苹果酸的制备
L-苹果酸的生产方法、生理功能及其应用
基金项目国家级大学生创新创业训练项目（20221135041）。
作者简介盛明俊（2002—），男，安徽安庆人，从事食品质量与安全研究。
通信作者马龙（1979—），男，安徽蚌埠人，博士，副教授，从事食品科学与工程研究。
收稿日期2023-11-16L-苹果酸的生产方法、生理功能及其应用盛明俊詹凯马龙（蚌埠学院食品与生物工程学院，安徽蚌埠233000）摘要L-苹果酸是一种天然有机酸，易溶于水和乙醇，其作为良好的食品酸味剂，被广泛应用于食品工业。
本文介绍了L-苹果酸的生产方法和生理功能，探究了酶转化或细胞转化法和微生物发酵法的研究进展，综述了L-苹果酸在食品工业中的应用情况，对L-苹果酸在食品工业中的应用前景和生产方法的研究方向进行了展望，为L-苹果酸的进一步研究提供参考。
关键词L-苹果酸；酶转化；细胞转化法；微生物发酵法；食品工业中图分类号TS201.2；S377文献标识码A文章编号1007-7731（2024）01-0082-06苹果酸，又名2-羟基丁二酸，分子式为C 4H 6O 5，相对分子质量为134.09。
苹果酸的分子中存在一个不对称碳原子，有2种异构体，在大自然中以D-苹果酸、DL-苹果酸和L-苹果酸3种形式存在。
D-苹果酸难以被人体吸收利用，经过化学合成法生产出来的DL-苹果酸可能具有一定的毒性，而L-苹果酸可以被人体吸收利用，并且具有一定的生理功能[1]。
本文介绍了L-苹果酸的生产方法和生理功能，探究了酶转化或细胞转化法和微生物发酵法的研究进展，综述了L-苹果酸在食品工业中的应用情况，对L-苹果酸在食品工业中的应用前景和生产方法的研究方向进行了展望，为L-苹果酸的进一步研究提供参考。
1L-苹果酸的生产方法L-苹果酸的生产方法由直接提取法、化学合成法发展到目前的酶转化或细胞转化法和微生物发酵法等。
1.1直接提取法L-苹果酸广泛存在于蔬菜和未成熟的水果中。
直接提取法的操作原理是先将未成熟的苹果、葡萄和桃的果汁或蔬菜汁煮沸，后加入石灰水，得到钙盐沉淀；随后将钙盐转变为铅盐，并经处理得到游离酸，即可得到L-苹果酸。
浅谈合成法苹果酸工艺的节能降耗
浅谈合成法苹果酸工艺的节能降耗【摘要】苹果酸是一种重要的有机酸，是低热量的新型食品酸味剂，适宜制造低能食品饮料，还可作化学合成原料、酯类和盐类的制造，表面活性剂、荧光增白剂的制造及消毒剂、洗涤剂和酸洗剂等，在食品、医药和化工领域都有广泛的用途。
本文阐述了合成法生产DL-苹果酸生产方法及生产过程节能降耗的控制，实现绿色生产。
一、顺酐与DL-苹果酸生产工艺概述顺丁烯二酸酐10g（1.0mol）置于装有磁力搅拌的高压反应釜中 ,加入 H2O 10mL,搅拌下加热至设计温度及压力后保持4h,冷却,将反应混合物过滤 ,得到DL-苹果酸溶液DL-苹果酸合成技术主要有糠醛氧化法、水解法和高温、高压水合法。
苹果酸原料顺酐在溶于水后形成顺丁烯二酸，与水在反应温度110℃以上，反应压力1MPa下反应3h-8h,生成DL-苹果酸、反丁烯二酸（富马酸）及少量未完全参与反应转化的顺丁烯二酸混合物。
其中此过程分两步进行，第一步是顺丁烯二酸在高温高压环境下先异构成反丁烯二酸（富马酸），第二步是反丁烯二酸在与水合为DL-苹果酸。
反应后的混合物在冷却至40℃，经过滤分离出反丁烯二酸晶体，液体经活性炭脱色、树脂柱吸附、真空浓缩、离心分离得到潮品苹果酸，在经精制制得成品苹果酸。
