cDNA文库的构建
cdna文库的构建步骤
cdna文库的构建步骤CDNA文库是基因组学和转录组学研究中非常常见的技术，它可以用来快速鉴定不同组织或不同生长条件下基因表达的变化情况。
下面将介绍CDNA文库的构建步骤。
一、RNA提取RNA提取是构建CDNA文库的第一步，它是从不同组织或生长条件下采集的样品中提取出RNA。
RNA提取需要注意以下几点：1. 样品必须在冰上保存，并尽可能快地进行处理。
2. RNA提取要使用无菌工具和试剂，并严格遵守操作规程。
3. RNA提取要避免DNA污染，可使用DNase对RNA进行处理。
4. RNA质量要进行检测，以保证后续实验的可靠性。
二、反转录反转录是将RNA转化为cDNA的过程。
反转录需要注意以下几点：1. 反转录试剂必须新鲜，并且使用前应该预先热处理。
2. 反转录反应时间和温度要根据实验需求进行调整。
3. 可以选择使用随机引物或寡聚dT引物作为反转录引物。
三、二代测序前的PCR扩增PCR扩增是将cDNA扩增为足够的量以进行二代测序的过程。
PCR扩增需要注意以下几点：1. PCR反应体系要严格控制，避免引物和模板过量。
2. PCR反应时间和温度要根据实验需求进行调整。
3. 可以选择使用高保真PCR酶，以保证扩增产物的准确性。
四、文库构建文库构建是将PCR扩增产物连接到载体上，形成完整的CDNA文库的过程。
文库构建需要注意以下几点：1. 选择合适的载体，如pBluescript II SK+、pUC19等。
2. 连接PCR扩增产物时要控制连接比例，避免连接过多或过少。
3. 连接后可以进行转化、筛选和纯化等步骤，得到CDNA文库。
五、二代测序二代测序是对CDNA文库进行高通量测序的过程。
二代测序需要注意以下几点：1. 选择合适的平台和测序模式，如Illumina HiSeq、NovaSeq等平台。
2. 测序深度要根据实验需求进行调整，以保证数据质量和覆盖度。
3. 测序后得到原始数据后，需要进行质控、去除低质量数据、拼接等步骤，得到高质量的测序数据。
cDNA文库构建的具体步骤及详细说明
cDNA文库构建的具体步骤及详细说明cDNA文库构建的具体步骤及详细说明cDNA 文库是指某生物某发育时期所转录的全部mRNA 经反转录形成的cDNA 片段与某种载体连接而形成的克隆的集合。
经典cDNA 文库构建的基本原理是用Oligo(dT) 作逆转录引物，或者用随机引物，给所合成的cDNA 加上适当的连接接头，连接到适当的载体中获得文库。
其基本步骤包括：（1）mRNA的提纯获取高质量的mRNA是构建高质量的cDNA 文库的关键步骤之一。
（2）cDNA第一条链的合成。
（3）cDNA第二条链的合成。
（4）双链cDNA的修饰。
（5）双链cDNA的分子克隆。
（6）cDNA文库的扩增。
（7）cDNA文库鉴定评价。
一、Superscipt II—RT合成第一链1. 在一RNase-free的0.2 ml PCR管中加入x ul mRNA(大约500 ng) 、1 ul Xho I Primer(1.4 ug/ul)(5’GAGAGAGAGAGAGAGAGAGAAC TAGTCTCGAGTTTTTTTT TTTTTTTTTT…3’)、11-x ul RNase-free water（大于500 ng mRNA 分n管(500 ng/tube)合成第一链，第一链合成完毕后将n管合成一管进行第二链合成。
）。
2. 混匀后，70℃反应10分钟。
3. 反应完成后，立刻将反应体系置于冰上5 min。
4. 稍微离心一下，顺序加入以下试剂：（1）4 ul 5×first strand buffer（2）2 ul 0.1 M DTT（3）1 ul 10 mM dNTP(自己配制)5. 混匀，稍微离心反应物之后，42℃放置2分钟。
