免疫组化的原理与操作

特点：灵敏度高，比间接荧光法敏感20倍，比间接酶标记抗体法 敏感100倍
5．亲和素-生物素-过氧化物酶复合物法（avidin-biotinperoxidase complex technique，简称ABC法）。
关键的程序步骤为3步：
Ag +Ab1 +（Ab2-B）+AB★C 复合物 （ Ab2-B 为生物素标记的第二抗体） （B ★为生物素标记的过氧化物酶） AB★C复合物是avidin与酶联biotin 在使用前30min 配置，混匀。1个avidin分子结合了3个biotin分子，剩下 1个结合点与2抗的生物素结合，avidin起桥联作用。
1．直接法
荧光素直接标记特异性抗体（一抗）上，标记抗 体与抗原结合（在切片上）荧光显微镜下观察→ 检测抗原。
优点：简单，时间短， 特异性强。 缺点：灵敏度低，所 需抗体量大 （不经济）。 应用：基本不用了！！
2．间接法
荧光素标记在二抗上（二抗：抗产生一抗动物的 IgG抗体）。 ※显色后镜检
特点：1、敏感性较直接法高3-4倍，但特异性较低；
（四）IHC的应用
1. 只要是形态科学均可采用:包括病理学、神经科学、 生物学、病原微生物的检测（病毒、细菌、寄生虫 等）、皮肤病学、器官移植等。 2. 可用于多种材料：A.各种组织（冰冻组织、formalin 固定组织、石蜡包埋组织兼可）；B.各种细胞(穿刺、 体液、涂片、血细胞、培养细胞等）。 3. 用于诊断：肿瘤病理学等（大中医院）。 4. 用于科研：临床和基础医学，尤其是形态学专业研 究生常用IHC，或IHC+分生技术；最近几年，分子 生物学研究异常活跃，但最终还要归到形态上来， 用免疫组织化学方法对所研究的大分子进行定位， 进而深入研究其功能。
四、免疫组织化学技术来自百度文库
（一）基本染色方法 直接法
标记抗体法
荧光素标记抗体：FITC、 TRITC等 酶标记抗体：HRP、AP等 荧光素标记抗体 酶标记抗体（三步法）
间接法
非标记抗体法：酶桥法、PAP法、APAAP法; 亲和组化法：ABC法、LAB法、LsAB法、BRAB法; 双重标记：阻断法（酸洗Ⅰ抗）、非阻断法（连续染）
二、IHC的现状和发展前景
（一）方法学
1.从传统的抗原、抗体反应（免疫反应）→亲和反应。新的亲 和物质对有：生物素与卵白素（biotin&avidin)，葡萄球菌A 蛋白（SPA）与IgG，凝集素与受体，激素与受体。这些亲 和对亲和力强，且可与多种标记物（荧光素、酶、同位素、 胶体金、铁蛋白等）结合，由此产生了亲和组织化学 （affinity histochemistry），这些方法特异性、敏感性、稳 定性高，更方便、适于某些特殊观察（如EM）。 2.从单一显示某种物质（单标记）→显示多种物质（双标记）。 3.从LM→EM（超微结构）：免疫电镜、胶体金法、金银法。 4.从定性→定量，图象分析（IA）、流式细胞术（FCM）。 5.IHC与ISH相结合，可在不同水平检测DNA、mRNA、protein。 6. 原位PCR+IHC可在组织原位通过扩增检测微量目的DNA。 7. 趋于标准化、自动化。
特点或优点：（1）特异性强、灵敏度高； （2）可定性、定位、定量观察； （3）将形态学改变与功能和代谢变化结 合起来；
IHC不仅具有传统形态学（包括LM和EM水平） 能对组织和细胞进行仔细、客观观察的优点（特别 是经苏木精或伊红复染后），而且还克服了传统免 疫学反应只能定性和定量（离体、液相），而不能 定位的缺点。IHC则可在原位和固相对染色结果进 行观察。目前IHC的定位可精确到亚微结构水平。 随着IHC技术的发展和图象分析技术的发展， IHC已进入多标记（双标记）和定量研究的阶段， 使IHC在生物学和医学各领域的应用日益广泛，不 仅用于研究，也用于诊断。IHC与核酸分子杂交相 结合形成的原位杂交技术（in situ hybridization， ISH）既特异性强、灵敏，又具定位、可视的特点。
（二）技术分类
