第七章基因结构与表达分析的基本策略ppthylogen
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● 细胞原位杂交
（Pardue et al， 1969)
● Southern印迹杂交※: 检测DNA
（Southern EM ，1975）
● Northern印迹杂交※: 检测RNA
（Stark GR，1977）
第七章基因结构与表达分析的基本策 略ppthylogen
核酸分子杂交原理
标记的单链核酸探针与待 检测的靶单链DNA或RNA局部 互补结合形成杂交双链。
(一）双脱氧链末端终止法
（dideoxy chain termination）
以DNA合成 反应为基础。
(Sanger)
第七章基因结构与表达分析的基本策 略ppthylogen
ATP、dATP和ddATP的结构
ATP
dATP
ddATP
第七章基因结构与表达分析的基本策 略ppthylogen
DNA合成反应
of the details of the control and transfer of genetic
information.
第七章基因结构与表达分析的基本策 略ppthylogen
2.中心法则提出（Crick，1958）
Crick,1916-2004
Central Dogma
第七章基因结构与表达分析的基本策 略ppthylogen
测序步骤
第七章基因结构与表达分析的基本策 略ppthylogen
第七章基因结构与表达分析的基本策 略ppthylogen
G反G应反管应管
A反应管
T反应管
C反应管 第七章基因结构与表达分析的基本策 略ppthylogen
GATC
第七章基因结构与表达分析的基本策 略ppthylogen
（二）化学裂解法
_
+
3
第七章基因结构与表达分析的基本策 略ppthylogen
二、Northern印迹杂交 (Northern blot hybridization)
指将RNA变性及电泳分离 后，并转移到固相支持物上，用 杂交反应来鉴定其中特定mRNA 分子的含量及其大小。
第七章基因结构与表达分析的基本策 略ppthylogen
Presentation Speech by Professor A. Engström
Dr. Francis Crick, Dr. James Watson, Your
discovery of the molecular structure of the
deoxyribonucleic acid, the substance carrying the
与末端终止法不同，化学 降解法是建立在对原有DNA的 化学降解过程基础上。
第七章基因结构与表达分析的基本策 略ppthylogen
1.化学裂解法原理
将待测DNA片段3′或5′端进行 同位素标记，标记的DNA片段分成四 个反应，分别用不同的化学试剂处 理，造成碱基特异性切割，使DNA片 段分别于某一种碱基处断裂。
第七章基因结构与表达 分析的基本策略ppt-
hylogen
2020/12/5
第七章基因结构与表达分析的基本策 略ppthylogen
概论
1. DNA双螺旋结构发现 （Watson ＆Crick,1953）
The Nobel Prize in Physiology or Medicine 1962
第七章基因结构与表达分析的基本策 略ppthylogen
第七章基因结构与表达分析的基本策 略ppthylogen
1. DNA自动测序步骤：
4种带有不同荧光染料标 记的终止物ddNTPs
Sanger测序反应
反应产物毛细管电泳分离
第七章基因结构与表达分析的基本策 略ppthylogen
激光激发不同大小DNA片段 上的荧光分子，发射出四种 不同波长的荧光
荧光信号采集、计算机分析
第七章基因结构与表达分析的基本策 略ppthylogen
化学降解G反应模式图
Met
硫酸二甲酯
Met
Met Met
哌啶
第七章基因结构与表达分析的基本策 略ppthylogen
（三）DNA测序自动化原理
采用4种不同的荧光分别标 记4种ddNTP终止反应产物， 替代放射性同位素标记是实现 DNA测序自动化的基础。
与DNA自动排序。
第七章基因结构与表达分析的基本策 略ppthylogen
2. DNA自动测序结果
第七章基因结构与表达分析的基本策 略ppthylogen
(Ⅱ)核酸分子杂交 Nucleic Acid Hybridization
第七章基因结构与表达分析的基本策 略ppthylogen
核酸分子杂交技术的建立
引物 延伸的新合成链
掺入ddNTP
末端终止部位
DNA单链模板
第七章基因结构与表达分析的基本策 略ppthylogen
2. DNA测序主要步骤
● 单链DNA模板的制备
● DNA模板与测序引物退火
● 掺入法标记反应 ● 延伸-终止反应
● 变性聚丙烯酰胺凝胶电泳 ● 放射自显影 ● 阅读测序结果
