荧光纳米颗粒标记免疫分析
合集下载
相关主题
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
由于荧光免疫分析方法灵敏 、便捷 ,得到了广泛 的研究应用 。最早使用也是目前最常用的是有机荧 光染料如荧光素 、罗丹明等 。有机荧光染料荧光效 率高 、激发波长长 ,但是容易光漂白 ,在和生物分子 的偶联中荧光自猝灭效应严重 ,并且 Stokes 位移小 ,
收稿 : 2005 年 12 月 , 收修改稿 : 2006 年 2 月 3 国家自然科学基金项目资助 (No. 20235010) 3 3 通讯联系人 e2mail :zxx @pku. edu. cn
近年来出现的含有大量荧光报告分子 (包括稀 土螯合物 、有机染料等) 的纳米颗粒可以免受溶剂的 干扰 ,荧光发射强而稳定 ,成为目前免疫标记领域的 研究热点之一[12 —37] 。这里我们把尺径在亚微米和 纳米的颗粒统称为纳米颗粒 。虽然量子点广泛用于 生物体系 (包括细胞表面 、细胞质浆 、细胞核 、组织样 本) 的荧光标记 ,但在体外免疫分析中未有报道 。本 文将从荧光纳米颗粒标记免疫分析的优点 、生物标 记和免疫模式设计的角度对近几年来荧光纳米颗粒 标记免疫分析进展进行综述 ,希望对这一领域的研 究起到抛砖引玉的作用 。
silica2coated rare earth ion chelate glutaraldehyde
fluorescent nanoparticles
FG avidin streptavidin —COOH —COOH — —NH2 —NH2
Key words nanoparticles ; immunoassay ; coupling ; heterogeneous phase ; homogeneous phase
免疫分析是利用抗体和抗原之间的高特异性反 应而对抗原 、抗体或相关物质进行检测的技术 。在 标记免疫分析出现之前 ,免疫分析基本处于定性或 半定量阶段 。标记免疫分析引入了探针系统进行检 测 ,大大提高了灵敏度 。根据标记物的不同可以将 免疫分析分为放射性免疫分析 ( RIA) 、酶联免疫分 析 ( ELIA) 、化学发光免疫分析 ( CLIA) 、荧光免疫分 析 ( FIA) 等 。
由于稀土离子荧光效率低 ,用于荧光标记免疫 分析主要采用 DELFIA 和 FIAgen 两种模式来增强信 号 。DELFIA[4 ,5] 系统基于定量测定用增强液萃取并 与免疫试剂结合的 Eu ( Ⅲ) 的浓度 ,结合共荧光效应 还可应用于多分析物的同时检测[6 ,7] 。FIAgen[8 ,9] 系
这种方式明显不同于传统方式 ,要在识别分子 表面结合多个荧光分子来提高 FΠP 值 , 从而可能带 来识别分子免疫活性位点的破坏 。如果采用定向偶 联或吸附的方式 ,同时控制包被的密度 ,防止空间位 阻对构象的影响 ,识别分子的免疫活性将得到更好 的保持 。
纳米颗粒的这种敏化方式 ,由于颗粒表面多个 识别分子可能的协同作用 ,已被证明较单个识别分
1 荧光纳米颗粒标记免疫分析的优点
发展超灵敏的非竞争免疫分析方法一直是近 20 年来免疫分析发展的主流 。提高分析灵敏度主 要从 3 个方面着手[38] : 一是提高抗体的亲合性 ,主 要依赖于抗体工程和重组抗体的发展 ;二是降低标 记抗 体 的 非 特 异 性 吸 附 , 改 善 途 径 有 封 闭 ( solid phase blocking) 和在缓冲液中添加适量非特异性蛋 白或表面活性剂 (bulk proteins in the assay buffer) ;三 是提高标记物活性 。
Abstract Fluorescent nanoparticles are popular labels in immunoassay research. They effectively increase the number of fluorescers on a detection molecule and contribute to ultra high sensitivity. But there are many differences in labeling and immunoassay of nanoparticles from conventional fluorescent labels. This restrains their broad application in diagnosis. The labeling methods , immunological configurations and influence factors of fluorescent nanoparticles in recent years are reviewed.
