金颗粒。
胶体金合成
制备胶体金试纸条常用的一般是柠檬酸三钠还原法
» 将100ml的0.1％H2AuCl4加入200ml的锥形瓶中，并 将其置于搅拌电热炉上，加入一个磁力条并将溶液 加热至沸腾。
注意事项
（1）氯金酸易潮解，应干燥、避光保存。 （2）氯金酸对金属有强烈的腐蚀性，因此在配制 氯金酸水溶液时，不应使用金属药匙称量氯金酸 。 （3）用于制备胶体金的蒸馏水应是双蒸馏水或三 蒸馏水，或者是高质量的去离子水。 （4）是以制备胶体金的玻璃容器必须是绝对清洁 的，用前应先经酸洗并用蒸馏水冲净。最好是经 硅化处理的，硅化方法可用5％二氯甲硅烷的氯仿 溶液浸泡数分钟，用蒸馏水冲净后干燥备用。
免疫胶体金技术的特点
优点：
• 检测方法简单而快速，数分钟即可得出结果； • 不需仪器设备，操作人员不需特殊训练； • 试剂稳定，适用于单份测定； • 无污染； • GICA的特点是单一试剂，一步操作。小型实验室
即有条件开发生产。 • 干燥包装的试剂可在室温保存一年以上。
成为目前“病人身边检验”（point-of-care testing，POCT） 中广为应用的方法。
» 向沸腾的溶液中加入1.5ml的0.1％二合水柠檬酸三 钠，Na3C6H5O7.2H2O
» 当获得深红颜色的溶液时停止加热
胶体金的合成
胶体金 粒径（ nm） 16
24.5
41
71.5
1％柠檬酸 三钠加入量 （ml）* 2.00
1.50
1.00
0.70
呈色
橙色 橙红 红色 紫色
λmax
518nm 522nm 525nm 535nm
合，用直接免疫细胞化学技术检测沙门菌的表面抗原。
1974------实现间接免疫金染色法 Romano将胶体金标记到马抗人的IgG上，实现了
间接免疫金染色法
胶体金技术的种类及优点
快速免疫金渗滤法(immuogold filtration assay ,IGFA) 即穿流式(flow through)的固相膜免疫测定。 主要由两部分组成：膜渗滤装置和标记结合物。前
结合垫(Conjugate pad)：
玻璃纤维、聚酯膜、纤维素滤纸、无纺布等多种材 质，多种规格，批间稳定。
结合垫的作用主要为：
- 吸附一定量的金标结合物颗粒； - 吸附并持续不断的将样品转移到NC膜上； - 保持金标结合物颗粒的稳定性； - 保证金标结合物颗粒定量完全释放等。
玻璃纤维膜/聚酯纤维膜
胶体金免疫层析试纸模式
• 双抗体夹心模式 疫病抗原检测
• 竞争模式 小分子物质检测
• SPA/蛋白G模式 疫病抗体检测
双抗体夹心模式
判定 阳性 阴性
检测线 质控线 显色 显色
不显色 显色
竞争模式
判定 阳性 阴性
检测线 质控线 不显色 显色
显色 显色
SPA/G蛋白模式
判定 阳性 阴性
检测线 质控线 显色 显色
纯化
超速离心法、凝胶过滤法
几种免疫金探针离心纯化条件
胶体金颗粒 /nm 5 10 15 20 10
pH 标记蛋白质 离心力/g 时件/min
9.0 羊抗人IgG 45000
45
8.2
McAb
45000
30
6.5 链霉亲和素 120000
45
6.0
SPA
120000
30
9.0 羊抗兔IgG 120000
60
胶体金免疫层析法试剂的组成
样品垫(Sample pad)：
玻璃纤维、聚酯膜、纤维素滤纸、无纺布等多种材 质，多种规格，批间稳定。
样品垫的作用：
减缓样品渗透速度，有利于样品在结合垫上均匀分布 ；
去除样品中杂质颗粒； 调节样品液pH值或粘度等。
样品垫可使用化学物质进行浸渍处理，从而减少样本差 异，提高试验的灵敏度。通常可以将洗涤剂、粘性增强剂 、阻滞剂及盐渗入样本垫然后加以干燥，该工艺可避免使 用复杂辨识剂/追迹缓冲液的麻烦，使检测一步完成。
不显色 显色
胶体金免疫层析试纸质量检测
胶体金免疫层析试纸的应用
• 在兽药残留检测中的应用
Zhang等用克伦特罗制备的单克隆抗体标记胶体金作为检测探针，然后将偶 联 BSA的克伦特罗作为 T 线，以竞争模式组装成试纸，用于样品的克伦特罗 残留检测，为我国食品安全检测提供了有效的工具。之后 Zhang 的团队采用 同样的模式制备并组装成功两类兽药残留检测试纸，分别为磺胺间甲氧嘧啶 、恩诺沙星残留检测胶体金免疫层析试纸，为我国兽药残留快速检测技术的 发展奠定了基础。
胶体金试纸条的制备_图文.ppt
目录
1
胶体金技术的发展
2
胶体金技术的种类
3
胶体金的合成
4
胶体金的标记与纯化
5 胶体金免疫层析法试剂的组成
6 胶体金免疫层析试纸的检测模式
7 胶体金免疫层析试纸的应用
胶体金免疫层析（Gold Immune – Chromatographic Assay, GICA）技术是结合了胶体金技术和免疫层析技术 发展而来的，其本质为一种固相反应的 ELISA,并用胶体 金来代替底物显色。
定其pH即可.