第七章基因结构与表达分析的基本策 略ppthylogen
● PAGE能分离长度为300500个碱基,差别仅1个碱基的单 链寡核苷酸DNA片段。
第七章基因结构与表达分析的基本策 略ppthylogen
共同分享Nobel化学奖(1979)
(Sanger, UK Maxam ＆Gilbert, USA)
第七章基因结构与表达分析的基本策 略ppthylogen
应用举例
Nt
28S
3638 2604
18S
623
3kb 0.4 kb
RNA琼脂糖凝胶电泳 Northern blot hybridization
第七章基因结构与表达分析的基本策 略ppthylogen
0d 2d 4d 6d 8d 靶 mRNA
GAPDH
Northern blot 杂交分析mRNA的表达
（二）原位杂交 （in situ hybridization）
用标记的核酸探针与组织切 片或细胞中的待测核酸互补序列 杂交，可对核酸进行定性、定位 和相对定量分析。
第七章基因结构与表达分析的基本策 略ppthylogen
（三）液相杂交 (solution hybridization)
1．核酸酶S1 保护分析法 (nuclease S1 protection assay）
cDNA微阵列:
在一微小的基片（硅片等）表面 集成了大量分子识别探针，能够平行 分析大量基因转录表达，因此又被称 为cDNA芯片。
第七章基因结构与表达分析的基本策 略ppthylogen
基因表达谱芯片主要技术流程：
样品荧光标记 芯片制备 芯片杂交 芯片洗涤和扫描 扫描图像分析
第七章基因结构与表达分析的基本1策02
反转录机制阐明（ Temin 1970 ）
补充的中心法则
第七章基因结构与表达分析的基本策 略ppthylogen
中心法则： 代表了大多数 生物遗传信息贮存和表达 的规律，奠定了从分子水 平研究生命科学关键问题 的理论基础。
第七章基因结构与表达分析的基本策 略ppthylogen
3.基因表达（gene expression）：
掺入N个核苷酸
掺入N+1个核苷酸
第七章基因结构与表达分析的基本策 略ppthylogen
1. 双脱氧末端终止法原理
DNA合成反应中，ddNTP不存 在3′-OH末端，故不能与下一个 核苷酸的5′-P端形成3′，5′磷酸二酯键，导致DNA新链的延伸 提前终止于ddNTP 。
第七章基因结构与表达分析的基本策 略ppthylogen
应用：核酸靶DNA或RNA 序列的定性与定量分析。
第七章基因结构与表达分析的基本策 略ppthylogen
第七章基因结构与表达分析的基本策 略ppthylogen
一、Southern印迹杂交 (Southern blot hybridization)
将电泳分离的待测DNA片段结 合到一定的固相支持物上，然后与 存在于液相中标记的核酸探针进行 杂交的过程。
heredity, is of utmost importance for our
understanding of one of the most vital biological
processes. Practically all the scientific disciplines
in the life sciences have felt the great impact of
第七章基因结构与表达分析的基本策 略ppthylogen
RPA基本程序：
●待测RNA的分离 ●体外转录标记RNA探针 ●待测RNA与探针RNA进行液相杂交 ● RNA酶消化 ●不同大小杂交片段凝胶电泳分离
第七章基因结构与表达分析的基本策 略ppthylogen
3.抑制消减杂交原理
（suppression subtractive hybridization，SSH）
以杂交为基础，并与PCR技术 结合的cDNA消减杂交方法。 应用：差异表达新基因的筛选与克隆。
第七章基因结构与表达分析的基本策 略ppthylogen
SSH原理
第七章基因结构与表达分析的基本策 略ppthylogen
(Ⅲ) 基因芯片和微阵列 cDNA Chip and Microarray
第七章基因结构与表达分析的基本策 略ppthylogen
第七章基因结构与表达分析的基本策 略ppthylogen
Southern Blotting
ETOH Phenol ProtK SDS
Spin
Chl百度文库ro
tissue
Paper Towels
1
第七章基因结构与表达分析的基本策 略ppthylogen
Agarose Gel Electrophoresis
从DNA到蛋白质，通过转录 和翻译，用基因的遗传信息在 细胞内合成有功能意义的各种 蛋白质。
第七章基因结构与表达分析的基本策 略ppthylogen
4.基因结构与表达分析技术：
DNA RNA
DNA序列分析※ Southern blot ※ FISH
Northern blot ※ Real -time RT –PCR ※ 基因芯片