1. 根据染色方式分成：① 贴片染色 ② 漂浮染色 2. 根据Ag-Ab结合方式分成： ① 直接法 ② 间接法 ③ 多层法 3. 按标记物的性质分成： ① 免疫荧光技术（免疫荧光法） ② 免疫酶技术（酶标抗体法、桥法、PAD法、 ABC法） ③ 免疫金属技术（免疫铁蛋白法、免疫金染色 法、蛋白A金法）
Immunohistochemistry
免疫组化概述
概念：免疫组织化学(Immunohistochemistry,IHC) 是 利用抗原抗体反应和组织化学呈色反应来检测组织 和细胞中某种化学成分的一门技术,是传统的免疫学 和组织化学相结合而发展起来的一门新兴学科，也 叫原位免疫学（In situ immunology）。
——80年代Hsu等建立了ABC法之后，免疫金—银染色 法、半抗原标记法、免疫电镜技术相继问世。 ——90年代 分子杂交技术、原位杂交技术、免疫细 胞化学分类方法迅速发展； ——2000年 各种免疫组化技术更加成熟，使免疫组 化技术成为当今生物医学中形态、功 能代谢综合 研究的一项有力工具。其应用范围深达医学各个 学科，是目前生命科学工作者应该掌握的基本技 术之一； ——国内起步晚，从70s开始。
一、IHC的发展简史
—— IHC技术源于免疫荧光术（immunofluorescence, IF），从1941年~1950年Coons等用了10年首创了 荧光素标记抗体技术——检测肺组织内的肺炎双 球菌，六、七十年代IF在科研中占据着主导地位 ——1968 年中根一穗（Nakane）等创建了酶标抗体技 术（immunoperoxidase，IPO）——铁蛋白标记 Ab技术; ——1974年Stemberger 改良上述技术，建立辣根过氧 化物酶－抗体过氧化物酶（PAP）技术，使免疫 细胞化学得到广泛应用；
（五）抗原修复
近年兴起的新技术。目的：暴露被交联封闭的Ag。 主要适用于经长期formalin固定的标本、石蜡包埋标 本；也可用于冰冻切片。常用的方法有： （1） 微波加热 切片煮沸10~20min，室温自然冷却， 所用溶液有：①饱和NaCL溶液；②10mMpH 6.0的 枸橼酸钠缓冲液；③ 4M的尿素等；④pH8.0TBS; （2）高压锅处理 将切片放入10mM、pH 6.0的枸橼酸 钠缓冲液容器中，置锅内加盖喷气3~10min，自然冷 却。 （3）酶消化处理 ：常用0.1%的胰蛋白酶（含 0.1%CaCL2，pH 7.8）37。C 10min。或0.4%胃蛋白 酶37。C 30min;
（四）防脱片剂
（1） 蛋白甘油，蛋清与甘油1：1搅拌、过滤、防腐； （2）1%的铬矾明胶涂片； （3）0.1%的多聚赖氨酸涂片，晾干备用。配制时用塑料 瓶而不能用玻璃瓶； （4） 购买商品化的进口硅化玻片； （5）APES（氨丙基三乙氧基硅烷），1：50丙酮稀释，
浸片20~30秒，晾干备用；贴片时要一步到位。
（三）标记物
1. 必要性：组织细胞内Ag-Ab结合反应一般是不可 见的，若在镜下检测，则必须具有可视性标记物。 2. 常用标记物 ① 荧光素：最常用的是异硫一氰酸荧光素（ Fluorescein isothiocyanate ，FITC）---荧光显 微镜下呈绿色荧光; 四乙基罗达明（rho—damine RB200）---荧光显微镜下发橙红色荧光 ② 酶：辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶。 ③ 生物素：（Biotin） ④ 铁蛋白金等：主要应用于免疫电镜。 ⑤ 其他：如同位素（因涉及污染和防护难一般不用）
特点：敏感性高，但酶浓度不好掌握；与组织非 特异性结合的酶不易洗去，背景染色重。
4．过氧化物酶—抗过氧化物酶法（Peroxidase peroxidase method，简称PAP法）
anti-
是桥法的改良，用第二抗体作“桥梁”，先与第一抗体结合， 再与PAP复合物联结，形成抗原—抗体—抗IgG抗体—PAP复合物 ，最后用底物显色剂显色。
（1）ABC复合物的制备：
（2）ABC法反应原理：
特点：ABC法敏感性更高，比PAP法 敏感20~40倍，背景也更清晰。