·1524 ·
化 学 进 展
第 18 卷
统则利用过量的 Eu ( Ⅲ) 来定量测定与免疫试剂结 合的络合配体的量 。由于稀土离子不容易猝灭 ,一 般一个抗体至少可以结合 10 个 Eu ( Ⅲ) 螯合物而保 持其免疫活性 。通过使用进一步的放大体系 ,如生 物素2亲合素放大[10] 、酶2底物放大[11] 、纳米颗粒标 记[15] 等可以更有效地提高 Eu ( Ⅲ) 的标记量 。
对于荧光标记物来讲 ,标记物的活性主要指荧 光效率 、抗光漂白性能 、抗杂散光干扰的能力和单个 识别分子上允许标记的荧光分子数目 ( FΠP) 。荧光 纳米颗粒的生物敏化 ,是将识别分子通过共价偶联 或吸附的方式包被在纳米颗粒表面 。虽然包被在颗 粒表面的有多个识别分子 ,但真正发生免疫反应的 只是其中一个 ;而纳米颗粒含有大量的荧光报告分 子 ,这样 FΠP 值较传统的荧光分子大大提高 ,免疫分 析的灵敏度也随之提高 。
关键词 纳米颗粒 免疫分析 偶联 异相 均相 中图分类号 : TB383 ; R446. 6 文献标识码 : A 文章编号 : 10052281X(2006) 1121523207
Fluorescent Nanoparticle Labeled Immunoassay
Kang J uan Zhang Xinxiang 3 3 (College of Chemistry and Molecular Engineering , Peking University , Beijing 100871 , China)
linker
polystyrene nanoparticle
biotin
polystyrene nanoparticle containing rare EDAC and sulfo2NHS
earth ion chelates layer2by2layer constructed fluorescent EDC
particles fluorescent particles Eu2O3 coated with APTMS
chelated Eu3 + ion2incorporated PEG tethered nanosphere
adsorption thionyl chloride N , N 2diisopro2 pylethylamine N2succinimidyl242( N2maleim idomethyl) cyclohexane212 carboxylate (SMCC)
Biblioteka Baidu
第 11 期
康 娟等 荧光纳米颗粒标记免疫分析
·1525 ·
表 1 免疫 分 析 中 荧 光纳米颗粒和生物分子的偶联方法
Table 1 Coupling of fluorescent nanoparticles and biomolecules in immunoassays
particle
子的表观亲合性更强 ,从而进一步提高免疫分析的 灵敏度[14] 。对于含有大量稀土螯合物的纳米颗粒 , 还可以结合时间分辨荧光去除本底和杂散光干扰 。
2 标记方法
与酶活性中心的金属原子和氨基酸侧链相互作 用形成的反应中心类似 , 纳米颗粒表面偶联生物分 子才可以形成新的识别体系 。根据纳米颗粒表面官 能团的不同 ,可以选择不同的偶联方式 (见表 1) :对 于表面带有不稳定覆盖层的纳米颗粒 ,生物分子可 通过交换反应直接连在其表面[39] ;对于由一些带电 的高分子层稳定的纳米颗粒 ,生物分子常通过非共 价的静电作用与之偶联[26] ;而对于表面具有特定官 能团的纳米颗粒 ,可以通过同双功能偶联剂或异双 功能偶联剂与生物分子偶联[25] 。 目前应用于免疫分析的荧光纳米颗粒有 的 来自 Molecular Probes[12] 、Seradyn[13] 这类生物公司 ,有 的 由 研 究 人 员 自 己 设 计 合 成 。 H rm 等[13 —16 ,19 ,20 ,23 ,27 ,28 ,30 ,31 ,37 ] 采用 Seradyn 公司出售的包裹 大量 Eu ( Ⅲ) 螯合物 、表面带有大量羧基的聚苯乙烯 微球为标记物 , 以前列腺特异抗原 ( PSA) 、雌二醇 ( E2 ) 、促甲状腺激素 ( TSH) 等为目标分析物 ,摸索建 立了多种灵敏 、快速或经济的免疫分析体系 。利用 脱水剂 EDC 和 sulfo2NHS 结合 ,将荧光纳米颗粒表 面的羧基和生物分子如抗体或链酶亲合素上的氨基 脱水 ,形成酰胺键 ,实现纳米颗粒和生物分子的共价 偶联 。不同的生物分子由于其等电点的不同 ,为保 持胶体的稳定性 ,需要选用不同 pH 值的反应介质 。 