工业化大规模生产主要采用此技术。
生产过程因顺丁烯二酸腐蚀性较强，设备折旧费较高。
同时我国GB25544-2010中规定食品级DL-苹果酸中富马酸（反丁烯二酸）含量要小于1%，部分国家要求富马酸含量≤0.5%，实际生产中很难将富马酸从混合物中去除，造成DL-苹果酸生产纯化成本较高。
1.合成法苹果酸生产的能耗情况合成法苹果酸在生产过程中存在着消耗蒸汽、原料的使用、电耗、导热油的消耗.在一般工业生产中，需要把物料加热到130℃~190℃之间，每日生产200方含量为50%马来酸溶液从30℃加热到180℃需要大约80吨蒸汽，每日浓缩200方质量含量50%苹果酸溶液到达质量含量83%需要消耗蒸汽50吨。
有机酸工艺学-其它有机酸发酵工艺-苹果酸
刘建军等人从土壤中分离出几株直接利用糖质原料生产L-苹 果酸的黄曲霉菌株，经紫外线、亚硝基胍 ,Co60,硫酸二乙脂 等诱变处理、高酸和高渗透压平板分离，获得一株L-苹果酸 高产突变株黄曲霉HA5800，以100g/L的葡萄糖为碳源, 35℃ , 200r/min摇瓶发酵120h,L-苹果酸产率稳定在72g/L以 上，糖酸转化率达74.23%。传代实验证明该菌株产酸性能稳 定
苹果酸的水溶液在Fe2+催化下与H2O2反应生成草酰 乙酸。
苹果酸在三氯化硼催化下，可与醇发生酯化反应， 形成苹果酸酯。
与多元醇，芳香多元羧酸作用，可形成树脂类产品， 如醇酸聚树脂。
苹果酸酯在氨的醇溶液中能形成苹果酸酰胺。
4.2.2.2苹果酸的用途
苹果酸得最大用途在食品加工业，其次在医药行业 和化学工业也有应用。
直接发酵生产苹果酸
中国科学院北京微生物研究所研究了固定化皱褶假 丝酵母(Candida rugosa)的苹果酸生产技术。
福建省三明真菌研究所研究了L-苹果酸的霉菌固体 发酵。
1981年起无锡轻工大学金其荣等，普查了261株各 种曲霉的苹果酸生产能力，并对菌种进行了诱变处 理和发酵最佳条件的探讨，选出了优良菌株黄曲霉 (Aspergillus flavus)UVT3，并在昆山味精厂协作 下完成了500L罐中试，糖酸转化率稳定在68%左右。
其他行业的应用：
苹果酸具有抗氧化和较强的螯合作用，作为保色剂和增效剂， 广泛用于染料工业；
有机酸—苹果酸的发酵生产工艺设计
有机酸—苹果酸的发酵生产工艺设计》报告精细0520 陈思陈姣丽孙鑫冯琪（有机酸的分类：1、柠檬酸柠檬酸是生物体主要代谢产物之一，在自然界中分布很广，主要存在于柠檬、柑橘、菠萝、梅、李、梨、桃、无花果等果实中，尤其以未成熟者含酸量较多。
植物叶子中（如烟叶、棉叶、菜豆叶等）也含有柠檬酸。
柠檬酸在植物体内常与苹果酸、草酸及酒石酸等共同存在。
在动物中，柠檬酸存在于骨骼、肌肉、血液、乳汁、唾液、汗和尿中，或者以游离状态或金属盐类的形式存在。
2、乳酸早在1841年，Boutron和Fremy的记载中就有关于乳酸的生产方法，即是将麦芽或酸乳放入淀粉浆和牛乳中，任其自然发酵，然后逐渐中和而的记载中就有关于乳酸的生产方法，即是将麦芽或酸乳放入淀粉浆和牛乳中，任其自然发酵，然后逐渐中和而产出乳酸。
但是，实际上用工业方法生产乳酸是在1881年开始于美国。
约在1894年，乳酸开始成功地用于皮革和纺织工业，当时美国的生产量折合纯品约为每年5吨。
