生物工艺学第八章 工业发酵染菌的防治

第八章 工业发酵染菌的防治发酵染菌能给生产带来严重危害，防 止杂菌污染是任何发酵工厂的一项重 要工作内容。

尤其是无菌程度要求高 的液体深层发酵，污染防止工作的重 要性更为突出。

主要内容工业发酵染菌的危害； 染菌的检查、判断及染菌原因分 析； 防治染菌的措施。

第一节工业发酵染菌的危害染菌：发酵过程污染杂菌的现象；大量原材料浪费、经济巨大损失； 扰乱生产秩序，破坏生产计划； 遇到连续染菌，特别在找不到染菌原因往往 会影响人们的情绪和生产积极性； 影响产品外观及内在质量。

生产不同的品种，可污染不同种类和性质的 微生物； 不同污染时间，不同污染途径，污染不同菌 量，不同培养基和培养条件又可产生不同后 果 。

发酵染菌对不同品种的影响； 不同种类的杂菌对发酵的影响； 不同时间染菌对发酵的影响； 不同染菌途径对发酵的影响； 发酵染菌对提炼、产品质量、三废治理的影 响。

1 发酵染菌对不同品种的影响放线菌由于生长的最适pH7左右，因此染细菌为 多，而霉菌生长pH5左右，因此染酵母菌为多； 青霉素发酵染菌，绝大多数杂菌都能直接产生青 霉素酶，而另一些杂菌则可被青霉素诱导而产生 青霉素酶； 灰黄霉素、制霉菌素、克念菌素等抗生素抑制霉 菌，对细菌几乎没有抑制和杀灭作用，故容易染 细菌； 疫苗生产：一旦污染杂菌，不论死菌、活菌或内 外毒素，都应全部废弃。

2不同种类的杂菌对发酵的影响（1）污染噬菌体：感染力很强，传播蔓延迅速，也较难防治，故危 害极大。

（2）污染其它杂菌：有些使生产菌自溶产生大量泡沫，影响通气搅 拌；有的使发酵液发臭、发酸，致使pH下降，使 不耐酸的产品破坏。

染芽孢杆菌，由于芽孢耐热，不易杀死，往往一 次染菌后会反复染菌。

生产实例：青霉素发酵:污染细短产气杆菌比粗大杆菌的危害 大； 链霉素发酵:污染细短杆菌、假单孢杆菌和产气杆 菌比粗大杆菌的危害大； 四环素发酵:污染双球菌、芽孢杆菌和夹膜杆菌的 危害较大； 柠檬酸发酵：最怕污染青霉菌； 肌苷、肌苷酸发酵：污染芽孢杆菌的危害最大； 高温淀粉酶发酵：污染芽孢杆菌和噬菌体的危害 较大； 谷氨酸发酵：最怕污染噬菌体。

3 不同时间染菌对发酵的影响及采取的措施污染时间是指用无菌检测方法确准的污染时 间，不是杂菌窜入培养液的时间； 杂菌进入培养液后，需有足够的生长、繁殖的 时间才能显现出来； 显现的时间与污染菌量和杂菌生长速度有关。

不同时期：种子期，发酵前期、中期、后 期。

（1）种子培养期染菌由于接种量较小，生产菌生长一开始不占优 势，而且培养液中几乎没有抗生素（产物） 或只有很少抗生素（产物）； 因而它防御杂菌能力低，容易污染杂菌。

措施：如在此阶段染菌，应将培养液全 部废弃。

（2）发酵前期染菌发酵前期最易染菌，且危害最大。

染菌后采取的措施 ：降低培养温度， 调整补料量，用酸碱调pH值，缩短培养 周期等措施予以补救。

如果培养基消耗 不多，可以重新灭菌，补加一些营养， 重新接种再用。

（3）发酵中期染菌发酵中期染菌会严重干扰产生菌的代谢。

采取措施：降温培养，减少补料，密切注意代谢变 化情况； 如果发酵单位到达一定水平可以提前放 罐，或者抗生素生产中可以将高单位的 发酵液输送一部分到染菌罐，抑制杂菌。