Yuan 等[25 ,29 ,34 ,35] 分别制备了表面带有 —NH2 的硅烷 链包被的 50nm、36nm、29nm Eu ( Ⅲ) 和 42nm Tb ( Ⅲ) 的荧光纳米颗粒 ,将牛血清白蛋白共价结合到颗粒 表面 ,增加了表面氨基的密度 ;之后再用戊二醛将链 酶亲合素结合到颗粒上 ,形成亲合素包被的荧光纳 米颗粒 ,并将其用于非竞争的固相免疫分析中。 Hoshino 等[22] 通 过 浸 染 的 方 法 制 备 了 表 面 带 有 —NH2 的聚乙烯乙二醇链包被的106. 7nm Eu ( Ⅲ) 荧 光纳米颗粒 ,利用异双功能偶联剂 SMCC 与表面氨 基作用引入马来酰亚胺基 ,它可以与抗体的 Fab’片 断巯基反应 ,实现抗体片断的定向偶联 ,在 а2胎蛋白 的非 竞 争 固 相 免 疫 分 析 中 检 测 限 达 到 0. 04ngΠL 。 Kennedy 等[21] 则通过在 20 —100nm 左右的 Eu2O3 表 面微波辅助包被一层带氨基的硅烷链来与活化的莠 去津半抗原反应 ,建立了莠去津小分子纳米荧光标 记竞争免疫分析方法 。Renneberg 等[17 ,18 ,26 ,32 ,36] 通过
所以受激发光散射的影响也比较大[1 ,2] 。后来出现 的绿色荧光蛋白虽然发光强而稳定 ,但是由于蛋白 分子体积大 、对环境比较敏感 ,所以实际操作起来也 不方便[3] 。稀土离子 , 主要是 Eu ( Ⅲ) 、Tb ( Ⅲ) 、Sm ( Ⅲ) 、Dy ( Ⅲ) 的螯合物 ,激发波长可以通过配体调 节 ,荧光发射特异性强 ,Stokes 位移大 ,寿命长 ,利用 时间分辨荧光技术可以大大减少生物样品本底和杂 散光的干扰 ,从而成为很有前途的荧光标记物 。
第 18 卷 第 11 期 2006 年 11 月
化 学 进 展
PROGRESS IN CHEMISTRY
Vol . 18 No. 11 Nov. , 2006
荧光纳米颗粒标记免疫分析 3
康 娟 张新祥 3 3
(北京大学化学与分子工程学院 北京 100871)
摘 要 荧光纳米颗粒标记是目前免疫分析研究中一个新兴的领域 。由于荧光纳米颗粒标记可以有效 地提高单个识别分子上标记的荧光量 ( FΠP) ,从而大大提高分析的灵敏度 。但是由于在标记和免疫分析过程 中具有很多不同于传统荧光染料的特点 ,需要很多经验的积累 ,在现阶段限制了其在实际医学诊断中的广泛 应用 。本文就近年来荧光纳米颗粒标记免疫分析中涉及到的标记方法 、免疫模式 、影响因素等方面进行了 综述 。
收稿 : 2005 年 12 月 , 收修改稿 : 2006 年 2 月 3 国家自然科学基金项目资助 (No. 20235010) 3 3 通讯联系人 e2mail :zxx @pku. edu. cn
近年来出现的含有大量荧光报告分子 (包括稀 土螯合物 、有机染料等) 的纳米颗粒可以免受溶剂的 干扰 ,荧光发射强而稳定 ,成为目前免疫标记领域的 研究热点之一[12 —37] 。这里我们把尺径在亚微米和 纳米的颗粒统称为纳米颗粒 。虽然量子点广泛用于 生物体系 (包括细胞表面 、细胞质浆 、细胞核 、组织样 本) 的荧光标记 ,但在体外免疫分析中未有报道 。本 文将从荧光纳米颗粒标记免疫分析的优点 、生物标 记和免疫模式设计的角度对近几年来荧光纳米颗粒 标记免疫分析进展进行综述 ,希望对这一领域的研 究起到抛砖引玉的作用 。
silica2coated rare earth ion chelate glutaraldehyde
fluorescent nanoparticles
FG avidin streptavidin —COOH —COOH — —NH2 —NH2
Key words nanoparticles ; immunoassay ; coupling ; heterogeneous phase ; homogeneous phase
免疫分析是利用抗体和抗原之间的高特异性反 应而对抗原 、抗体或相关物质进行检测的技术 。在 标记免疫分析出现之前 ,免疫分析基本处于定性或 半定量阶段 。标记免疫分析引入了探针系统进行检 测 ,大大提高了灵敏度 。根据标记物的不同可以将 免疫分析分为放射性免疫分析 ( RIA) 、酶联免疫分 析 ( ELIA) 、化学发光免疫分析 ( CLIA) 、荧光免疫分 析 ( FIA) 等 。
由于稀土离子荧光效率低 ,用于荧光标记免疫 分析主要采用 DELFIA 和 FIAgen 两种模式来增强信 号 。DELFIA[4 ,5] 系统基于定量测定用增强液萃取并 与免疫试剂结合的 Eu ( Ⅲ) 的浓度 ,结合共荧光效应 还可应用于多分析物的同时检测[6 ,7] 。FIAgen[8 ,9] 系