我国也早就有乳酸盐额度研究和生产。
1944年，重庆振元化学药品厂首先生产乳酸钙，在1955年发表了“乳酸发酵和乳酸钙制造”一文。
该厂以后迁到无锡，改名为无锡第二制药厂，生产乳酸钙。
现在已采用真菌制剂代替砻糠曲的生产工艺，采用大米等为原料，并发行发酵法生产乳酸钙。
3、醋酸醋酸发酵可以说是起源于食醋发酵，而食醋发酵在古代最早只是酿酒受细菌污染的结果，即所谓“酒酸变醋”。
因此醋酸发酵的历史几乎与酿酒一样悠久，可以追溯到一万年以前。
中国的“醋”一词有陈酒之意。
能生产食醋的原料很多，如葡萄、苹果、麦芽、谷物原料、乳清等天然含糖原料皆可。
我国食醋生产的历史非常悠久，现已有多种风味和特色的食醋生产方法。
早先获得醋酸的方法有天然发酵醋的蒸馏和木材的分解蒸馏(所谓“木醋”)。
真正的醋酸发酵应该说是从快速制醋法开始发展起来的，它是现代淋醋工艺的前身。
快速制醋工艺由德国学者舒莱巴赫在1823年首先提出，因此在国外称为“德国工艺”。
苹果酸提取工艺
苹果酸提取工艺
苹果酸提取工艺一般包括以下几个步骤：
1. 苹果酸原料准备：选择新鲜的苹果作为提取原料，并进行清洗和去皮处理。
2. 细胞破碎：采用物理或化学方法将苹果细胞壁破坏，释放出细胞内的苹果酸。
3. 溶剂提取：将破碎的苹果加入溶剂中，例如乙醇或水，进行提取过程。
苹果酸会溶解于溶剂中，而其他成分则较少溶解。
4. 滤渣和浓缩：将提取液通过滤纸或滤网进行过滤，去除固体残渣。
然后，采取适当的方法（如蒸发浓缩）将提取液中的苹果酸浓缩。
5. 结晶和纯化：将浓缩的苹果酸溶液进行结晶处理，使苹果酸成为固态形式。
然后，通过纯化处理，去除杂质和其他有害物质。
6. 干燥和包装：将纯化后的苹果酸进行干燥处理，使其含水量达到一定标准。
最后，将苹果酸进行包装，以便于储存和使用。
需注意的是，具体的提取工艺会根据不同的厂商和产品要求而有所差异。
同时，苹果酸的提取工艺也可通过生物技术方法进行，例如利用微生物发酵生产苹果酸。
苹果酸的制备
苹果酸的制备苹果酸的酶法制备一、苹果酸的酶法制备（一）苹果酸生产1、苹果酸生产机理L-苹果酸在生物体中普遍存在，它作为三羧酸循环的一员而参与细胞代谢。
在一般生物中它只参与循环而不会大量积累，否则会造成代谢流的阻塞。
要想积累苹果酸，必须要有补充4碳酸的途径。
理论上讲，补充4碳酸的途径有两条：乙醛酸循环和丙酮酸羧化支路。
2、苹果酸生产用微生物不同的苹果酸发酵工艺要采用不同的微生物。
一步法发酵工艺采用的微生物有黄曲霉、米曲霉和寄生曲菌；两步法及混合发酵法采用的有华根霉、无根根霉、短乳杆霉、膜醭毕赤酵母等；酶法转化有短乳杆菌、大肠杆菌、产氨短杆菌和黄色短杆菌等。
3、苹果酸发酵工艺L-苹果酸的发酵工艺大体可以分为三类：一步发酵法、两步发酵法和酶法转化。
一步发酵又称为直接发酵，它用糖类为原料，用霉菌直接发酵产生苹果酸。
两步发酵法也是用糖类为原料，先由根霉发酵成富马酸（或富马酸-苹果酸混合物），再由酵母或细菌转化成苹果酸。
酶法转化是用富马酸（盐）或马来酸为原料，用微生物酶（包括全细胞）转化成苹果酸。
发酵方法利用了微生物酶的立体异构专一性，生产的都是L-苹果酸，是生物体内所存在和可以利用的构型。
（一）酶法转化工艺酶法转化工艺相当于两步发酵工艺中的转换发酵。
转换发酵是将第一步发酵生成的富马酸转化成苹果酸；而酶法转化是用富马酸盐（一般是化学合成的）为原料，利用微生物的富马酸酶转化成苹果酸（盐）。
