荧光细胞化学样品制备和检测技术详解演示文稿

甲醛（40%） 无水磷酸氢二钠 磷酸二氢钠 蒸馏水
100ml 6.5g 4.0g 900ml
单纯固定剂
（2）乙醇固定液：使用时以80%-95%的浓度为宜，具有硬化、固定、脱水等作用，对组织渗 透力较弱，因此很少单独使用，但其保存组织中的核酸强于中性甲醛，故常用于有核酸操 作的实验或检查，如果用于证明尿酸结晶和保存糖原，可用于100%乙醇固定组织。
包埋步骤 先将熔化的石蜡注入包埋托内，而后用镊子将经过浸蜡的组织块从脱水盒中取出，放入包埋 托中央，放在小冷台商，用镊子轻按组织块，以达到组织块平整，盖上脱水盒底，再加好 石蜡，移至冷冻台上，待冷冻好后，卸下组织蜡块待切。包埋时应根据组织的不同，选择 大小型号合适的包埋托；有要求直立包埋的组织要用镊子将组织固定在蜡块中央稍停片刻， 以使组织组织在蜡凝时立住，达到立埋的要求。
浓度／温度 ４％
８０％ ９０％ ９５％
体积比为１：１
６０℃ ６０ ℃ ６０ ℃
时间设定 ３．００ｈ １．００ｈ １．００ｈ
过夜 ２．００ｈ ２．００ｈ ３０ｍｉｎ ３０ｍｉｎ １．００ｈ １．００ｈ １．００ｈ １．００ｈ
包埋
组织块经过固定、脱水、透明、浸蜡等处理后，用包埋剂（如石蜡、树脂、塑料等）将其包制 成含组织块的蜡块或塑料块等的过程称为包埋。
是禁用的； （3）不要用可能带有自发荧光的固定剂，如带有苦味酸的固定剂，还有甲醛升汞固定液，会
使上皮细胞产生非特异性荧光； （4）固定剂的选择、固定时间、温度和PH值都会影响实验结果。
单纯固定液
（1）4%中性甲醛固定液：最常用的固定液，能满足常规HE及免疫组化、PCR等工作。中性 甲醛是以PH7.2-7.4的磷酸缓冲液为溶剂配制的，其固定效果及对组织抗原性的保存均优 于一般的4%甲醛固定液。此固定液配制后应密封并保存在阴凉处，保存时间不超过一个 月。
切片
石蜡切片 其优点是组织结构保存良好，在病理和回顾性研究中有较大的实用价值，能连续切片（薄片），
组织结构清晰，抗原定位准确。 用于免疫组织化学技术的石蜡切片制备与常规制片略有不同，主要是要在比较低的温度下进行。 ①脱水、透明等过程应在4℃下进行，以尽量减少组织抗原的损失； ②组织块大小应限于2cm x 1.5cm x 0.2cm，使组织充分脱水、透明、浸腊； ③浸腊、包埋过程中，石蜡应该保持在60℃以下，以熔点低的软腊最好（低温石蜡包埋）； ④石蜡切片应放在37℃恒温箱过夜，这样烤片可减少染色中脱片现象。切片如需长期贮存，
荧光的性质
吸收光，必需有激发光源 荧光波长＞激发波长（损失热能） 荧光强度极小于激发光的强度 有不同程度的衰减 荧光强度取决于激发光强度、被检物浓度、荧光效率
荧光显微镜的优点和用途
优点：
检出能力高（放大作用） 对细胞的刺激小（可以活体染色） 能进行多重染色 用途： 物体构造的观察——荧光素 荧光的有无、色调比较进行物质判别——抗体荧光等 发荧光量的测定对物质定性、定量分析
细胞标本的取材 （1）贴壁生长的培养细胞 （2）悬浮的培养细胞：
沉淀涂片，细胞离心涂片器（cytospin）， 载玻片上涂粘附剂—多聚赖氨酸（0.01~0.5%），
甲醛-明胶，铬矾明胶， Vectabond试剂 （3）体液沉淀涂片法 （4）穿刺吸取涂片法 （5）印片法
组织脱水
试剂 中性缓冲甲醛
乙醇 乙醇 乙醇 无水乙醇Ｉ 无水乙醇ＩＩ 二甲苯－无水乙醇 二甲苯Ｉ 二甲苯ＩＩ 石蜡 石蜡 石蜡
无水乙醇 60ml
氯仿
30ml
冰醋酸
10ml
混合固定液
（5） Zenker固定液：经此液固定的标本，细胞核和细胞质染色颇为清晰，但成本较高且需 特殊处理汞。该固定液要避免接触阳光，以免引起化学变化而失效。
升汞
5.0g
重铬酸钾
2.5g
硫酸钠
1.0g
蒸馏水（加至）
100ml
取材
组织取材：按病理诊断和研究的目的和要求，从标本上切取适当大小和数目的组织块，供后续 制片和显微镜下观察用于诊断以及相关研究。
切片
冰冻切片 为免疫组织化学染色中最常用的一种切片方法。其最突出的优点是能够比较完好地保存多种抗
原的免疫活性，尤其是细胞表面抗原更应该采用冰冻切片。新鲜的组织及已经固定的组织 均可作冰冻切片。 冰冻切片后如果不染色，必须吹干，贮存于低温冰箱内，或进行短暂预固定后贮存于冰箱中保 存。 要注意刀片等接触阳性物质的污染问题。
（3）4%多聚甲醛固定液：主要用于培养细胞的固定。
混合固定液
（1）乙醇-甲醛（乙醇-福尔马林，AF）固定液：适用于皮下组织中肥大细胞的固定。该固定 液有固定兼脱水作用，固定后的标本可直接入95%乙醇脱水。
甲醛（40%） 100ml
95%乙醇
900ml
（2）B5（醋酸钠-升汞-甲醛）固定液：多用于固定淋巴组织。染色前应进行脱汞沉淀处理。
无水醋酸钠
1.25g
升汞
6.0g
蒸馏水
90ml
使用前加入甲醛 10ml
混合固定液
（3）Bouin固定液：特别适用于睾丸活检组织的固定。Bouin液对组织固定较均匀，收缩很 少，不会使组织变硬变脆。需现配现用。
饱和苦味酸水溶液（约1.22%）
75ml
甲醛
25ml
冰醋酸
5ml
（4）Carnoy固定液：穿透能力强，可很好的固定细胞质和细胞核，特别适用于固定外膜致密 的组织，也适用于糖原及尼氏小体的固定。
标本制作的顺序
组织固定、取材、组织脱水、包埋、切片、染色、封片 培养的ຫໍສະໝຸດ Baidu浮细胞、粘附细胞
组织固定
活体组织一旦停止血液循环和物质代谢就会因物质代谢障碍产生一系列的生物化学和组织学改 变，并导致形态学上可见的细胞器变化和细胞组织的形态改变直至腐败自溶。
选择最佳固定液标准是： （1）最好地保持细胞和组织的形态结构； （2）最大限度地保存抗原的免疫活性。一些含重金属的固定液在免疫组化和细胞化学技术中
荧光细胞化学样品制备和检测技术详解演示文稿
优选荧光细胞化学样品制备和检测技术
落射荧光与透射光观察的区别
落射荧光与透射光观察的区别
什么是荧光 ?
• 物质中的电子吸收光的能量由低能状态转变为高能状态，再回到低能状态时释放出的光，是非温度 辐射光——冷光。即：物质吸收短波光，发射出的长波光。
• 显微镜荧光利用光源激发——光化荧光