这种方式明显不同于传统方式 ,要在识别分子 表面结合多个荧光分子来提高 FΠP 值 , 从而可能带 来识别分子免疫活性位点的破坏 。如果采用定向偶 联或吸附的方式 ,同时控制包被的密度 ,防止空间位 阻对构象的影响 ,识别分子的免疫活性将得到更好 的保持 。
纳米颗粒的这种敏化方式 ,由于颗粒表面多个 识别分子可能的协同作用 ,已被证明较单个识别分
1 荧光纳米颗粒标记免疫分析的优点
发展超灵敏的非竞争免疫分析方法一直是近 20 年来免疫分析发展的主流 。提高分析灵敏度主 要从 3 个方面着手[38] : 一是提高抗体的亲合性 ,主 要依赖于抗体工程和重组抗体的发展 ;二是降低标 记抗 体 的 非 特 异 性 吸 附 , 改 善 途 径 有 封 闭 ( solid phase blocking) 和在缓冲液中添加适量非特异性蛋 白或表面活性剂 (bulk proteins in the assay buffer) ;三 是提高标记物活性 。
Abstract Fluorescent nanoparticles are popular labels in immunoassay research. They effectively increase the number of fluorescers on a detection molecule and contribute to ultra high sensitivity. But there are many differences in labeling and immunoassay of nanoparticles from conventional fluorescent labels. This restrains their broad application in diagnosis. The labeling methods , immunological configurations and influence factors of fluorescent nanoparticles in recent years are reviewed.
·1524 ·
化 学 进 展
第 18 卷
统则利用过量的 Eu ( Ⅲ) 来定量测定与免疫试剂结 合的络合配体的量 。由于稀土离子不容易猝灭 ,一 般一个抗体至少可以结合 10 个 Eu ( Ⅲ) 螯合物而保 持其免疫活性 。通过使用进一步的放大体系 ,如生 物素2亲合素放大[10] 、酶2底物放大[11] 、纳米颗粒标 记[15] 等可以更有效地提高 Eu ( Ⅲ) 的标记量 。
对于荧光标记物来讲 ,标记物的活性主要指荧 光效率 、抗光漂白性能 、抗杂散光干扰的能力和单个 识别分子上允许标记的荧光分子数目 ( FΠP) 。荧光 纳米颗粒的生物敏化 ,是将识别分子通过共价偶联 或吸附的方式包被在纳米颗粒表面 。虽然包被在颗 粒表面的有多个识别分子 ,但真正发生免疫反应的 只是其中一个 ;而纳米颗粒含有大量的荧光报告分 子 ,这样 FΠP 值较传统的荧光分子大大提高 ,免疫分 析的灵敏度也随之提高 。
关键词 纳米颗粒 免疫分析 偶联 异相 均相 中图分类号 : TB383 ; R446. 6 文献标识码 : A 文章编号 : 10052281X(2006) 1121523207
Fluorescent Nanoparticle Labeled Immunoassay
Kang J uan Zhang Xinxiang 3 3 (College of Chemistry and Molecular Engineering , Peking University , Beijing 100871 , China)
linker
polystyrene nanoparticle
biotin
polystyrene nanoparticle containing rare EDAC and sulfo2NHS
earth ion chelates layer2by2layer constructed fluorescent EDC
particles fluorescent particles Eu2O3 coated with APTMS
chelated Eu3 + ion2incorporated PEG tethered nanosphere
adsorption thionyl chloride N , N 2diisopro2 pylethylamine N2succinimidyl242( N2maleim idomethyl) cyclohexane212 carboxylate (SMCC)