如果转化是以钙盐的形式进行的，则称为“转晶”，即富马酸钙晶体转化成苹果酸钙晶体。
延胡索酸酶+H2O延胡索酸（反丁烯二酸）苹果酸（2－羟基丁二酸）富马酸酶活力短乳杆菌和德氏乳杆菌较好。
短乳杆菌在等体积的麦芽汁和肉汤加l0 g/LCaCO3的培养基，于pH 6和37℃培养3天，作为富马酸酶的来源。
上述用干细胞作为酶制剂的效果虽然很好，但从实际生产观点出发，如果不需要分离细菌细胞，而将底物直接加入短乳杆菌培养液中将是更为方便和经济适用的。
第四节苹果酸
酸味剂:
赋予食品酸味为主要目的的食品添加剂。 有机酸类：柠檬酸、乳酸、酒石酸、苹果
酸、草酸； 无机酸类：食用磷酸、碳酸等。
DL-苹果酸：
白色或结晶状粉末，国外采用化学法生产。
L-苹果酸：(L—Malic acid)
无色结晶，存在于植物或其果实中，发酵法或酶法 生产。
二、历史
•20世纪20年代，发现某些霉菌和酵母可积累L-苹果酸。 •60年代，英美用化学合成法生产L-苹果酸，成本高。
该方法易生成与苹果酸难以分离的琥珀酸。因此，
细胞被固定以后必须经化学试剂处理，以防止这种 副反应的发生。
采用固定化技术必须注意以下几个问题：
细胞被固定前富马酸酶活力要高； 使用的固定化方法对酶的损害较小； 细胞被固定后不应引起副反应的发生； 固定化细胞应有高度的操作稳定性。
（四）两种生产方法的比较：
•1959年，日本利用短乳杆菌（lactabacillus brevis）
产生的富马酸酶催化富马酸转化为L-苹果酸成功。 •60年代以来，各国争相研制一步法从淀粉等糖质原料 生产苹果酸。 •目前，世界上苹果酸的主要产地是日本。
三、生产方法
1. 从果汁中直接抽提法：经济上不合理
2. 化学合成法：产物是DL-苹果酸
3. 发酵法：
（1）一步法 糖类
苹曲霉果酸
（2）二步法
根霉
酵母菌、细菌
糖类 富马酸
苹果酸
4.酶转化法: (常用)
富马酸盐（化学固合定成化细）胞
苹果酸盐
富马酸酶
四、常用菌种
1. 一步发酵法：黄曲霉、米曲霉、寄生曲霉； 2. 两步发酵法：华根霉、无根根霉、短乳杆菌、膜
毕赤酵母； 3.酶转化法：短乳杆菌、大肠杆菌、产氨短杆菌、
l-苹果酸质量标准
l-苹果酸质量标准全文共四篇示例，供读者参考第一篇示例：l-苹果酸，英文名为l-Malic acid，是一种广泛存在于自然界中的有机酸，常见于水果和植物中。
l-苹果酸是苹果和其他水果中的主要成分之一，具有许多重要的生物学功能和应用价值。
在食品工业中，l-苹果酸被广泛用于调味剂、酸味剂、抗氧化剂和蓄电剂等方面。
为了确保l-苹果酸的质量和安全性，各国纷纷制定了相应的质量标准，以规范l-苹果酸的生产和使用。
一、l-苹果酸的生产l-苹果酸可以通过化学合成和生物发酵两种方式生产。
化学合成主要采用马来酸和乳酸为原料，经过一系列的反应制得l-苹果酸。
而生物发酵则是通过细菌或真菌发酵产生l-苹果酸，这种方法更环保和可持续，受到越来越多生产商的青睐。
1.外观：l-苹果酸应为无色晶体或结晶性粉末，无明显杂质。
2.纯度：l-苹果酸的纯度应在99.0%以上，水分含量应在2.0%以下。
3.重金属：l-苹果酸中不得检出铅、镉、汞等重金属及其化合物。
4.微生物指标：l-苹果酸中不得含有大肠杆菌、霉菌和酵母菌等微生物。
