循环肿瘤细胞(CTC)检测在肺癌中应用

10.9 Months
>5 CTCs n=87 (49%)
21.9 Months
2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30
Time from Baseline (Months)
2004 获得美国 FDA批准用于
临床 1999-2003 大量
临床实验建立
CellSearch与CTC
分析结果并出具报告单
• 若患者血液样本中CTC细胞≤cut off值，我们将附上CTC细胞图 ； • 若患者血液样本中CTC细胞≥cut off值，我们只截取其中五个CTC细
胞图作为代表 。
每周二、周五开始检测，报告将于检测后3个工作日内发送。 请注意采血时注意样本保质期（96h），选择合适的采血时间。
肿瘤细胞作为生物标志物
• 外周血和肺静脉血中的循环肿瘤细胞（CTCs）
– 临床意义:
• 转移的辅助标志物？ • 可以预测治疗？ • 预后因子？ • 最小损伤的突变检测?
获取CTC需要解决的技术问题
每10mL血液中可能仅含有几个到几十个 循环肿瘤细胞，而10mL血液中含有的白
细胞约有1亿个，红细胞有500亿个。
的治疗效果。
目前，检测EGFR的基因型需要选取
2
患者的肿瘤组织，找到一种非侵入
性的方法检测EGFR迫在眉睫。
3
验证能否在CTC中检测EGFR的基因 型，且与药物疗效相关。
CTC中EGFR突变与肿瘤组织中EGFR突变的一致 性（SARMS方法）
➢CTC中EGFR基因型有17个与肿瘤组织中的一样，准确率为94%，
鳞癌中periCTC和pvCTC的数量明显高于腺癌
N Engl J Med 2008;359:366-77. Detection of Mutations in EGFR in Circulating Lung-Cancer Cells
背景
吉非替尼是较好地治疗非小细胞肺癌的靶
1
向药物，但是EGFR的基因型决定了药物
小细胞肺癌患者活检组织及相对应的CTC中的CD56
活检组织中的CD56和CTC中的CD56表达具有一致性
肺癌组织 肺癌肝转移组织
Baseline blood CATCC
肿瘤细胞
a, monosomy 6p11-q12; b, amplification EGFR, cMYC; EGFR (red) 5.p15.3 (green), 6p11-q12 (aqua), c-MYC (yellow). c, trisomy CEP3 and monosomy CEP17; d, polysomy CEP3, CEP7, CEP17 and 9p21.3. CEP3 (red), CEP7 (green), CEP17 (aqua), 9p21.3 (yellow).
90年代中期开始的临床相关数据
摸索捕获、分析
CTC的方法
2010.1 中国 CTC在
2009 Cleveland
复发转移乳腺癌上的
Clinic十大医学突破第 应用注册实验
一名
2011.5 CTC在小细胞
2009 Prix Galien USA 肺癌上的应用实验研
最佳医学技术奖
究
……
1983 磁流体
J Clin Oncol. 2011 Apr 20;29(12):1556-63. Epub 2011 Mar 21.