Biblioteka Baidu
第 11 期
康 娟等 荧光纳米颗粒标记免疫分析
·1525 ·
表 1 免疫 分 析 中 荧 光纳米颗粒和生物分子的偶联方法
Table 1 Coupling of fluorescent nanoparticles and biomolecules in immunoassays
particle
子的表观亲合性更强 ,从而进一步提高免疫分析的 灵敏度[14] 。对于含有大量稀土螯合物的纳米颗粒 , 还可以结合时间分辨荧光去除本底和杂散光干扰 。
2 标记方法
与酶活性中心的金属原子和氨基酸侧链相互作 用形成的反应中心类似 , 纳米颗粒表面偶联生物分 子才可以形成新的识别体系 。根据纳米颗粒表面官 能团的不同 ,可以选择不同的偶联方式 (见表 1) :对 于表面带有不稳定覆盖层的纳米颗粒 ,生物分子可 通过交换反应直接连在其表面[39] ;对于由一些带电 的高分子层稳定的纳米颗粒 ,生物分子常通过非共 价的静电作用与之偶联[26] ;而对于表面具有特定官 能团的纳米颗粒 ,可以通过同双功能偶联剂或异双 功能偶联剂与生物分子偶联[25] 。 目前应用于免疫分析的荧光纳米颗粒有 的 来自 Molecular Probes[12] 、Seradyn[13] 这类生物公司 ,有 的 由 研 究 人 员 自 己 设 计 合 成 。 H rm 等[13 —16 ,19 ,20 ,23 ,27 ,28 ,30 ,31 ,37 ] 采用 Seradyn 公司出售的包裹 大量 Eu ( Ⅲ) 螯合物 、表面带有大量羧基的聚苯乙烯 微球为标记物 , 以前列腺特异抗原 ( PSA) 、雌二醇 ( E2 ) 、促甲状腺激素 ( TSH) 等为目标分析物 ,摸索建 立了多种灵敏 、快速或经济的免疫分析体系 。利用 脱水剂 EDC 和 sulfo2NHS 结合 ,将荧光纳米颗粒表 面的羧基和生物分子如抗体或链酶亲合素上的氨基 脱水 ,形成酰胺键 ,实现纳米颗粒和生物分子的共价 偶联 。不同的生物分子由于其等电点的不同 ,为保 持胶体的稳定性 ,需要选用不同 pH 值的反应介质 。 Yuan 等[25 ,29 ,34 ,35] 分别制备了表面带有 —NH2 的硅烷 链包被的 50nm、36nm、29nm Eu ( Ⅲ) 和 42nm Tb ( Ⅲ) 的荧光纳米颗粒 ,将牛血清白蛋白共价结合到颗粒 表面 ,增加了表面氨基的密度 ;之后再用戊二醛将链 酶亲合素结合到颗粒上 ,形成亲合素包被的荧光纳 米颗粒 ,并将其用于非竞争的固相免疫分析中。 Hoshino 等[22] 通 过 浸 染 的 方 法 制 备 了 表 面 带 有 —NH2 的聚乙烯乙二醇链包被的106. 7nm Eu ( Ⅲ) 荧 光纳米颗粒 ,利用异双功能偶联剂 SMCC 与表面氨 基作用引入马来酰亚胺基 ,它可以与抗体的 Fab’片 断巯基反应 ,实现抗体片断的定向偶联 ,在 а2胎蛋白 的非 竞 争 固 相 免 疫 分 析 中 检 测 限 达 到 0. 04ngΠL 。 Kennedy 等[21] 则通过在 20 —100nm 左右的 Eu2O3 表 面微波辅助包被一层带氨基的硅烷链来与活化的莠 去津半抗原反应 ,建立了莠去津小分子纳米荧光标 记竞争免疫分析方法 。Renneberg 等[17 ,18 ,26 ,32 ,36] 通过
所以受激发光散射的影响也比较大[1 ,2] 。后来出现 的绿色荧光蛋白虽然发光强而稳定 ,但是由于蛋白 分子体积大 、对环境比较敏感 ,所以实际操作起来也 不方便[3] 。稀土离子 , 主要是 Eu ( Ⅲ) 、Tb ( Ⅲ) 、Sm ( Ⅲ) 、Dy ( Ⅲ) 的螯合物 ,激发波长可以通过配体调 节 ,荧光发射特异性强 ,Stokes 位移大 ,寿命长 ,利用 时间分辨荧光技术可以大大减少生物样品本底和杂 散光的干扰 ,从而成为很有前途的荧光标记物 。
第 18 卷 第 11 期 2006 年 11 月
化 学 进 展
PROGRESS IN CHEMISTRY
Vol . 18 No. 11 Nov. , 2006
荧光纳米颗粒标记免疫分析 3
康 娟 张新祥 3 3
(北京大学化学与分子工程学院 北京 100871)
摘 要 荧光纳米颗粒标记是目前免疫分析研究中一个新兴的领域 。由于荧光纳米颗粒标记可以有效 地提高单个识别分子上标记的荧光量 ( FΠP) ,从而大大提高分析的灵敏度 。但是由于在标记和免疫分析过程 中具有很多不同于传统荧光染料的特点 ,需要很多经验的积累 ,在现阶段限制了其在实际医学诊断中的广泛 应用 。本文就近年来荧光纳米颗粒标记免疫分析中涉及到的标记方法 、免疫模式 、影响因素等方面进行了 综述 。