第十四章：大肠杆菌基因工程资料

②色氨酸启动子Ptrp的可控性 Ptrp受色氨酸-阻遏蛋白复合物的阻遏， 转录呈基底状态，在培养系统中去除色 氨酸或加入 3- 吲哚丙烯酸（ IAA ）可有 效解除阻遏。正常培养体系中去除色氨 酸很难，基因工程通过添加IAA诱导Ptrp
介导的目的基因的表达。
③λ噬菌体启动子PλL的可控性
PλL受阻遏蛋白阻遏，很难直接诱导，基因 工 程 中 常 使 用 温 度 敏 感 型 的 cI 突 变 基 因
PrecA 来源于recA基因
5.启动子的构建 为了获得更强的启动子，除了从基因 组DNA上进行筛选甄别外，还可利用已 知的启动子重新构建新的杂合启动子， 以满足不同外源基因的表达要求。
为了获得更强的启动子，除了从基因组DNA上进行筛选甄别外，还可
利用已知的启动子重新构建新的杂合启动子，以满足不同外源基因的表
野生型的 Plac 上游附近具有代谢激活因子 （ CAP ）结合区， cAMP 激活 CAP ， CAP 结合 启动子控制区，促进Plac介导的转录。葡 萄糖代谢使cAMP减少。因此基因工程上使 用的乳糖启动子抗葡萄糖代谢阻遏的突变 型，即PlacUV5
而在大规模培养重组大肠杆菌时，培养基中必须加 入葡萄糖，因此在实际操作中通常使用的是野生型
Plac启动子的突变体PlacUV5启动子。它含有一个
突变碱基对，其活性比野生型Plac启动子更强，而 且对葡萄糖及分解代谢产物的阻遏作用不敏感，但 仍为受体细胞中的Lac阻遏蛋白阻遏，因此可以用
乳糖或IPTG进行有效诱导。人工构建的Ptac启动子
由于含有lac操作子区域，所以其阻遏诱导性质与
PlacUV5相同。
②如外源基因下游紧接有载体上其它 重要基因或DNA功能区域，则RNA聚 合酶在此处的转录可能干扰质粒的 复制及其它生物功能，甚至导致重
百度文库
组质粒的不稳定性；
③过长的mRNA往往产生大量无用
的蛋白质，增加工程菌的能量
含有外源启动子活性 的重组克隆
②酶保护法分离
依据RNA聚合酶与启动子区域的特异性结合原理设 计的。将大肠杆菌基因组文库中的重组质粒与 RNA
聚合酶在体外保温片刻，然后选择合适的限制性
内切酶对其进行消化，未与RNA聚合酶保温的同一 重组质粒作酶切对照。如果试验质粒的限制性片 段比对照质粒减少，则表明被钝化的酶切位点位 于RNA聚合酶保护区域内，即该区域存在启动子结
3.启动子的筛选 ①鸟枪法克隆 采用鸟枪法战略，将合适大小的 DNA 片段克隆到启动子探针质粒 pKO1上， 受体细胞染色体 DNA 上的 galE 、 galT 与质粒报告基因 galK的表达产物联合 作用，能将培养基中的半乳糖糖酵解
成红色素物质。
转化galE+、galT+的大 肠杆菌受体菌株
第十四章
大肠杆菌基因工程
第一节、大肠杆菌作为受体菌的特征
一．大肠杆菌表达外源基因的优势 1.全基因组测序，遗传背景清楚 ， 共有4405个开放阅读框架。 2.基因克隆表达系统成熟完善。
3.繁殖迅速，培养简单，操作方便， 遗传稳定。 4.被美国FDA批准为安全的基因工程 受体生物。
5.成本低
二．大肠杆菌表达外源基因的劣势 1.缺乏对真核生物蛋白质的加工系统。 2.内源性蛋白酶易降解空间构象不正 确的异源蛋白。 3.不具备真核生物的蛋白质复性系统。 4.其细胞膜间隙含有大量的内毒素，
二．终止子 外源基因在强启动子的控制下表达， 易发生转录过头现象，即RNA聚合酶 滑过终止子结构继续转录质粒上邻 近的DNA序列，形成长短不一的mRNA 混合物。
1.过长转录物的产生在很大程度上会
影响外源基因的表达，原因如下：
①转录产物越长，RNA聚合酶转录一 分子mRNA所需时间相应增加，外源 基因本身的转录效率下降；
cI857 控制 PλL ， cI857 阻遏蛋白在 42℃时失
活脱落， PL 便可介导目的基因的表达，但
在大型细菌培养罐中迅速升温很难，故常
使用双质粒的控制系统，用色氨酸间接控
制目的基因表达。
当培养基中缺少色氨酸时，Ptrp启动子打开，CI 阻遏蛋白合成，由Pl启动子介导的外源基因转录 关闭；相反，当色氨酸大量存在时，Ptrp启动子 关闭，CI阻遏蛋白不再合成，Pl启动子开放并激 活外源基因表达。从整体上来看，外源基因虽然 处于Pl启动子控制之下，但却可用色氨酸取代温 度进行诱导表达。
可能混在产物里。
第二节、外源基因在大肠杆菌中高效表达原理
一．启动子 二．终止子
三．核糖体结合位点
四．密码子 五．质粒拷贝数
一．启动子 1.大肠杆菌启动子的强弱取决于 ①启动子本身的序列，尤其是-10区 和-35区的碱基组成及彼此间的距 离 ②启动子与外源基因转录起始位点 之间的距离
2.启动子最佳作用距离的探测 其中目的基因表达量最高的克隆即具有最 佳的启动子作用距离。 若克隆菌细胞内检测不到相应的mRNA，有 必要考虑调整启动子与基因最佳的距离。
达要求。 由Ptrp-35区序列和Plac-10区序列重组而成的杂合启动子Ptac，其相
对强弱分别是Ptrp的三倍和Plac的11倍。
6.启动子的可控性 ①乳糖启动子Plac的可控性 野生型的Plac与其控制区Olac偶联在 一起，在没有诱导物存在时，整个 操纵子处于基底水平表达；诱导物 可以使启动子 Plac 介导的转录大幅 增加。
再用高盐溶液将结合在薄膜上的 DNA 片段洗下。一般来说，
这种DNA片段在膜上的滞留程度与其同RNA聚合酶的亲和性 （即启动子的强弱）成比例，然而这种强弱难以量化，通
常仍需要将之克隆在探针质粒上进行检测。
4.常用的大肠杆菌的启动子
Plac 来源于乳糖操纵子
Ptrp 来源于色氨酸操纵子
PL 来源于λ噬菌体早期操纵子
构。将这个区域的DNA片段次级克隆在启动子探针
质粒上，测定其所含有启动子的转录活性。
③滤膜结合法分离
原理是双链 DNA 不能与硝酸纤维素薄膜有效结合，而 DNA-
蛋白质复合物却能在一定条件下结合在膜上。将待检测
DNA片段与RNA聚合酶保温，并转移保温混合物至膜上，温 和漂洗薄膜，除去未结合RNA聚合酶的双链DNA片段，然后