5.残留溶剂：l-苹果酸不得使用禁用的有机溶剂进行生产，且不得检出有机溶剂残留。
6.其他有害物质：l-苹果酸中不得含有对人体有害的物质，如重金属离子、农药残留、放射性物质等。
1.食品工业：l-苹果酸是一种天然有机酸，被广泛用于食品工业中作为酸味剂、酸度调节剂和防腐剂等，能够改善食品的口感和保质期。
2.医药工业：l-苹果酸具有抗氧化、抗菌和抗病毒等生物活性，被用于医药工业中制备药品或保健品。
3.化妆品工业：l-苹果酸被广泛添加在化妆品中，具有保湿、抗氧化和美白等功效，能够改善肌肤质地。
l-苹果酸虽然被认为是一种相对安全的食品添加剂，但过量摄入也会对健康造成影响。
长期大量食用l-苹果酸可能会引发食道炎、肠胃炎等消化系统疾病，应注意适量食用。
第二篇示例：l-苹果酸是一种常见的有机酸，具有多种生物活性和医疗应用价值，广泛应用于食品添加剂、医学和农业领域。
苹果酸的生产及应用
苹果酸的生产及应用(总3页)--本页仅作为文档封面，使用时请直接删除即可----内页可以根据需求调整合适字体及大小--苹果酸的生产与应用【摘要】介绍了苹果酸的生产及实际应用。
【关键词】苹果酸、生产、应用1、前言苹果酸，学名为α-羟基丁二酸或羟基唬拍酸, 是一种无色或微黄色粉状、粒状或结晶状固体，无臭，略带有刺激性爽快酸味。
易溶于水，微溶于究竟或醚，吸湿性强，保存时易受潮。
[1]苹果酸广泛存在于多种水果中, 因其在苹果中的含量最高而得名。
苹果酸的分子式为C4H6O5, 由于苹果酸分子中有一个不对称碳原子, 故有L 一型苹果酸、D 一型苹果酸和DL一型苹果酸之分。
自然界中广泛存在的是L一型苹果酸。
近年来随着食品工业、医药工业、化学工业的迅速发展, 国内外市场对苹果酸的需求量越来越大。
[2]2、合成方法生产苹果酸可分为化学合成法和发酵法两种方法。
所不同的是, 发酵法生产利用了微生物酶的立体异构专一性, 生产的都是L一型苹果酸, 是生物体内所存有和可以利用的构型。
而合成法只能生产DL一苹果酸, 如果用于食品和药物, 则有一半不能得到利用。
因此,在苹果酸生产上,发酵法占有主导地位。
[3] 目前正在研究开发的发酵法生产L-苹果酸的工艺主要有三类：一是一步发酵法，又称直接发酵法，即采用一种微生物直接发酵糖质原料或非糖质原料生成L-苹果酸。
利用淀粉质原料生产L-苹果酸的微生物目前主要有：黄曲霉、末曲霉、寄生曲霉等，这些菌株大多具有糖化淀粉的能力，可以直接利用淀粉质原料，原料来源十分丰富，发酵工艺条件温和，产品成本低，因此一步发酵法与其他方法相比更具有优势。
目前我国通常采用直接发酵法生产苹果酸，工艺流程如下：培养基配置→灭菌→接种→发酵→酸解→过滤→中和→过滤→酸解→过滤→精制→真空浓缩→结晶→干燥→包装→成品二是两步发酵法，即采用两种不同功能的微生物，其中之一是先将糖质或其他原料发酵成富马酸，另一种微生物将富马酸转化成L-苹果酸。
苹果酸合成工艺方程式
苹果酸合成工艺方程式
苹果酸是一种常见的有机酸，化学式为C4H6O6。
它可以通过多
种途径合成，其中一种常见的合成工艺是通过己二酸和乙烯制备苹
果酸的工艺方程式如下：
1. 首先，己二酸（化学式：C6H10O4）与乙烯（化学式：C2H4）在催化剂存在下发生酯化反应，生成己二酸乙酯和水，化学方程式
如下：
C6H10O4 + C2H4 → C10H18O4 + H2O.
