胶体金免疫层析试纸条快速检测玉米细菌性枯萎病菌

摘要
本文采用胶体金免疫层析技术成功建立了玉米细菌性枯萎病菌试纸条快速检测法 。 条件优化
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后的试纸条用于玉米细菌性枯萎病菌的检测 , 方法的检测限为 10 c fu /mL, 其灵敏度与双抗夹心 EL ISA 检测 方法相当 ; 交叉试验结果表明 , 该试纸条对玉米细菌性枯萎病菌有良好的特异性 。本方法可作为玉米细菌 性枯萎病菌日常监测的现场筛查手段, 具有简便 、 快速 、 成本低廉 、 便于普及等优点 , 对保障我国农产品安全 具有重要的现实意义。 关键词 玉米细菌性枯萎病菌 ; 免疫层析技术; 胶体金 ; EL ISA; 灵敏度; 特异性 ; 中图分类号 K392 . 11 ; S435 . 131 A Colloidal Gold- Based Imm unochro m atograph ic S trip for Rap id D etection of E rwinia stewartii subsp. S tewartii Q i L ing ling , Jin Yong , Zou M ingqiang , L iang Chizhou , T ia n Shi m in , Chen Yan , L iW e ihua (1 . Ch in ese Academ y of Inspection and Quarant in e , Be ijing 100123 ; 2 . Institute of B io lo g ical T echno logy of Shanx i University ; 3 . Shanx i Ex it- Entry Inspect io n and Quarantin e Bureau) A bstract : A collo id al gold- based i mm unochrom atograph ic strip w as developed fo r th e detection o fE r w inia stew ar tii subsp . stew artii. The detect io n li m it o f the strip w as 106c fu /mL. The sensitiv ity w as si m ila r to the doub le ant i bodies sandw ich EL ISA. No cross- reaction w ith the other strains w as found, ind icat ing good spec ific ity o f this str ip . As a rap id and conven ie nt m ethod for the de tect io n E rw inia stew artii subsp . Stewartii , the deve lo pm ent o f i m unochrom atog raph ic strip has practical sig nificance for agricu ltural and food safety m . K eywords : Erw inia ste w artii subsp . Stewartii; I mm unochrom atograh ic strip ; Go ld nanoparticles ; EL ISA; Sensitiv i ty ; Specificity 1 前言 玉米 细菌性枯 萎病菌 ( E r w inia stewartii subsp. stew artii) 是一种革兰氏阴性细菌 , 该细菌引起的枯 萎病是玉米生产上重要的病害之一 , 尤其对甜玉米 的损坏巨大, 严重时可造成绝产
[ 1ຫໍສະໝຸດ Baidu]
。玉米细菌性枯
萎病最早发生于美国 , 后来扩散到加拿大、 黑西哥、 前苏联、 意大利、 泰国、 马来西亚等地。我国目前尚 未发现和证实玉米细菌性枯萎病的发生
[ 2]
, 作为一种快速、 特异、 简便且适于现场监控和
大规模样品筛查检测方法 , 它已被广泛应用于生物 学检测。本文研制了玉 米细菌性枯萎 病菌检测的 胶体金免疫层析试 纸条, 特异 性好, 灵 敏度与酶联 免疫检测法相当 , 而且成本低廉 , 操作简便 , 适于细 菌性枯萎病菌 的现场快速筛查 , 对尽早发 现疫情, 及时进行检疫处理, 从而降低细菌传入风险具有重 要意义。 2 材料与方法 2 . 1 试剂 氯金酸、 柠檬酸三钠、 羊抗 鼠 IgG、 牛血清白蛋
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荡反应 15m in 。用酶标仪检测 OD520nm 值。 2 . 4 . 3 最佳抗体浓度的确定 将玉米细 菌性 枯萎 病菌 单 抗 2F5 稀 释至 0 . 2 m g /mL, 用 0 . 1m ol /L K2 CO3 调节胶体金溶液 p H值 至 8 . 5 。按表 2 加入试剂 , 振荡反应 30m in 后 , 分别 加入 10 % N aC I溶液 20 L, 振荡反应 15m in 。用酶 标仪检测 OD520nm 值。 表 2 胶体金标记抗体最佳浓度的测定
[ 1] 1, 2 1 1 1 1 1 3
能作为专 业技术 人员 在实验 室使 用的 标准方 法。 因此, 这些方法均难以实现现场检测。胶体金免疫 层析技术是 20 世纪 80 年代在酶联免疫吸附试验、 乳胶凝集试验、 单克隆抗体技 术、 胶体 金免疫技术 和新材料技术基础上发展起来的一种 免疫分析技 术
, 但该病
在我国大部分地区都适合发生 , 一旦定殖将可能很 快暴发流行, 传入风 险很高, 已 列为我国进境 一类 检疫对象。 目前 , 玉米细菌性枯萎病菌的检测方法主要有 分离培养检测 测
[ 6~ 10] [ 3]
、 酶联免疫检测
[ 4, 5]
、 分子生物学检
等。分离培养检测和酶联免疫检测 虽然不
V o. l 20 N o. 1 2010年第 1 期