常见蛋白标记条件
最小蛋白用量的确定
（1）光电比色法：制备一系列不
同浓度的等体积蛋白质溶液（1ml） ，分别加入5ml胶体金中，迅速混匀 ，然后，各加入1ml 10% NaCl溶液 ，摇匀，静置5min后测各管。根据 胶体金颗粒的大小，OD在520～ 580nm之间测定，以OD值为纵坐标 ，蛋白质用量为横坐标作一曲线， 取曲线最先与横轴相接近的那一点 处的蛋白质用量为最适稳定量。图 中10nm的胶体金溶液中蛋白质的最 适稳定量为45μ原法(1905年)可合成3nm左右大小的金颗粒； • ②白磷还原法(1925年)经改良后，可合成5～12nm大小的
金颗粒；
• ③抗坏血酸还原法(1958年)可合成6～13nm大小的金颗粒 ；
• ④柠檬酸三钠还原法(1973年)可合成5nm、15nm、30nm 、60nm大小的金颗粒；
者为一塑料小盒，其中填满吸水性物质，面上紧贴放置一 片吸附有抗体(以双抗体夹心法测抗原为例)的硝酸纤维膜 ，标记结合物为免疫金。
A：金标记抗体 B：标本中的抗原 C：包被抗体 D：NC膜 E：吸水材料 F：塑料盒
免疫层析法( immunochromatogra-phy，
ICA)
是继IGFA之后发展起来的另一种固相膜免疫测定 ，与IGFA利用微局限性膜的过滤性能不同，免疫层析 法中滴加在膜一端的样品溶液受膜的毛细管作用(基于 层析作用的横流 （lateral flow） )向另一端移动。移动 过程中被分析物与固定在膜上某一区域的受体(抗原或 者抗体)结合而被固相化，无关物质则越过该区域而被 分离，然后通过标记物显色来判定试验结果，以胶体 金为标记物的实验称为胶体金免疫层析试验。
蛋白通常带有多种电荷，当蛋白 带正电时，能与胶体金所带的负 电荷相互作用；而蛋白中的疏水 氨基酸能通过疏水作用将蛋白结 合至金颗粒表面；有些蛋白则可 通过半胱氨酸的巯基与金颗粒共 轭连接。
金标样本程序
将胶体金调整至正确的pH值 确定最小蛋白含量 最终结合（标记） 纯化
胶体金调整正确的pH值
不足：
金免疫测定中应用的是单份试剂，难于进行质量控 制。即使是同一批生产的试剂，也很难保证每个试剂 的同一性。因此金免疫测定一般只能用于定性试验。 其定量检测和灵敏度的提高还有赖于新原料和新材料 的开发与应用。
最近由于原料的精选和制作工艺的改进，已能 制备出可用于定量测定的GICA试剂。Roche公司生 产的用于急性心肌梗死诊断的肌钙蛋白和肌红蛋白的 GICA试剂和匹配的简便测读器Cardiac Reader，其 精密度和准确性均符合定量测定要求。
免疫胶体金技术 是以胶体金作为示踪标志物应用于抗原抗体的一种新型
的免疫标记技术。
胶体金标记 实质上是蛋白质等高分子被吸附到胶体金颗粒表面的包
被过程。
胶体金技术的发展
1939-----雏形 Kausche等把烟草花叶病毒吸附到金颗粒上在电
子显微镜下观察金离子呈高电子密度。