CTC数量与病情进展的关系
CTC数量 影像学肿瘤 变化
➢吉非替尼治疗后CTC数量下降，伴随着疾病进展CTC数量也随之上升。 ➢肿瘤大的患者CTC数量比肿瘤小的患者多。
结论
检测CTC中EGFR的基因型与组织中检测结果高度符合 CTC数量与疾病进展密切相关
可以通过CTC来检测非小细胞肺癌患者肿瘤的基因型
2005年 N Engl J Med， Cristofanilli证实治疗前 CTC数目是转移性乳腺癌 患者无进展生存期和总生 存期的独立预测因子。
原发肿瘤血管 生成侵润
侵入血管内 凋亡的CTC
循环肿瘤细 胞（CTC）
循环肿瘤 微栓
（CTM）
上皮－间质 转化
（EMT）
侵润
转移
肿瘤细胞 扩增
血管生成
间质－上皮 转化
对于原发性肺癌患者，CTC计数在有远处转移的肺癌患 者中有显著升高，相关性优于CEA。
CTC升高对于判断远处转移的敏感性达71%，特异性达83% CTC计数和血清CEA水平在不同切点的诊断价值
治疗前和治疗后CTC的数量变化反映疗效
大多数患者的CTC数量在第一个化疗疗程后（22天）下 降，提示疗效好。
从红细胞和白细胞中富集恶性肿瘤细胞
将恶性肿瘤细胞与红细胞、白细胞、正常
上皮细胞、造血干细胞等区分开来
三种技术
梯度密度法
• 肿瘤细胞和单核细胞密 度小于1.077g/ml
• CTC纯度低，混入较多 白细胞
• 肿瘤细胞会迁移至血浆 层，而聚集后容易下沉
• 聚蔗糖-泛影葡胺(FicollHypaque)对细胞有毒性
（MET）
侵入血管外 (CTC)
转移到骨 髓和其他
器官
血管内增殖 (CTM)
转移
播散肿瘤细胞 （DTC）微转
移休眠灶
CTC检测
➢ 预测PFS及OS ➢ 指示预后效果 ➢ 复发转移预测与分期 ➢ 有助于肿瘤个体化治疗的药物筛选和治疗方案的确定 ➢ 是传统的影像学及其他生物标志物的补充检测手段 ➢ 有助于寻找新的肿瘤标识物以及开发新的抗肿瘤药物
➢缺点：
• 存在一定的健康危害或健康隐患 • 肿瘤大小常与肿瘤的恶性程度或浸润能力不完全一致 • 费用昂贵 • 滞后性 • 灵敏性低
病理学方法
➢手术或活检获得病灶组织/周围淋巴结组织， 进行病理学染色和分析，是目前唯一明确肿瘤 有否转移的金标准
➢缺点：
• 精确度不够高 • 是侵入性检查手段 • 易造成扩散 • 人工误差大 • 难以标准化
过滤法
• ISET: Isolation by Size of Epithelial Tumor cells
• 8μm孔径过滤膜，漏检 体积较小的肿瘤细胞
• 敏感性低
免疫磁珠法
• 肿瘤细胞表面抗原 • CTC纯度低，混入较多
白细胞 • 不能有效排除细胞碎片 • 假阳性和假阴性高
Cell Search---免疫磁珠+流式细胞分析+化学发光
现时已是晚期，其5年生存率只有2%。
目前，仍然缺乏有效的生物标记物
2
预测治疗的有效性。CTC是一个潜
在的疗效预测因子。
3
验证能否在NSCLC患者中检测出 CTC及CTC能否预测治疗有效性。
实验流程
病人 入组
基线CTC 检测
化疗一 个疗程
Hale Waihona Puke Baidu
CTC 检测
统计 分析
患者入组标准
➢未做过化疗，且4周内未做过放疗 ➢病理学确诊为非小细胞肺癌 ➢IIIA, IIIB, IV期 ➢准备进行标准的细胞毒疗法 ➢5年内未患过恶性肿瘤
循环肿瘤细胞（CTC）检 测在肺癌中的应用
肿瘤疾病近期疗效的判断方法
临床因子作为预后与预测因子
• 预后：T, N, M staging, PS score • 预测：
– 吸烟状况：指导靶向治疗 – 性别：指导靶向治疗 – 种族：指导靶向治疗 – 组织学：指导化疗和靶向治疗
影像学方法
➢非侵入地、直观地对患者的肿瘤大小变化情 况进行评估。
化疗前后CTC的数量变化反映临床疗效
化疗前 化疗后 ➢化疗后CTC数量减少患者的临床疗效好于CTC数量增加的患者
结论
CTC能在IV期非小细胞肺癌患者中检出
CTC数量的变化反映了临床疗效
CTC数量与OS 和PFS相关，是非小细胞肺癌的一个 新的预后判断因子
CTC在判断是否存在转移中有重要参考价值