蛋白质
Western blot※ 蛋白质芯片
第七章基因结构与表达分析的基本策 略ppthylogen
讲授内容：
(Ⅰ)DNA序列分析※ (Ⅱ)核酸分子杂交※
(Ⅲ) 基因芯片和微阵列
(Ⅳ)Western免疫印迹※ (Ⅴ) 聚合酶链式反应※
第七章基因结构与表达分析的基本策 略ppthylogen
一、DNA序列分析
单链DNA探针与待测RNA形成 DNA/RNA杂交双链，加入核酸酶S1 专一性地降解未形成杂交体的DNA 或RNA单链，DNA/RNA杂交双链则 受到保护而不被降解。
第七章基因结构与表达分析的基本策 略ppthylogen
2．RNA酶保护分析法
（RNase protection assay，RPA）
your discovery. The formulation of double helical
structure of the deoxyribonucleic acid with the
specific pairing of the organic bases, opens the
most spectacular possibilities for the unravelling
● 基因芯片上的阵列是由有规 则排列的cDNA或寡核苷酸等样 本所组成的 。
● 基因表达高通量分析法。
第七章基因结构与表达分析的基本策 略ppthylogen
DNA微阵列：
● cDNA微阵列（cDNA microarray） ● 寡核苷酸微阵列（oligomicroarray）
第七章基因结构与表达分析的基本策 略ppthylogen
（一）双脱氧链末端终止法※ (Sanger ,1977)
（二）化学裂解法 (Maxam ＆Gilbert ,1977 )
（三）DNA自动化序列分析
第七章基因结构与表达分析的基本策 略ppthylogen
DNA测序技术基础：
● 高分辨率变性聚丙烯酰胺 凝胶电泳（polyacrylamide gel electrophoresis, PAGE）技术
第七章基因结构与表达分析的基本策 略ppthylogen
三、其他杂交技术
(一)斑点杂交 (dot blot hybridization）:
将RNA或DNA变性后 直接点样于硝酸纤维素膜 或尼龙膜上，用于基因组 中特定基因及其表达的定 性及定量研究。
●● ● ● ●●
第七章基因结构与表达分析的基本策 略ppthylogen
（Pardue et al， 1969)
● Southern印迹杂交※: 检测DNA
（Southern EM ，1975）
● Northern印迹杂交※: 检测RNA
（Stark GR，1977）
第七章基因结构与表达分析的基本策 略ppthylogen
核酸分子杂交原理
标记的单链核酸探针与待 检测的靶单链DNA或RNA局部 互补结合形成杂交双链。
(一）双脱氧链末端终止法
（dideoxy chain termination）
以DNA合成 反应为基础。
(Sanger)
第七章基因结构与表达分析的基本策 略ppthylogen
ATP、dATP和ddATP的结构
ATP
dATP
ddATP
第七章基因结构与表达分析的基本策 略ppthylogen
DNA合成反应
of the details of the control and transfer of genetic
information.
第七章基因结构与表达分析的基本策 略ppthylogen
2.中心法则提出（Crick，1958）
Crick,1916-2004
Central Dogma
第七章基因结构与表达分析的基本策 略ppthylogen
测序步骤
第七章基因结构与表达分析的基本策 略ppthylogen
第七章基因结构与表达分析的基本策 略ppthylogen
G反G应反管应管
A反应管
T反应管
C反应管 第七章基因结构与表达分析的基本策 略ppthylogen
GATC
第七章基因结构与表达分析的基本策 略ppthylogen
（二）化学裂解法
_
+
3
第七章基因结构与表达分析的基本策 略ppthylogen
二、Northern印迹杂交 (Northern blot hybridization)
指将RNA变性及电泳分离 后，并转移到固相支持物上，用 杂交反应来鉴定其中特定mRNA 分子的含量及其大小。
第七章基因结构与表达分析的基本策 略ppthylogen
Presentation Speech by Professor A. Engström
Dr. Francis Crick, Dr. James Watson, Your
discovery of the molecular structure of the
deoxyribonucleic acid, the substance carrying the
与末端终止法不同，化学 降解法是建立在对原有DNA的 化学降解过程基础上。