6. 反应完成,趁热加入1 ul Superscipt II—RT，混匀。
7. 42℃反应50分钟，然后70℃，15分钟灭活反转录酶。
二、cDNA第二链的合成1. 第一链反应完成后，取2ul一链产物-20℃冰箱中保存，待电泳检测。
cDNA 文库的构建
第二节cDNA 文库的构建cDNA 文库中的外源 DNA 片段是互补 DNA （complementary DNA , cDNA）。
cDNA 是由生物的某一特定器官或特定发育时期细胞内的 mRNA 经体外反转录后形成的双链 cDNA 。
cDNA 文库代表生物的某一特定器官或特定发育时期细胞内转录水平上的基因的群体，并不能包括该生物的全部基因，且这些基因在表达丰度上存在很大差异。
cDNA 文库的构建cDNA 文库的构建共分四步（图 8-2）：第一，细胞总 RNA 的提取和 mRNA 分离；第二，第一链 cDNA 合成；第三，第二链 cDNA 合成；第四，双链 cDNA 克隆进质粒或噬菌体载体并导入宿主中繁殖。
图 8-2 ： cDNA 文库构建流程图一、RNA 的分离cDNA 文库构建是以 mRNA 为起始材料的， mRNA 在总RNA 中所占比例很小，因此从总RNA 中富集mRNA 是构建cDNA 文库和其它应用所必需进行的步骤。
通过降低rRNA和tRNA 含量，可大大提高筛选到目标基因的可能性。
目前纯化mRNA 的方法都是在固体支持物表面共价结合固定一段由脱氧胸腺嘧啶核苷组成的寡聚核苷酸[ oligo（dT）]链，由它与mRNA 的Poly（A）尾巴杂交，从而吸附固定住mRNA ，进而将mRNA从其它组分中分离出来的。
1．mRNA 的完整性指导合成高分子量蛋白质的能力，指导合成目的多肽的能力，mRNA 的大小，总mRNA 制剂指导合成cDNA 第一链长分子的能力。
2．mRNA 的丰度高丰度mRNA ：珠蛋白，免疫球蛋白，卵清蛋白，在特定细胞中占50-90% 。
低丰度mRNA ：含量 0.5% 被称为低丰度或稀有mRNA 。
3．mRNA 的富集3.1按大小对 mRNA 进行分级分离3.2 cDNA 的分离级分离近年来多采用此方法，特别是大mRNA ，可避免降解mRNA , agarose 分离大小易辨。
cdna基因文库构建的基本路线
cdna基因文库构建的基本路线CDNA基因文库构建是一种常用的分子生物学技术，用于研究基因表达和功能的调查。
本文将介绍CDNA基因文库构建的基本路线，包括材料准备、RNA提取、反转录、合成cDNA、构建文库和筛选等步骤。
一、材料准备进行CDNA基因文库构建之前，需要准备一些实验材料和试剂。
主要包括：1. 细胞或组织样品：可以是人类、动物或植物的细胞或组织样品。
2. 细胞破碎液：用于细胞破碎和RNA保护，常用的有三种类型：TRIzol、RNeasy Mini Kit和RNAiso Plus。
3. 反转录试剂盒：包括反转录酶、随机引物、dNTPs等。
4. 克隆载体：用于构建基因文库的载体，常用的有质粒载体和噬菌体载体。
5. 细菌培养基和抗生素：用于细菌的培养和筛选。
二、RNA提取RNA提取是构建CDNA基因文库的第一步，目的是从细胞或组织样品中提取总RNA。
常用的提取方法有酚/氯仿法、硅胶膜法和磁珠法等。
提取的RNA应具有较高的纯度和完整性，以保证后续的反转录和文库构建质量。
三、反转录反转录是将提取的RNA转录成cDNA的过程。
在这一步中，需要将RNA模板与反转录酶、随机引物、dNTPs等反转录试剂一起反应，合成cDNA。
反转录的条件包括温度、时间和反应体系等，需要根据试剂盒的说明进行操作。
四、合成cDNA合成cDNA是将反转录得到的第一链cDNA转录成双链cDNA的过程。
