玉米幼胚愈伤组织诱导与植株再生培养体系建立

植物细胞工程试验设计

玉米幼胚愈伤组织诱导与植株再生培养体系建立

一、研究的目的与意义

国内外与本领域有关的研究动态中主要集中在如何进一步完善玉米幼胚组织培养技术，使其更好地应用在育种上，比如龚娜等人的《玉米幼胚愈伤组织诱导及植株再生研究》、张红伟等人的《玉米幼胚愈伤组织的诱导和植株再生的QTL分析》等。

建立玉米幼胚愈伤组织诱导与植株再生培养体系的目的, 是让外植体能够高频率地诱导出胚性愈伤组织并再生植株, 建立一个高效的体细胞再生体系, 为玉米遗传转化和细胞工程研究创造有利条件。其意义在于使这项技术在玉米育种上的广泛应用成为可能，进而提高玉米作物的产量等。

二、国内外与本领域有关的研究概况

（1）1949年, Larue 采用甜玉米三倍体胚乳, 首次成功地诱导出玉米组织培养物; 1965年, Mascaren as 等诱导了玉米二倍体组织培养物。

存在的问题：但以上这些组织培养物均未能培养出再生植株。

（2）直到1975年, Green 和Pillips用幼胚做外植体, 诱导出二倍体愈伤组织并再生出健壮的植株。在20世纪70 年代初期, 我国就开始了玉米花药培养选育纯的研究，科学院遗传研究所在1975年首次诱导出玉米的花粉植株, 以后的几年中, 一些科研单位陆续诱导出花粉植株。

所取得的成就：从那时起, 玉米体细胞培养技术不断取得进展。目前, 已经能从幼胚的顶端分生组织、幼苗芽顶端分生组织及中胚轴、幼苗叶基部、幼苗基部叶片、幼苗切段、雌雄幼穗、雄幼穗颖片、成熟胚、未成熟花序、节间芽等诱导愈伤组织并培养出再生植株。普遍认为,玉米以幼胚为外植体诱导效率最高, 再生能力最强, 培养效果最佳。

存在并有待解决的问题：虽然玉米可诱导出愈伤组织的外植体类型较多,但幼胚是最易诱导，也是使用最多的外植体。利用玉米幼胚为外植体, 通过组织培养诱导愈伤组织, 再分化出再生植株以及幼苗的移栽, 每一环节都比较困难。许多人已对此技术进行了许多探索，但就现在来看, 虽有少数组培苗诱导成功并移栽成活, 但还没有形成一套完整、有效的技术能在作物育种上广泛应用。

二、研究内容

基于以上所取得的成就和有待解决的问题，为了进一步完善玉米幼胚组织培养技术，本试验将重点探索玉米幼胚愈伤组织诱导及植株再生过程中的培养基激素种类与浓度对愈伤组织诱导及植株再生的影响。

1.解决以上问的题试验方案如下：

将M、N两种型号的玉米各选取一组生长整齐一致的植株进行套袋, 授粉9~ 14 d 后取玉米果穗, 剥去外层苞叶,在超净台上用75%酒精浸泡5min ,用无菌水冲洗3~ 5遍, 然后用手术刀削去籽粒最上一端,使幼胚露出,用镊子取出幼胚,把幼胚的盾片朝上,接种于N6 (添加脯氨酸690 mg /L)基本培养基上(标记为A), 2 , 4- D添加浓度分别为0(标记为A1)、1(标记为A2)、2标记为(A3)、3(标记为A4) 、4(标记为A5)mg /L。1周后去胚芽,观察并记录愈伤组织的诱导情况,计算愈伤组织诱导率(愈伤组织诱导率=产生愈伤组织的幼胚数/接种幼胚数100% )。挑选生长旺盛的胚性愈伤组织,接种在N6分化培养基（标记为B）上进行愈伤组织分化和植株再生, 6 - BA 添加浓度分别为0 . 0（标记为B1）、0 . 5（标记为B2）、1 . 0（标记为B3）、1 . 5(标记为B4)、2 . 0（标记为B5）mg /L ,观察并记录根和芽的分化情况,

计算分化成苗率(分化成苗率=分化出芽的胚性愈伤组织块数/接种胚性愈伤组织块数100 % )。以上各试验的培养基均添加琼脂0 . 7 %、蔗糖3 . 0%, pH值5 . 8 , 2 ~ 3周继代培养1次。消毒和取材均在超净工作台上进行。培养条件:愈伤组织诱导采用暗培养, 愈伤组织分化采用光照培养,光强1500 lx , 培养温度( 23 -27 摄氏度)。

2.各培养基的配制：

N6 (添加脯氨酸690 mg /L)基本培养基：N6+蔗糖3%+琼脂0.7%+脯氨酸690 mg /L，ph5.8

N6分化培养基：N6+蔗糖3%+琼脂0.7%，ph5.8+水解酪蛋白100mg/L+KT 1mg/L

3.试验技术路线图：

备注：A1、A2、A3、A4、A5、B1、B2、B3、B4、B5均为方案中不同培养基的标识

4.整理表格：

五、参考文献

[1] 胡尚连，尹静编．植物细胞工程．成都：西南交通大学出版社，2010．

[2] 龚娜, 杨涛, 肖军等. 玉米幼胚愈伤组织诱导及植株再生研究[J] . 江苏农业科学, 2010 ( 6) : 84 - 85.

[3] 王宏伟,史振声,王志斌,王建东,杨大威. 玉米幼胚愈伤组织的诱导及植株再生研究. 沈阳农业大学学报, 2002- 10, 33( 5) : 321- 323

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