第七章基因结构与表达分析的基本策 略ppthylogen
1.化学裂解法原理
将待测DNA片段3′或5′端进行 同位素标记，标记的DNA片段分成四 个反应，分别用不同的化学试剂处 理，造成碱基特异性切割，使DNA片 段分别于某一种碱基处断裂。
第七章基因结构与表达 分析的基本策略ppt-
hylogen
2020/12/5
第七章基因结构与表达分析的基本策 略ppthylogen
概论
1. DNA双螺旋结构发现 （Watson ＆Crick,1953）
The Nobel Prize in Physiology or Medicine 1962
第七章基因结构与表达分析的基本策 略ppthylogen
第七章基因结构与表达分析的基本策 略ppthylogen
1. DNA自动测序步骤：
4种带有不同荧光染料标 记的终止物ddNTPs
Sanger测序反应
反应产物毛细管电泳分离
第七章基因结构与表达分析的基本策 略ppthylogen
激光激发不同大小DNA片段 上的荧光分子，发射出四种 不同波长的荧光
荧光信号采集、计算机分析
第七章基因结构与表达分析的基本策 略ppthylogen
化学降解G反应模式图
Met
硫酸二甲酯
Met
Met Met
哌啶
第七章基因结构与表达分析的基本策 略ppthylogen
（三）DNA测序自动化原理
采用4种不同的荧光分别标 记4种ddNTP终止反应产物， 替代放射性同位素标记是实现 DNA测序自动化的基础。
与DNA自动排序。
第七章基因结构与表达分析的基本策 略ppthylogen
2. DNA自动测序结果
第七章基因结构与表达分析的基本策 略ppthylogen
(Ⅱ)核酸分子杂交 Nucleic Acid Hybridization
第七章基因结构与表达分析的基本策 略ppthylogen
核酸分子杂交技术的建立
引物 延伸的新合成链
掺入ddNTP
末端终止部位
DNA单链模板
第七章基因结构与表达分析的基本策 略ppthylogen
2. DNA测序主要步骤
● 单链DNA模板的制备
● DNA模板与测序引物退火
● 掺入法标记反应 ● 延伸-终止反应
● 变性聚丙烯酰胺凝胶电泳 ● 放射自显影 ● 阅读测序结果
第七章基因结构与表达分析的基本策 略ppthylogen
● PAGE能分离长度为300500个碱基,差别仅1个碱基的单 链寡核苷酸DNA片段。
第七章基因结构与表达分析的基本策 略ppthylogen
共同分享Nobel化学奖(1979)
(Sanger, UK Maxam ＆Gilbert, USA)
第七章基因结构与表达分析的基本策 略ppthylogen
应用举例
Nt
28S
3638 2604
18S
623
3kb 0.4 kb
RNA琼脂糖凝胶电泳 Northern blot hybridization
第七章基因结构与表达分析的基本策 略ppthylogen
0d 2d 4d 6d 8d 靶 mRNA
GAPDH
Northern blot 杂交分析mRNA的表达
（二）原位杂交 （in situ hybridization）
用标记的核酸探针与组织切 片或细胞中的待测核酸互补序列 杂交，可对核酸进行定性、定位 和相对定量分析。
第七章基因结构与表达分析的基本策 略ppthylogen
（三）液相杂交 (solution hybridization)
1．核酸酶S1 保护分析法 (nuclease S1 protection assay）
cDNA微阵列:
在一微小的基片（硅片等）表面 集成了大量分子识别探针，能够平行 分析大量基因转录表达，因此又被称 为cDNA芯片。
第七章基因结构与表达分析的基本策 略ppthylogen
基因表达谱芯片主要技术流程：
样品荧光标记 芯片制备 芯片杂交 芯片洗涤和扫描 扫描图像分析
第七章基因结构与表达分析的基本1策02
反转录机制阐明（ Temin 1970 ）
补充的中心法则
第七章基因结构与表达分析的基本策 略ppthylogen
中心法则： 代表了大多数 生物遗传信息贮存和表达 的规律，奠定了从分子水 平研究生命科学关键问题 的理论基础。
第七章基因结构与表达分析的基本策 略ppthylogen
3.基因表达（gene expression）：
掺入N个核苷酸
掺入N+1个核苷酸
第七章基因结构与表达分析的基本策 略ppthylogen
1. 双脱氧末端终止法原理
DNA合成反应中，ddNTP不存 在3′-OH末端，故不能与下一个 核苷酸的5′-P端形成3′，5′磷酸二酯键，导致DNA新链的延伸 提前终止于ddNTP 。
第七章基因结构与表达分析的基本策 略ppthylogen
应用：核酸靶DNA或RNA 序列的定性与定量分析。
第七章基因结构与表达分析的基本策 略ppthylogen
第七章基因结构与表达分析的基本策 略ppthylogen