2. 然后，己二酸乙酯与过氧化氢在催化剂存在下进行氧化反应，生成苹果酸和乙酸，化学方程式如下：
C10H18O4 + H2O2 → C4H6O6 + CH3COOH.
这就是通过己二酸和乙烯合成苹果酸的工艺方程式。
这个合成
工艺是工业上常用的方法之一，能够高效地生产苹果酸。
当然，还
有其他合成苹果酸的方法，但以上所述的是其中一种常见且有效的
工艺方程式。
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苹果酸的酶法制备
一、苹果酸的酶法制备
（一）苹果酸生产
1、苹果酸生产机理
L-苹果酸在生物体中普遍存在，它作为三羧酸循环的一员而参与细胞代谢。
在一般生物中它只参与循环而不会大量积累，否则会造成代谢流的阻塞。
要想积累苹果酸，必须要有补充4碳酸的途径。
理论上讲，补充4碳酸的途径有两条：乙醛酸循环和丙酮酸羧化支路。
2、苹果酸生产用微生物
不同的苹果酸发酵工艺要采用不同的微生物。
一步法发酵工艺采用的微生物有黄曲霉、米曲霉和寄生曲菌；两步法及混合发酵法采用的有华根霉、无根根霉、短乳杆霉、膜醭毕赤酵母等；酶法转化有短乳杆菌、大肠杆菌、产氨短杆菌和黄色短杆菌等。
3、苹果酸发酵工艺
L-苹果酸的发酵工艺大体可以分为三类：一步发酵法、两步发酵法和酶法转化。
一步发酵又称为直接发酵，它用糖类为原料，用霉菌直接发酵产生苹果酸。
两步发酵法也是用糖类为原料，先由根霉发酵成富马酸（或富马酸-苹果酸混合物），再由酵母或细菌转化成苹果酸。
酶法转化是用富马酸（盐）或马来酸为原料，用微生物酶（包括全细胞）转化成苹果酸。
发酵方法利用了微生物酶的立体异构专一性，生产的都是L-苹果酸，是生物体内所存在和可以利用的构型。
（一）酶法转化工艺
酶法转化工艺相当于两步发酵工艺中的转换发酵。
转换发酵是将第一步发酵生成的富马酸转化成苹果酸；而酶法转化是用富马酸盐（一般是化学合成的）为原料，利用微生物的富马酸酶转化成苹果酸（盐）。
如果转化是以钙盐的形式进行的，则称为“转晶”，即富马酸钙晶体转化成苹果酸钙晶体。
延胡索酸酶
+H2O
延胡索酸（反丁烯二酸）苹果酸（2－羟基丁二酸）
富马酸酶活力短乳杆菌和德氏乳杆菌较好。
短乳杆菌在等体积的麦芽汁和肉汤加l0 g/LCaCO3的培养基，于pH 6和37℃培养3天，作为富马酸酶的来源。
上述用干细胞作为酶制剂的效果虽然很好，但从实际生产观点出发，如果不需要分离细菌细胞，而将底物直接加入短乳杆菌培养液中将是更为方便和经济适用的。
（二）固定化细胞转化工艺
富马酸向L-苹果酸的转化只牵涉一步酶催化反应，因此只要把富马酸酶提取出来，固定到载体上，就可以利用固相酶反应柱连续生产L-苹果酸。
但实际上酶的提纯手续复杂，
酶的回收率低，成本高。
固定细胞法与固定酶法相比，具有下述优点：
A、不需要进行酶的抽提和纯化；
B、与酶提纯过程相比，细胞固定过程中酶活力的保存率较高；
C、酶的光学活性较高；
D、成本低