一般采用PCR扩增的方法，在反应中加入适量的引物和dNTPs，进行多轮扩增，最终得到足够量的双链cDNA。
合成cDNA的条件包括PCR扩增的循环数、温度和时间等。
五、构建文库构建基因文库是将合成的cDNA插入到克隆载体中的过程。
常用的构建方法有限制性内切酶法、T/A克隆法和引物扩增法等。
在构建文库的过程中，需要将双链cDNA与克隆载体进行连接，形成重组DNA。
连接后的重组DNA可以通过转化到适当的宿主细胞中，得到大量的重组质粒。
六、筛选构建完基因文库后，需要进行筛选以获得感兴趣的基因。
cDNA文库构建
cDNA文库构建cDNA文库[原理]：cDNA文库不同于基因组文库，被克隆DNA是从mRNA反转录来源的DNA。
CDNA组成特点是其中不含有内含子和其他调控序列。
从而做cDNA克隆时应是先从获得mRNA开始，在此基础上，通过反转录酶作用产生一条与mRNA相互补的DNA链，然后除掉mRNA，以第一条DNA链为模板复制出第二条DNA链（双链）；再进一步把此双链插入原核或真核载体。
cDNA文库的构建分为六个阶段：阶段1：反转录酶催化合成cDNA第一链阶段2：cDNA第二链的合成阶段3：cDNA的甲基化阶段4：接头或衔接子的连接阶段5：SepharoseCL-4B凝胶过滤法分离cDNA阶段6：cDNA与λ噬菌体臂的连接[阶段1：反转录酶催化合成cDNA第一链]1．在置于冰上的无菌微量离心管内混合下列试剂进行cDNA 第一链的合成：poly(A)+RNA(1μg/μl)10μl寡核苷酸引物(1μg/μl)1μl1mol/LTris-HCl(pH8.0,37℃) 2.5μl1mol/LKCl 3.5μl250mmol/LMgCl22μldNTP溶液（含4种dNTP，每种5mmol/L）10μl0.1mol/LDTT2μlRNase抑制剂（选用）25单位加H2O至48μl2．当所有反应组在0℃混合后，取出2.5μl反应液转移到另一个0.5ml微量离心管内。
在这个小规模反应管中加入0.1μl[α-32P]dCTP（400Ci/mmol,10mCi/ml）。
3．大规模和小规模反应管都在37℃温育1h。
4．温育接近结束时，在含有同位素的小规模反应管中加入1μl0.25mol/LEDTA，然后将反应管转移到冰上。
大规模反应管则在70℃温育10min，然后转移至冰上。
5．参考《分子克隆实验指南》第三版附录8所述方法，测定0.5μl小规模反应物中放射性总活度和可被三氯乙酸（TCA）沉淀的放射性活度。
此外，用合适的DNA分子质量参照物通过碱性琼脂糖凝胶电泳对小规模反应产物进行分析是值得的。
cDNA文库的构建
3. mRNA 的纯化
对高丰度的 mRNA 来讲，其所对应的 cDNA 克隆很NA 之前不需要进一步纯化和富集。分离低丰度 mRNA 通常有如下两种方法：①按照大小对总 mRNA 进行分级，主要用琼脂糖凝胶电泳和蔗糖密度梯度离心法进行分级；②多聚核糖体的免疫学纯化法，这是利用抗体来纯化合成目的多肽的方法。
4. mRNA 完整性的确定
确定 mRNA 完整性的方法有三种：
① 直接检测 mRNA 分子的大小；
② 测定 mRNA 的转译能力；
③ 检测总 mRNA 指导合成 cDNA 第一链长分子的能力。
二、 cDNA 的合成和克隆
1. cDNA 第一链的合成