（4）发酵后期染菌发酵后期发酵液内已积累大量的产物，特 别是抗生素，对杂菌有一定的抑制或杀灭 能力； 如果染菌不多，对生产影响不大。

如果染 菌严重，又破坏性较大，可以提前放罐。

4 不同染菌途径对发酵的影响种子带菌：种子带菌可使发酵染菌具有延 续性； 空气带菌：空气带菌也使发酵染菌具有延 续性，导致染菌范围扩大至所有发酵罐； 培养基或设备灭菌不彻底：一般为孤立事 件，不具有延续性； 设备渗漏：这种途径造成染菌的危害性较 大。

5发酵染菌对提炼和产品质量的影响（1）发酵染菌对过滤的影响：染菌的发酵液一般发粘，菌体大多数自溶，导致 过滤困难。

（2）发酵染菌对提炼其它工段的影响：染菌发酵液中含有比正常发酵液更多的水溶性蛋 白和其它杂质； 采用有机溶剂萃取的提炼工艺，则极易发生乳 化； 染菌后大大降低离子交换树脂的交换容量。

（3）对产品质量的影响对内在质量的影响：染菌的发酵液含有较 多的蛋白质和其它杂质，对产品的纯度有 较大影响； 对产品外观的影响：一些染菌的发酵液经 处理过滤后得到澄清的发酵液，放置后会 出现混浊，影响产品的外观。

6 染菌对三废处理的影响使过滤后的废菌体无法利用； 发酵染菌的废液，生物需氧量（BOD） 增高，增加三废治理费用和时间。

第二节 染菌的检查及染菌原因分析染菌的检查； 原因分析。

一染菌的检查判断发酵是否染菌应以无菌试验结果为根据（方 法等参考国标）； 1.目前生产上常用的杂菌检查方法 ①显微镜检查：染色 ②平板划线检查： 倒平板 空培养 待测样品划线 培养观察 镜检③酚红肉汤培养检查： 无菌肉汤培养基空培养 接入样品 培养观察2.各种检查方法的比较显微镜检查方法： 优点：简便、快速； 缺点：镜检取样少，视野的观察面也小，因此 不易检出早期杂菌。

平板划线法和肉汤培养方法： 优点：比显微镜的灵敏度高，而且结果也更为 准确； 缺点：需经较长时间培养(一般要过夜)才能判 断结果，且操作较繁琐。

3.杂菌检查中的问题：检查结果应以平板划线和肉汤培养结果为主要根 据； 平板划线和肉汤培养应做三个平行样； 定期取样； 酚红肉汤和平板划线培养样品应保存至放罐后12 小时，确定为无菌时方可弃去； 取样时防止外界杂菌混入的措施； 科学合理的选择检查工序和时间； 每个工序或经一定时间都应进行取样检查。

