第三章放射性示踪的标记技术解析

2．3H标记化合物
• 在生物学示踪实验中，氚的重要性仅次于14C 。氚标记化 合物有许多突出的特点： • （1）氚的半衰期为12.35a，故有充裕的时间制备标记化 合物和从事示踪研究。 • （2）氚的比活度高，可达1077.44GBq／毫克分子，比较 容易获得高比活度的标记化合物。并可借助核磁共振仪鉴 定3H在标记物中的标记结构。 • （3）氚为弱β-辐射体（Emax=18.4keV），射线能量低， 射程短，操作时易于防护，在放射自显影中具有很好的分 辨率。 • （4）氚的丰度高，标记化合物的制备方法较14C容易。一 些难以用14C标记的化合物，如肽类、蛋白质等，常可用 3H标记。此外，还能作为碳骨架结构的示踪剂，这点是 14C所不及的。
第三章 放射性示踪的标记技术
杨占山
第一节 放射性标记的基本知识
• 天然放射性核素，半衰期比较长，比活度 较低，分布分散而且品种有限 。 • 人工放射性核素，可用核反应堆、加速器 和核素发生器生产，其原始状态通常都是 无机盐类。例如Ba14CO3，NaH232PO4， 45CaCl ，59FeCl3 2 • 14C、3H、32P、35S和125I等作示踪原子，并 且要把它们做成与体内物质相应的有机化 合物而开展示踪研究。
（1）14C标记化合物的有机合成
• 以Ba 14CO3为起始物制备14C的标记化合物 可通过以下三条途径： • ① 通过14CO2合成 • ② 通过14C–氰化钠（Na14CN）合成 • ③ 通过14CH≡14CH合成
（2）14C标记化合物的生物合成
• 将某一植物放在充满14CO2的密闭室里， 用强光照射时，叶子进行光合作用。几个 小时以后，叶子中已合成了标记的葡萄糖、 淀粉和其他化学成分。 • 如果植物的量足够多，根据需要可进行分 离提取，有些标记的药物就是这样制备出 来的。 • 用这种生物合成的方法，可以准确地制备 某种具有生理活性的旋光异构体。
1．放射性碳的标记化合物
• 由反应堆生产的14C为Ba14CO3，放射性碳的标记 常从最简单的化合物（如11CO2或Ba 14CO3）为 原料，先制备出一批基本的“钥匙”化合物，然 后逐步合成得到更复杂的所需的产品。 • 14C标记化合物制备工艺复杂，要求设备条件高和 防护措施全。一般放射性实验室从事14C标记有一 定的困难。 • 14C标记化合物的制备方法，基本上分为化学合成 法、生物合成法和辐射合成法三类。
常用标记化合物及其制备
• 1．放射性碳的标记化合物 • 生物医学中用得最多的是14C和11C。 • 14C半衰期为5730年,半衰期长，能保证连续实验，又不需 要进行放射性衰变校正。 • 只发射β-粒子（0.159MeV），用液闪测量很方便； • 外照射较弱，易防护；用于自显影时，影像清晰； • 14C标记化合物的放射性比活度可高达2308.8MBq／毫克 原子，丰度可达100％（商品达80％以上）； • 14C可定位标记，纯化方便。 • 与3H相比， 14C标记化合物辐射自分解速度低； • 由于构成物质的C－C键比较牢固，标记化合物中的14C原 子也比较稳定。
1. 化学合成标记法 （chemical synthesis）
• 注意以下几个问题： • （1）必须注意操作量与比活度的关系 对生物学示踪实验来说，使用的标记化合 物的量愈少，愈接近于生物体的正常生理 状态。但另一方面，示踪物质进入生物体 以后，要受到大量正常物质的稀释，需要 使用的标记化合物的比活度愈高愈好。
放射性标记基本方法
• 1．化学合成标记法（chemical synthesis） • 此方法是通过化学反应将放射性核素引入化合物 中。换言之，就是将放射性核素的初始原料，通 过选定的工艺步骤，合成所需要的标记化合物。 此法不仅比活度高，而且能够定位标记，但合成 步骤较多。14C、3H和放射性碘标记化合物常用 此法进行合成标记。这类标记化合物已广泛用于 药理、代谢和分子的化学结构等方面的研究。对 于需要制备的标记化合物来说，当然是已知结构 的物质。
第二节 放射性标记的基本方法
• 1．标记核素的选择 • （1）合适的核性质 ：γ射线 ；半衰期 ；比 活度 ； • （2）得到的产物与被示踪化合物性质应尽 量接近 ； • （3）标记方便，标记的化合物稳定
放射性核素标记的基本方法
• 2．核素标记的要求： • （1）放射性核素标记率应尽量高，未标记的核素 应注意回收利用。 • （2）放射性核素标记需用微量或超微量方法进行 标记、纯化和鉴定。 • （3）尽量减少放射性核素的稀释，避免加入不必 要的载体； • （4）最好用同位素标记。如使用非同位素标记， 则标记位置应以不影响标记分子的特定功能为佳； • （5）标记过程应简单、快速。最好在标记的最后 阶段加入核素，以减少损失和污染；有条件时， 在标记前作冷实验，以取得经验。
2．3H标记化合物
• 氚标记化合物的缺点是碳-氚键的结合不够 牢固，有时会发生丢失； • 分子中氚标记的位置不易准确估计； • 氚标记的化合物比相同比活度的14C标记的 化合物因受辐射而分解的程度严重的多。 • 氚标记的化合物的用途较广，用化学合成 法、同位素交换法和生物合成法均可制备。
标记化合物的分型