用亲和层析法得到 mRNA 后，根据 mRNA 分子的 3' 端有 poly (A) 尾结构的原理，用 12~20 个核苷酸长的 oligo （ dT ）与纯化的 mRNA 混合， oligo （ dT ）会与 poly (A) 结合作为反转录酶的引物，反转录反应的产物是一条 RNA-DNA 的杂交链。 oligo （ dT ）结合在 mRNA 的 3' 端，因此合成全长的 cDNA 需要反转录酶从 mRNA 分子的一端移动到另一端，有时这种全合成难以达到，尤其是 mRNA 链很长时，为此建立了一种随机引物法合成 cDNA 。随机引物是一种长度为 6~10 个核苷酸，由 4 种碱基随机组成的 DNA 片段。与 oligo （ dT ）仅与 mRNA 3' 端结合不同，它们可以在 mRNA 的不同位点结合。随机引物法合成的产物也是 RNA-DNA 的杂交体。把 cDNA 克隆到载体中之前，必须把这种杂交体中的 RNA 转变成 DNA 链，即形成双链 DNA 分子。
3. 将 cDNA 重组到载体上
简述cdna文库的构建过程
从RNA转录到cDNA：构建cdna文库的全过程cDNA文库是研究生命科学的一个重要工具。
在研究基因表达、肿瘤学、医学遗传学等方面，cDNA文库都有着重要的应用价值。
cDNA文库的构建过程是一个复杂而细致的工作，需要精确的实验操作和仔细的分析。
本文将从RNA提取、反转录、PCR扩增等方面全面介绍cDNA 文库构建的全过程。
第一步：RNA提取与质量检测cDNA文库的构建前提是需要RNA，因此首先需要从细胞或组织中提取RNA。
RNA提取是一个关键的步骤，需要注意的是，样本中的RNA 应该要完整、高纯度、无分解。
提取的RNA要经过质量检测，主要检测指标为RNA完整性和质量。
第二步：RNA反转录RNA反转录是将RNA转录成cDNA的过程。
该步骤中需要用到反转录酶、dNTPs以及随机引物等试剂。
将RNA与反转录试剂混合，进行酶促反应，即可将RNA转录成cDNA。
此外，为了避免DNA组合不完整，要进行加热反应。
反转录后的cDNA还需进行纯化和浓缩。
第三步：PCR扩增得到纯化后的cDNA样品，需要进行PCR扩增。
根据实验设计的需要，设计引物，进行PCR扩增。
PCR扩增主要有两步，第一步是降温，使引物与cDNA结合；第二步是升温，进行DNA链的扩增。
扩增完毕后，进行等电泳检测，筛选出符合条件的基因，即可进行下一步操作。
第四步：构建文库接下来是将PCR扩增的产物进行纯化和接头处理，使其成为适合测序的文库。
一般都是采用pUC 18或pGEM T系列质粒作为载体，将PCR产物与载体进行连接，构建cDNA文库。
文库构建完成后，还需进行质控、存储和测序等后续处理。
总之，cDNA文库的构建需要有系统性的实验设计、操作及仔细的数据记录，每一个步骤都需要严格掌控。
只有将每一个步骤都做好，才能得到合格的cDNA文库，为后续的实验提供有力支撑。
cDNA文库构建-PPT课件 135页PPT
•构建流程
抽提基因组 DNA 鸟枪法制备DNA片 段 DNA片段与载体重组
转化宿主菌
筛选目的基因（核酸探序列分析 基因在染色体上的定位 克隆鉴定基因调控元件 基因组中基因的结构和组织形式分析
根据基因类型（重组DNA片段的供体） 基因组 和cDNA1、基因组
★ 基因组(gene library)：用重组DNA
技术，将某种生物细胞的总DNA或染色体DNA切割成一定大 小的片段，并与合适的载体重组后，然后转移到适当的宿主 细胞中，通过细胞增殖而构成各个片段的无性繁殖系（克 隆），这些存在于所有重组时已排除了其它的RNA，使假阳性率减低。 (5) cDNA可在细菌中表达，可用多种策略进行筛选。
一个细胞在任何时间可以产生几千种不同的蛋白质，所 有的蛋白质都有相应的mRNA分子。为了鉴别其中任何一个 mRNA分子，每一单独mRNA的克隆都得考虑，但是mRNA 不能直接用于克隆，因为它很不稳定，因此，可以合成与选 定组织中所有mRNA互补的DNA分子（complementary 的表达。
注意