但是，固定化细胞的缺点是有副反应存在，特别是易于生成琥珀酸，这在产品中很难与苹果酸分离。
幸运的是，细胞固定之后采用一些化学试剂处理可以排除上述副反应。
1、产氨短杆菌细胞固定与苹果酸生产
产氨短杆菌是用于固定化细胞生产L-苹果酸的最好菌种之一，下面以产氨短杆菌为例介绍固定化细胞生产方法。
产氨短杆菌培养基（%）：
葡萄糖 2 富马酸0.5
玉米浆 1 尿素0.2
KH2PO40.2 MgSO4·7H2O 0.05
pH7.0
细胞在30℃，好氧培养20～24h后，用高速离心机收离菌体，再将细胞悬浮于生理盐水中，再用聚丙烯酰胺凝胶包埋，方法如下：
对于16mL悬浮液，加入丙烯酰胺3g，N，N`-甲叉丙烯酰胺0.16g，5%β-二甲基胺丙腈水溶液2mL及1%过硫酸钾水溶液2.0mL，于25℃静置10min。
将形成的凝胶切成3mm 大小的小块。
这种制备好的固定细胞直接使用会有副反应，产生琥珀酸，它在产品中很难与苹果酸分离。
工业上，胆汁处理法最为适用。
将固定化产氨短杆菌凝胶块装到酶反应柱中进行连续操作的情况下，当lmo1/Ll的富马酸钠溶液（pH7.0）以0.25h-的稀释速率流过反应柱时，在37 ℃稳定状态下约有80%富马酸转化成了L-苹果酸。
固定化细胞反应柱的富马酸酶稳定性与操作温度有关。
采用37℃操作温度，反应柱的半衰期约为55天。
2、黄色短杆菌细胞固定与苹果酸生产
黄色短杆菌等富马酸酶活力较高。
上述细菌细胞用卡拉胶固定效果更好。
卡拉胶也称角叉菜胶，固定方法如下：
8g（湿重）黄色短杆菌细胞悬浮在8mL生理盐水（45℃）中，将1.5g卡拉胶溶在34mL 生理盐水中，两者在约50℃混合，冷至约l0℃维持30min。
为了增加凝胶强度，再将它浸在250mLl0.3mol/L的KCl溶液中，在10℃维持4 h。
这样处理以后，用刀将形成的较坚硬凝胶切成3mm大小的小块。
为了增加富马酸酶活力和抑制琥珀酸生成，固定后的凝胶块要用含0.3%胆汁和1mol/L富马酸钠的溶液，于37℃下静浸20h。
3、酵母细胞固定与苹果酸生产
（1）材料
活化的酵母细胞、0.05%的CaCl2溶液、海藻酸钠溶液。
（2）操作步骤
1）海藻酸钠溶液配制
取0.7g海藻酸钠，放入50ml小烧杯中，加入10ml水，用酒精灯加热，边加热边搅拌，将海藻酸钠调成糊状，直至完全融化，用蒸馏水定容至10ml。
（注意：加热时要用小火，或者间断加热，反复几次，知道海藻酸钠溶化为止。
）
2）海藻酸钠溶液与酵母细胞混合
将溶化好的海藻酸钠溶液冷却至室温，加入已活化的酵母细胞，进行充分搅拌，使其混合均匀，在转移至注射器中。
3）固定化酵母细胞
以恒定的速度缓慢的将注射器中的溶液滴加到配置好的CaCl2溶液中，观察液滴在CaCl2溶液中形成的凝胶珠的情形。
将这些凝胶珠在CaCl2溶液中浸泡30min左右。
4）用固定化酵母细胞进行转化生产
将固定好的酵母细胞（凝胶珠）用蒸馏水冲洗2~3次。
将转化底物配制成一定的溶液，移到三角瓶中，在加入固定好的酵母细胞，封口，转化24h。