The Annals of Thoracic Surgery Volume 87,Issue 6,June 2009, Pages 1669-1675 Circulating Tumor Cells in Pulmonary Venous Blood of Primary Lung Cancer Patients
➢肝转移及骨转移患者中 CTC数量明显多于其它转 移患者。
基线CTC数量与无进展生存期和总生存期的关系
所有非小细胞 肺癌病人
所有Ⅳ期非小 细胞肺癌病人
➢基线CTC数量少于5的患者无进展生存期和总生存期明显高于基 线CTC数量大于等于5的患者。
化疗前后CTC数量与患者无进展生存期和总生存期的关系
➢化疗后CTC数量少于5的患者无进展生存期和总生存期明显高于CTC 数量大于5的患者。 ➢化疗前后CTC数量都少于5 的患者无进展生存期和总生存期明显高于 只有一次测出CTC数量少于5的患者。
➢外周循环肿瘤细胞的异常情况与手术切除的肿瘤细胞具有高度一致性。
CTC中的染色体异常分子标记物与疾病的复发和生存密切相关
CTC的应用：从细胞计数到分子特性
CTC计数
CTC的分子特性
指示预后
实时活检——肿瘤的生物学行为
辅助检测抗癌药物的反应——作为 阐明预后和预计的分子学特征
预测和/或药物动力学生物标志物 检测抗药情况——基于获得连续
实验方法
➢CellSave 专用收集管采集血液 ➢采集血后于室温储存并于96小 时内进行检测 ➢Cellsearch 系统进行检测
患者化疗前CTC数量（基线CTC）与临床特征的关系
➢IV期患者CTC数量明显多于IIIB期患者， IIIB期患者的CTC数量又明显多于IIIA期患者。
患者化疗前CTC数量与肿瘤转移地点的关系
对CTC进行基因表达分析
微列阵
实时定量RT-PCR
国内首个CELLSEARCH商业实验室 CH商业实验室
BIOTECAN宝藤——J&J强生
CTC检测样本准备：
• 使用CellSave储存管采集静脉 血液标本10ml
• 轻轻颠倒8次，防止凝块 • 样本室温条件(15-30摄氏度)
下96小时之内接受处理 • 接受阿霉素治疗的患者给药之
联合已知的分期因素，获取更精确
样本的便利性
的预后
提高对生物过程机制的了解
判断病人是否需要辅助化疗
发现并鉴定新治疗靶点
检测癌症复发
辅助诊断
FISH分析CTC生物学特性
(A) 白细胞有两份CEP7（绿色），EGFR（红色）和MET (蓝色) (B) CTC中， EGFR （红色）和MET (蓝色)基因扩增
Evaluation and prognostic significance of circulating tumor cells in patients with non-small-cell lung cancer.
背景
肺癌是最常见的原发性恶性肿瘤，85%的
1
肺癌患者为非小细胞肺癌，大多数患者发
CellSearch 是全球第一也是唯一经FDA批准可用于 临床的循环肿瘤细胞（CTC）产品
%Probability of Survival
100% 90% 80% 70% 60% 50% 40% 30% 20% 10% 0% 0
<5 CTCs n=90 (51%)
Logrank p < 0.0001
血清肿瘤标记物测定
➢血清肿瘤标志物的浓度往往可以在一定程 度上提示肿瘤的发展程度
➢缺点：
• 特异性不高 • 易受非特异蛋白的干扰 • 其他的病理生理状态影响导致假阳/阴性结果
循环肿瘤细胞
循环肿瘤细胞指从实体瘤中脱离出来并进入外周血液循环的肿瘤细胞。
1869年 Aust Med J， Ashworth最早在转移性癌 症患者血液中观察到。
后，至少需要等待7天
样本溶血及结块不能用于CTC检测！
样本处理流程：
7.5ml血液采集于CellSave储存 管，加入6.5ml缓冲液 离心
CellTracks®AutoPrep®系统自 动处理流程
系统自动将被捕获的、经过染色 的细胞置入MagNest装置的样本
盒中 系统自动分析后得到结果并由操
作人员进行最终判读