ABC法示意图
染色结果观察（BrdU）
6、酶标亲和素-生物素技术（labelled avidin-biotin technique， 简称LAB法）。
即用辣根过氧化物酶直接标记avidin，用biotin标记2抗。
三、样品的准备、处理 （一）标本的收集与处理
IHC染色成功与否及其质量如何，除染色方法本 身外，对材料的处理也至关重要，它包括：取材、 固定、脱水、包埋、切片等。目的：保存好Ag的数 量及活性、保持组织细胞的良好形态结构。材料的 来源：人体及实验动物；细胞和组织；新鲜的及固 定的。 1、组织标本的取材与储存 来源：活检取材、手术切除、实验动物组织等。 要求：要快、要小（1×1×0.4cm），避免挤压。 处理：冰冻→即用或保存；固定→即用或保存。
2、常用固定剂及其用途
1. 10%的formalin（4%的甲醛formaldehyde）：以pH7.4的PBS 配制，优点：穿透力强、固定快、组织收缩小；适于固定蛋 白、肽类、酶、糖。IHC常用4%多聚甲醛polyformaldehyde 灌注固定及后固定，时间4~6 h。 2. 2.5%的戊二醛，同上。也可用2%戊二醛与2%多聚甲醛混合 液固定，尤对超微结构保存好。醛类固定剂的缺点是易封闭 抗原，必要时需抗原修复。 3. 70%的酒精（乙醇），优点：固定蛋白好，缺点：组织收缩 严重；时间：2h。 4. 70%丙酮，优点：渗透快；缺点：对形态保存不好；用于对 冰冻切片和细胞涂片的固定；时间：10min。 5. 混合固定液：Bouin液：40%PF250ml、冰醋酸50ml、饱和苦 味酸250ml；还有PLP固定液，较适合免疫组化。 6. 四氧化锇（OsO4 锇酸）：常用PBS配制1%锇酸溶液后固定 1h，用于免疫组化及电镜观察。有强烈刺激，需在通风橱内 操作。
1、固定的含义 固定是指以某种化学物质使蛋白质、酶类（变性 ）、脂质、糖类等物质保持在组织细胞原位，避免 Ag溶解、扩散、丢失；保持组织细胞的正常形态结 构。 根据Ag对固定剂的耐受性，可将其分为：不稳 定Ag（如细胞表面Ag，不耐甲醛，宜用丙酮）、半 稳定Ag及稳定Ag，后二者多为蛋白、肽类、酶类物 质。 固定有时间性，太短达不到固定目的，太长交联 过度，封闭Ag。
2、不必标记每种一抗，只需标记某一种动物的二抗；
3、一抗可高度稀释，节省一抗，且可用PBS代替一抗做空白对照。
3．非标记Ab桥法：
“桥法”是酶标记抗体的改进，经过三次抗体， 其二抗为未标记桥抗体。 （1）单桥法
(2)双桥法 在三抗之后，将二抗和三抗再重复一次， 可增大染色强度。 ★ 特别提示：注意动物种属关系
关键步骤为3步： Ag +Ab1 +（Ab2-B）+A★ （A★为HRP标记的卵白素） A★与2抗的生物素结合，avidin起桥联作用。
如将该法中的卵白素（avidin）变换成链霉卵白素(streptavidin)，LAB 法即成LsAB法，或称SP法。
据认为LAB法比ABC法敏感2~4倍，而LsAB法因链霉卵白 素不与组织细胞中内源性生物素结合而特异性更高。现在SP法 已趋于取代ABC法而广为应用。
2、细胞标本的取材与储存
来源：血细胞、穿刺细胞、体液细胞等。 处理：细胞多时直接涂片、干燥、固定、染色； 细胞少需离心沉淀、涂片、干燥、固定、染色； 对于体外培养细胞：贴壁生长细胞（内皮C、纤 维C、神经C等）在培养皿底置载玻片；悬浮生长细胞 需离心沉淀，再涂片、固定，即用或冰冻保存。
（二）固定（fixation）
（三） 组织的脱水、浸蜡、包埋和切片
前三步只用于石蜡切片，冰冻切片和振动切片 不需此步骤。 切片可分为： 石蜡切片：脱水、透明、浸蜡、包埋、切片5~7μm； 冰冻切片：浸糖，20%~30%蔗糖4oC过夜，减少冰 晶；OCT包埋；液氮速冻，减轻组织破 坏。病理切片要薄，5~7 μm；脑片通常 30~50 μm厚。 振动切片：不需做任何包埋，固定后的组织可直接 用振动切片机做各种厚度的切片，并在 染色后可进一步制作电镜标本观察。