(1) 细胞中不同mRNA的丰度不同，低丰度的mRNA要求很 高的克隆数(要用公式来计算)。 (2)有的基因表达具有严格的时空性，要获得其mRNA并非 易事。用不同发育阶段，或。 不能用于基因结构和调节的研究。一个基因经不同的剪接可 产生不同的部分重叠的cDNA克隆。 基因与基因库（gene bank） 区别
基因库是指选取其中重组体形式贮存起来; ☆ 是和缺失型DNA，或不同时空、不同环 境条件下的两种CDNA样品反复杂交，去处杂交体后，将剩余位 点及选择标记，可通过细菌培养修饰
cdna文库的构建过程
cdna文库的构建过程
cdna文库的构建过程包括以下步骤：
1. RNA提取：从目标细胞或组织中提取总RNA。
2. mRNA纯化：通过亲和层析或磁珠法将mRNA从总RNA中分离出来。
3. 反转录：利用反转录酶将mRNA转录成cDNA。
4. 修饰：为cDNA末端加上适当的连接器，如poly(A)尾部，便于后续PCR扩增。
5. PCR扩增：将cDNA扩增，并通过聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction, PCR）共有两种方法：one-step PCR 和two-step PCR。
6. 克隆：使用克隆技术将cDNA插入载体中。
7. 测序：对文库中的克隆进行测序，得到cDNA序列。
8.数据分析：通过基因注释、比对等方法分析得到的cDNA序列，进一步研究其功能和相关生物学过程。
以上是一般情况下的cdna文库构建过程，不同实验室根据具体需求会有部分不同的处理步骤和程序，如加入不同的连接器或使用不同的测序技术等。
cdna文库的构建步骤
CDNA文库的构建步骤一、引言在分子生物学和基因组学研究中，建立cDNA文库是一项重要的实验技术。
cDNA文库是从mRNA中合成的互补DNA（cDNA）的集合，它能够反映细胞中mRNA的表达情况。
本文将详细探讨cDNA文库构建的步骤和流程。
二、cDNA文库构建步骤2.1 RNA提取与纯化在构建cDNA文库之前，首先需要提取和纯化所需基因表达的RNA，这是启动构建cDNA文库的关键步骤。
1.准备细胞样本或组织样本。
2.使用适当的方法（例如TriZol法、RNA纯化试剂盒）提取总RNA。
3.通过离心等手段去除DNA和蛋白质等杂质。
4.使用酶切RNA的方法去除rRNA等非编码RNA。
2.2 逆转录合成cDNA逆转录是将RNA转录成cDNA的过程，这是构建cDNA文库的关键步骤之一。
1.准备RNA模板和引物，引物可以是随机引物或特定引物。
2.将RNA样本与引物混合，在特定条件下进行反应。
3.添加逆转录酶（如Reverse Transcriptase），逆转录酶能合成cDNA的互补序列。
4.根据反应体系的要求进行反应，通常涉及温度和时间的控制。
5.利用热敏聚合酶（如Taq DNA Polymerase）可加热光敏不稳定的逆转录酶，从而停止逆转录反应，并保持产物的合成。
2.3 cDNA文库构建cDNA文库的构建涉及PCR扩增、酶切、连接和转化等步骤，下面详细介绍。
2.3.1 PCR扩增1.准备扩增反应液：包括cDNA模板、引物（正向引物和反向引物）、dNTPs和聚合酶等。
2.设置PCR扩增条件，包括温度、循环数和时长等。
3.进行PCR扩增反应，其中cDNA模板将作为DNA合成的起始物，引物将提供扩增的特异性。
2.3.2 酶切1.使用限制性内切酶对扩增产物和载体进行酶切。
2.确定酶切产物的大小和酶切位点。
2.3.3 连接1.准备连接试剂盒和连接系统。
2.混合酶切产物和合适的载体，进行连接反应。
3.控制反应条件，如温度和时间。
cdna文库的构建
cdna文库的构建
首先需要提取出RNA分子的互补DNA（cDNA），然后将其克隆到载体上，形成一个cDNA文库。
具体的步骤如下：