白 ( BSA ), 均购自美国 Sigm a 公司; 玉米细菌性枯萎 病菌单抗 2F5 , 由北京大学提供; 玉米细菌性枯萎病 菌多抗, 由本实验制备; 营养琼脂、 营养肉汤、 缓冲蛋 白胨水, 购自北京陆桥技术有限责任公司 ; 其他化学 试剂均为分析纯; 硝酸纤维素膜 ( NC 膜 ) 、 玻璃纤维 膜、 吸水纸、 PVC 板, 均为美国 M illip ore 公司产品。 2 . 2 仪器 微波合成 仪, 购自北 京祥 鹄科 技 发展 有限 公 司; 三维喷膜仪、 CM 4000 切条 机, 购 自美国 B ioDot 公司 ; Sunrise 酶标仪, 购自德国 TECAN 公司 ; 3K30 型高速冷冻离心机 , 购自 Sigm a 公司。 2 . 3 菌株及培养条件 本研究所用菌株见表 1 。菌株经缓冲蛋白胨水 复苏 , 营养肉汤增菌 48 h 后 , 菌体浓度约为 10 cfu / mL (梯度稀释平板计数法 )。菌悬液于 1 . 5mL Ep pendorf管 ( 1mL /管 ) , 10000rpm, 离心 7m in ( 4 ), 弃上 清, 沉 淀用 PBS ( 0 . 01 M, p H7 . 4 ) 洗涤 3 次, - 20 保存备用。 表 1 供试菌株
* 注 : CGM CC : Ch ina G eneral M icrob iological C ulture Col lect ion C en ter ATCC: Am erican Type Cu lture C ollection Cen ter CAA S: Plan t P rotection Inst itu te of CA AS
需贵重的检测仪器 , 但操作繁琐, 耗时较长; 分子生 物学检测方法灵敏度较高 , 但需要 贵重的仪器 , 只
项目基金 : 中国检科院科研项目 ( 2008 J K 017) ; 质检公益性行业科研专项 ( N o. 10- 47) 。
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J OU RNAL O F I N SPECTION AND QUARA NTI N E 检验检疫学刊
C lav iba cter m ichigan ensis su bsp. m ich iganensis CGM CC 1 . 1909 C lav ibacter m ich iganensis subsp. n ebraskensis C lav ibacter m ich iganensis subsp. sep edon icu s Er w inia ca rotovora subs p. carotovoraborgey Erw in ia stewa rtii s u bsp. ste w artii P seudom onas s yringa e pv . s yringa e X anthom onas campestris pv. holcicola ATCC 27822 CAA S 12057 CAA S 12104 ATCC 8200 CAA S 12056 CGM CC 1 . 1530
序号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 菌株名称 Ac idov orax avenae subs p. avenae C lav ibacter f ang ii Clavibac ter m ich iganensis subs p. in sid ios us 菌株来源编号 * CGM CC1. 1726 CGM CC 1 . 2000 CGM CC 1 . 1908
试剂 1 胶体金 ( L) 抗体 ( L ) 超纯水 ( L) 2 3 4 5 试验孔 6 7 8 9 10 11
200 200 200 200 200 200 200 200 200 200 200 0 10 1 9 2 8 3 7 4 6 5 5 6 4 7 3 8 2 9 1 10 0
2 . 4 . 4 金标抗体的制备 用 0 . 1m o l /L K 2 CO3 调节 10 mL 胶体金溶液 p H 值至 8 . 5 。搅拌条件下, 将最适抗体量缓慢加入胶 体 金 溶 液 中 , 室 温 反 应 30 m in , 加 入 10 % BSA 600 L 封闭 30m in, 12000 r /m in 离心 30m in , 弃上 清 , 沉 淀 物 用 1m L TBS ( T ris - H C l 0 . 01 m o l/L、 0 . 02 % N aN3、 1 % 蔗糖、 1 % BSA ) 混悬, 4 避光保存 备用。 2 . 4 . 5 免疫层析试纸条的组装 样品垫、 结合垫 (含金标抗体 , 干燥 )、 硝酸纤维 素膜 (检测线: 玉米细菌性枯萎 病菌多抗 1mg /mL; 质控线 : 羊抗鼠 1m g /mL ) 、 吸水垫依次贴在带有粘 合剂的 PVC 背板上, 切成 4mm 宽的试纸条, 室温干 燥备用。 2 . 5 灵敏度测定 取 1mL 菌悬液, 用样品稀释液 ( 0 . 1 M T ris , 1 % Tw een20)进行 10 倍稀释, 共稀释 9 个稀释度 , 用试 纸条进行检测, 同时设 PBS 为空白对照。 2 . 6 特异性的测定 对表 1 中的菌株, 按 2 . 5 所述方法进行检测。 2 . 7 模拟阳性样品检测
2010年第 1期 V o. l 20 N o. 1
检验检疫学刊 JOURNA L OF I N SPECT I ON AND QUA RANT I NE
胶体金免疫层析试纸条快速检测玉米细菌性枯萎病菌
齐玲玲
1, 2
金涌
1
邹明强
北京
1
梁赤周
1
田世民
1
陈艳
1
李卫华
3
(1 . 中国检验检疫科学研究院
100123; 2 . 山西大学生物技术研究所 ; 3 . 山西出入境检验检疫局 )
2 . 4 免疫层析试纸条的制备 2 . 4 . 1 胶体金的制备 采用改良的柠檬酸三钠还原法
[ 12]
, 其过程 为:
在搅拌条件下 , 98 mL 去离子水加热至 65 后, 加入 1 mL 1% 的氯金酸, 继续加热, 待温度上 升至 95 时, 加入 1mL 1 % 的柠檬酸三钠 , 当溶液呈酒红色时 停止加热 , 冷却后, 4 避光保存。 2 . 4 . 2 最适 p H 值的确定 取 200 L 胶体金溶液 , 用 0 . 1m o l/L K 2 CO3 溶 液将 p H 值分别 调至 7. 0、 7 . 5 、 8 . 0 、 8 . 5 、 9. 0 、 9 . 5 。 然后分别加入单抗 0 . 2mg /mL 2F5 10 L, 振荡反应 30m in 后 , 再分别加 10 % NaC l溶液 20 L, 继续振 2