（三）苹果酸的提取和精制
1、苹果酸的提取
通常也采用钙盐法进行提取。
2、苹果酸的精制
苹果酸的精制一般采用离子交换和活性炭联合处理法。
3、苹果酸结晶
对于含杂质很少的高纯度苹果酸溶液：只要茬低于70℃下减压浓缩，使浓度达到65～80%，再冷却到20℃，添加晶种，就能获得高纯度苹果酸结晶。
苹果酸晶体的干燥要求在真空条件下进行，温度控制在40～50℃。
干燥后要立即包装，不能长期暴露在湿空气中，否则它易于吸潮而潮解，尤其是L-苹果酸更易潮解。
二、苹果酸的检测
（一）定性检验
1、三氯化钛法
在试管中加入约5mL待试溶液，滴入3滴15%TiCl3溶液，在几分钟内出现白色沉淀，表明有苹果酸存在。
如果气温太低，可将试管握在手中温热，但不能在灯焰上加热，因为煮沸时柠檬酸溶液也有类似反应，生成白色沉淀。
这种方法也可以定性草酸，因为草酸溶液在这种情况下显示典型的黄色。
这种方法苹果酸的最低检出浓度为0.5g/L。
在有其他有机酸、无机酸或糖存在时，最
低检出浓度有所变化。
2、美国药典法
取样约5g，溶解于lmL lmol/L硫酸中，加lmL0.0003%的2-萘酚硫酸溶液，混匀。
溶液具有蓝色荧光，透射光呈淡黄色。
3．纸层析法
取新华5号层析滤纸，裁成15×20cm。
点样线距底边2cm，点样间距2cm，点样量2μL。
展开剂：正丁醇：85%甲酸：水=5：5：l。
展开剂平衡3h，然后放入点好样的滤纸，按上行法展开，展开时间约需3h。
显色剂：0.2%溴甲酚绿喷雾，有机酸显黄色斑点。
也可以用混合显色剂（0.2%溴甲酚绿：0.05%甲基红：0.5mol/1NaOH=l：1：0.15）喷雾显色，有机酸呈桔红色斑点，很明显。
各种酸的Rf值见表3-1。
控制纸层析斑点圆正度的关键除了正确选择滤纸和展开剂外，还要控制展开剂的平衡时间。
采用本方法时，平衡时间以3h为宜。
时间过短斑点横向扩散，过长则纵向扩散，甚至拖尾。
展开剂配制好后存放8～l0h以上已经出现分层现象，不再能使用。
（二）定量检验
1、酸碱滴定法
取约2g苹果酸，精密称定。
在一只三角瓶中溶于40mL新沸过的冷水中，加入酚酞指示剂，用lmol/LNaOH滴定至开始出现粉红色（持续时间不低于30s）。
lmL lmol/LNaOH溶液相当于67.04mg C4H6O5。
2、紫外分光光度法
试剂：（1）硫酸96%，分析纯，不含硝酸盐。
（2）2，7-萘二酚溶液：lg 2，7-萘二酚溶于l00mL96%硫酸中。
操作：取lmL样品溶液（苹果酸浓度控制在0.05～0.8mg/L）加入6mL试剂（1）中，加入0.1 mL试剂（2），在100℃下水浴加热15～20rain，冷至接近室温后，在385nm紫外光下比色测定。
同时以空白水样同法处理，作仪器调零之用。
用纸层析定性后的样品，将显色斑点剪下，用lmL水洗脱，也可采用此法测定。
根据上述在385nm下测得的吸光度值，可以从标准曲线上查得苹果酸含量。