发酵过程的杂菌检查除了以上的方法外，在实际生产中还 可以根据以下参数的异常变化来判断 是否染菌：溶解氧； pH值； 尾气中CO2含量。

二染菌的原因分析(一)发酵染菌率总染菌率：指一年内发酵染菌的批次 与总投料批次数之比乘以100得到的百 分率。

染菌批次数应包括染菌后培养基经重 新灭菌，又再次染菌的批次数在内。

发酵染菌批（次）数 总染菌率％== ×100％ 总投料批（次）数设备染菌率； 不同品种发酵的染菌率； 不同发酵阶段的染菌率； 季节染菌率； 操作染菌率。

（二） 染菌原因的分析举例：国外一抗生素发酵染菌原因的分析； 上海第三制药厂染菌原因分析； 某制药厂链霉素发酵染菌原因分析。

从染菌的规模来分析染菌原因； 从染菌的时间来分析； 从染菌的类型来分析。

1.国外一抗生素发酵染菌原因的分析染菌原因 种子带菌 接种时罐压跌零 培养基灭菌不透 总空气系统带菌 搅拌轴密封泄漏 泡沫冒顶 夹套穿孔 百分率% 染菌原因 9.64 蛇管穿孔 0.19 0.79 19.96 2.09 0.48 12.36 接种管穿孔 阀门泄漏 罐盖漏 其他设备渗漏 操作问题 原因不明 百分率% 5.89 0.39 1.45 1.54 10.13 10.15 24.912.上海第三制药厂染菌原因分析 项目 百分率% 种子带菌 14.15 盘管穿孔 14.20 阀门渗漏 23.30 空气系统有菌 10.0 管理不善 25.80 其它 7.49 原因不明 5.78管理不善而染菌的有31个罐批，占 25.08％，经分析有下表所列原因：项目 进罐前未做设备严密度检查 接种违反操作规程 检修质量缺乏验收制度 操作不熟练 配料违反工艺规程 调度不当 百分率% 25.8 25.8 19.35 19.35 6.45 3.253.某制药厂链霉素发酵染菌原因分析项目 外界带入杂菌（取样、补料） 设备穿孔 空气系统有菌 停电罐压跌零 接种 蒸汽压力不足或蒸汽量不足 管理问题 操作违反规程 种子带菌 原因不明 百分率% 8.20 7.60 26.00 1.60 11.00 0.60 7.80 1.60 0.60 35.004.从染菌的规模来分析染菌原因大批发酵罐染菌 ： 空气系统； 部分发酵罐(或罐组)染菌： 前期：可能是种子带杂菌，或灭菌不彻底； 中后期：可能是中间补料系统或油管路； 个别发酵罐连续染菌： 设备问题，设备的腐蚀磨损等； 个别发酵罐偶然染菌： 原因比较复杂，不确定。

5.从染菌的时间来分析发酵早期染菌:种子带菌， 培养基和设备灭菌不彻底， 设备或管道有死角。

中、后期染菌:中间补料， 设备渗漏， 操作不合理。

6.从染菌的类型来分析耐热性芽孢杆菌:死角或灭菌不彻底； 球菌、酵母:可能是从蒸汽的冷凝水或空 气中带来的； 浅绿色菌落(革兰氏阴性杆菌):发酵罐的 冷却管或夹套渗漏； 霉菌:灭菌不彻底或无菌操作不严格。

第三节 染菌的防治措施避免在发酵生产中污染杂菌应以预防为 主； “防重于治”，事前防止胜于事后挽救。

种子带菌的防治； 发酵设备、管件的渗漏与配置； 发酵罐与管件的死角 ； 染菌后的挽救措施； 噬菌体感染和处理方法。

（一）种子带菌的防治无菌室满足基本要求，无菌室达到要求的无菌度 （把无菌培养皿平板打开盖子在无菌室内放置30 分钟，然后过夜培养，根据一般工厂的经验，长 出的菌落在3个以下为好） ； 无菌操作； 按规程进行灭菌操作； 摇瓶培养时符合要求； 在每次接种后应留取少量的种子悬浮液进行平板、 肉汤培养，借以说明是否是种子中带杂菌。

（二）发酵设备、管件的渗漏与配置设备和管件的渗漏一般是指设备和管 件由于腐蚀、内应力或其他原因形成 微小漏孔所发生的渗漏现象； 这些漏孔很小，特别是不锈钢材料形 成的漏孔更小，有时肉眼不能直接觉 察，需要通过一定的试漏方法才能发 现。

1、设备渗漏的原因：发酵液中腐蚀性物质对设备的腐蚀； 磨蚀： 发酵液中固体物料因搅拌桨的搅动与冷 却管摩擦而引起管外壁磨损； 冷却介质和加热时蒸汽的冲击，引起管 内壁的磨损。

设备加工不良： 弯管时，弯头处管壁变薄； 焊接不良。

2、盘管渗漏的防治：放罐后要认真清洗发酵罐； 控制冷却水质量，降低其中氯离子含量； 对盘管定期检查、试漏，及时发现漏隙； 试漏方法： 气压试验； 水压试验。

3、空气分布管渗漏的防治； 4、罐体渗漏的防治； 5、管件的渗漏； 6、管路的连接和配置。

(1)阀A、截止阀使用中经常发生的问题： • 阀心轧坏； • 填料的渗漏。

防漏 在发酵罐底的出料 阀门和空气管道连 接的蒸汽管道上的 阀门，可安装双重 阀，其优点是：即 使阀门1有渗漏， 蒸汽也可通过阀门 3排除B、隔膜阀隔膜阀有以下优点： 严密不漏；无填料；流量大， 阻力小，无死角； 检修方便。

缺点： 制造不够精密；体积较大； 中心易引起渗漏。

开关费力， 橡胶隔膜要求质量好。

隔膜阀适用于移种、打料管 道。

这些管道上若装置截止 阀，如渗漏或关闭不严，易 发生染菌事故。

阀门试漏的方法（2）管路的连接螺纹连接：螺纹连接简单，但容易染菌； 法兰连接：法兰连接密封可靠，压力、温 度和管径的适用范围大，但费用较高； 焊接：简便、密封可靠，但拆卸不便。