一、Southern印迹杂交 (Southern blot hybridization)
将电泳分离的待测DNA片段结 合到一定的固相支持物上，然后与 存在于液相中标记的核酸探针进行 杂交的过程。
heredity, is of utmost importance for our
understanding of one of the most vital biological
processes. Practically all the scientific disciplines
in the life sciences have felt the great impact of
第七章基因结构与表达分析的基本策 略ppthylogen
RPA基本程序：
●待测RNA的分离 ●体外转录标记RNA探针 ●待测RNA与探针RNA进行液相杂交 ● RNA酶消化 ●不同大小杂交片段凝胶电泳分离
第七章基因结构与表达分析的基本策 略ppthylogen
3.抑制消减杂交原理
（suppression subtractive hybridization，SSH）
以杂交为基础，并与PCR技术 结合的cDNA消减杂交方法。 应用：差异表达新基因的筛选与克隆。
第七章基因结构与表达分析的基本策 略ppthylogen
SSH原理
第七章基因结构与表达分析的基本策 略ppthylogen
(Ⅲ) 基因芯片和微阵列 cDNA Chip and Microarray
第七章基因结构与表达分析的基本策 略ppthylogen
第七章基因结构与表达分析的基本策 略ppthylogen
Southern Blotting
ETOH Phenol ProtK SDS
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Chl百度文库ro
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Paper Towels
1
第七章基因结构与表达分析的基本策 略ppthylogen
Agarose Gel Electrophoresis
从DNA到蛋白质，通过转录 和翻译，用基因的遗传信息在 细胞内合成有功能意义的各种 蛋白质。
第七章基因结构与表达分析的基本策 略ppthylogen
4.基因结构与表达分析技术：
DNA RNA
DNA序列分析※ Southern blot ※ FISH
Northern blot ※ Real -time RT –PCR ※ 基因芯片
蛋白质
Western blot※ 蛋白质芯片
第七章基因结构与表达分析的基本策 略ppthylogen
讲授内容：
(Ⅰ)DNA序列分析※ (Ⅱ)核酸分子杂交※
(Ⅲ) 基因芯片和微阵列
(Ⅳ)Western免疫印迹※ (Ⅴ) 聚合酶链式反应※
第七章基因结构与表达分析的基本策 略ppthylogen
一、DNA序列分析
单链DNA探针与待测RNA形成 DNA/RNA杂交双链，加入核酸酶S1 专一性地降解未形成杂交体的DNA 或RNA单链，DNA/RNA杂交双链则 受到保护而不被降解。
第七章基因结构与表达分析的基本策 略ppthylogen
2．RNA酶保护分析法
（RNase protection assay，RPA）
your discovery. The formulation of double helical
structure of the deoxyribonucleic acid with the
specific pairing of the organic bases, opens the
most spectacular possibilities for the unravelling
● 基因芯片上的阵列是由有规 则排列的cDNA或寡核苷酸等样 本所组成的 。
● 基因表达高通量分析法。
第七章基因结构与表达分析的基本策 略ppthylogen
DNA微阵列：
● cDNA微阵列（cDNA microarray） ● 寡核苷酸微阵列（oligomicroarray）
第七章基因结构与表达分析的基本策 略ppthylogen
（一）双脱氧链末端终止法※ (Sanger ,1977)
（二）化学裂解法 (Maxam ＆Gilbert ,1977 )
（三）DNA自动化序列分析
第七章基因结构与表达分析的基本策 略ppthylogen
DNA测序技术基础：
● 高分辨率变性聚丙烯酰胺 凝胶电泳（polyacrylamide gel electrophoresis, PAGE）技术
第七章基因结构与表达分析的基本策 略ppthylogen
三、其他杂交技术
(一)斑点杂交 (dot blot hybridization）:
将RNA或DNA变性后 直接点样于硝酸纤维素膜 或尼龙膜上，用于基因组 中特定基因及其表达的定 性及定量研究。
●● ● ● ●●
第七章基因结构与表达分析的基本策 略ppthylogen