• 5. 双标记或多标记（double labeling or multiple labeling） • 在生物学示踪实验中，有时需要在化合物 分子中引入两种或两种以上元素的同位素， 或引入一种元素的两种或两种以上的同位 素原子，这种标记化合物称为双标记或多 标记化合物。例如15NH214CH２COOH （氨基乙酸）
标记化合物的分型
• 3. 均匀标记U（uniform labeling） • 是一种非定位标记（non-specific labeling），常用 于14C标记的化合物中。它是指整个分子中某元素所 有的原子均可能被放射性同位素取代，取代的几率 是相等的，而且放射性原子在分子中的分布是均匀 的，达到统计学上的均一性。 • 4. 全标记G（general labeling） • 它是指化合物中某种原子不管在什么位置上都可能 是带放射性的。全标记主要用于3H标记的化合物， 在化合物分子中，任何有氢元素的位置上，都可能 被氚所取代。但是由于各个氢原子在分子中的位置 不同，在标记制备过程中被氚取代的几率不同，不 具有统计学上的均一性，因而全标记的化合物往往 是全而不均的。
3．生物合成标记法（biosynthesis）
• 该方法是利用酶、微生物、动植物的生理代谢过 程，引入放射性核素合成有机化合物。特别是对 目前尚不能用人工方法合成的有机化合物，如某 些激素、蛋白质、抗生素、核酸、维生素等，可 用生物合成法制备。 • 生物合成法比化学合成法容易，能够从自然界直 接获得有生物活性的异构体。 • 生物合成的缺点是产额低，标记位置不易控制， 易造成类似标记物，增加了标记的分离和提纯的 难度。 • 生物合成法可分为两类：全生物合成法和酶促合 成法（enzymatic synthesis method ）。
2．同位素交换标记法 （isotope exchange）
• （1）酶促合成法 • 在酶的催化下，可以合成某些特殊的标记 化合物，例如γ-32P-ATP的合成常用此法。 • 反应机理是利用非放射性的腺苷三磷酸在3磷酸甘油酸激酶和甘油醛-3-磷酸脱氢酶的 催化下，使腺苷三磷酸γ位上的磷酸与磷-32 标记的无机磷酸盐之间进行同位素交换反 应。
• （2） 酶促合成法 • 它是利用生物组织中某种特定的酶，促进标记前 体物质的合成反应，生成所需的标记产物。在酶 的催化下，可将放射性核素结合到生物分子上。 • 该方法合成的标记化合物很多是具有旋光性的异 构体，产物不必经过分离。因此，酶促合成法也 可看作是应用特殊催化剂的化学合成法。例如， 应用3H、32P、35S等核素标记的核苷酸类就属 于酶促合成法。
2．同位素交换标记法 （isotope exchange）
• 同位素交换标记法是利用同一元素的放射性核素 与化合物中的非放射性核素之间的交换反应来制 备所需要的标记化合物。该方法操作快速、简便。 在放射性核素半衰期短、化学合成步骤多的情况 下，该方法的实用意义更大。适用于大量有机化 合物、天然产物或难以制得前体的标记化合物的 制备，是制备3H标记化合物的重要方法。 • 同位素交换法包括酶促合成法、催化交换法和气 体曝射法。
2．同位素交换标记法 （isotope exchange）
• （3）气体曝射法 • 将需要标记的有机化合物置于比活度很高 的氚气中，密封放置几天至几星期，使氚 气中的氚与有机化合物中的氢原子发生交 换反应而制得氚标记化合物。 • 可用高频放电、微波、紫外线、γ射线照射 等促使氚气电离，或者在反应中加贵金属 作催化剂，使交换标记过程加速。
标记化合物的概放射性核素或稳定核素所取代，而成为 一类易被识别的化合物，则称之为标记化 合物。
标记化合物的分类
1．同位素标记化合物（isotopic labeled compound） 化合物中某元素的稳定同位素原子 被同一元素的放射性同位素或稳定同位素原子取 代，取代前后的化合物在理化性质上完全相同 （同位素效应除外），这类标记称为同位素标记 （isotopic labeling）。 2．非同位素标记化合物（nonisotopic labeled compound）该类标记化合物是用化学性质相似 或根本不同的放射性核素取代原化合物中所含的 某元素的稳定核素原子。这种标记称非同位素标 记（nonisotopic labeling）。
标记化合物的命名
• 有机标记化合物的命名，通常先指出标记 位置，再列出标记核素，最后是化合物的 名称，如 l-14C-醋酸。 • 无机标记化合物命名，通常在化合物的前 面注明放射性核素，也可把标记核素直接 写在分子式内，如125I-碘化钠（125I-NaI） 或Na125I。
标记化合物的分型
• l. 定位标记S（specific labeling） • 它是指放射性核素只局限于标记化合物分子中某一 特定的位置上，而在其他位置上的同种原子就不具 有放射性。常用“S”表示，如1-14C（S）-乙酸或114C-乙酸，表示第1位碳原子被放射性14C标记。 • 2. 准定位标记n（nominal labeling） • 在3H标记中，理论上应获得预期的定位标记分子， 实际上， 3H在预期位置上的分布，有时低于化合物 中3H总量的95％，或百分比值不详。此类标记称准 定位标记，用“n”表示。这是一种名义上的定位标 记，因此，也称名义定位标记。