1. RNA提取：从组织或细胞中提取RNA。
2. 逆转录：利用逆转录酶将RNA转变成cDNA。
逆转录酶可以用几种不同的方法，包括反转录PCR方法和反转录特异性引物的方法。
3. 双链cDNA合成：将一端的oligo dT引物与头部的mRNA 低复杂度区域杂合，随后，通过使用逆转录酶(polymerase)来合成第一条链，然后再合成第二条链，以得到双链cDNA。
4. 手工或机器克隆：将cDNA克隆到载体中。
手工克隆使用限制性内切酶和连接酶来插入cDNA，而机器化克隆则使用高通量自动克隆技术。
5. 图书馆筛选：初步筛选文库，以分离包含所需基因的克隆。
6. 验证和测序：最后，通过验证所得克隆的插入片段的尺寸和序列，并使用测序技术对其进行测序。
总的来说，构建cdna文库需要耗费较多的时间和精力，但它
是研究基因表达的重要手段。
对于生物学、医学、农业等领域的研究都具有非常重要的意义。
cDNA文库的构建
cDNA文库的构建基因文库的构建是现代生命科学研究中的一项重要技术。
自70年代初首例cDNA克隆问世以来，已用构建和筛选cDNA文库的方法克隆了很多基因。
通过构建cDNA文库能直接分离到生命活动过程中的一些调控基因及了解这些基因所编码的蛋白质的相互作用关系．因此cDNA文库的构建是基因克隆的重要方法之一，从cDNA文库中可以筛选到所需的目的基因，并直接用于该目的基因的表达。
它是发现新基因和研究基因功能的工具。
1.cDNA文库构建的原理真核生物基因的结构和表达控制元件与原核生物有很大的不同。
真核生物的基因是断裂的，在基因最后产物中表达的编码序列（外显子）被非编码序列（内含子）分隔开，需经RNA转录后加工过程才使编码序列拼接在一起。
真核生物的基因不能直接在原核生物中表达，只有将加工成熟的mRNA经逆转录合成互补的DNA（complementary DNA,cDNA）接上原核生物表达控制元件，才能在原核生物中表达。
而且，真核细胞的基因通常只有一小部分进行表达，由于mRNA的不稳定性，对基因表达和有关mRNA都常通过对其cDNA来进行研究。
为分离cDNA克隆或研究细胞的cDNA 谱，需要先构建cDNA文库。
所谓cDNA文库是指细胞全部mRNA逆转录成cDNA并被克隆的总和。
cDNA文库应包含的克隆数目可由以下公式来计算：N=ln(1-p)/ln(1-1/n)式中：N－cDNA文库所包含的克隆数目；P－低丰度cDNA存在于库中的概率，通常要求其大于99％；1/n－每一种低丰度mRNA占总mRNA的分数。
2.构建cDNA文库的基本步骤构建cDNA文库的基本步骤有五步：①制备mRNA；②合成cDNA；③制备载体DNA；④双链cDN 的分子克隆；⑤对构建的cDNA文库进行鉴定，测定文库包含的克隆数，抽查克隆的质量和异质性，如果需要可适当扩增。
对cDNA的文库的要求：一是希望文库能包括各种稀有mRNA的cDNA克隆；二是克隆的cDNA应是全长的，避免丢掉5’端的序列。
简述cDNA文库构建的方法
简述cDNA文库构建的方法1．1 mRNA纯化构建一个cDNA文库的第一步是分离在某一给定的组织或细胞类型表达的mRNA。
mRNA仅占细胞总RNA的1%～5%，因而需要另外的纯化技术来富集mRNA。
从细胞总RNA中分离mRNA是根据实际上所有真核细胞mRNA 3’端有一长的伸展的腺嘌呤核苷，这个序列被称为poly(A)尾巴，是mRNA分子特有的而其他主要RNA 没有，poly(A)尾通常有足够的长度因而能与人工合成的互补的寡脱氧胸苷酸（oligo(dT)）杂交。
正是这种特性使得mRNA从RNA分子的混合物中分离出来。
方法有三种：·寡脱氧胸苷酸亲和层析：即分离mRNA的标准方法，将一个寡脱氧胸苷酸（12~18碱基）连接到纤维素的亲和层析柱法，总RNA混合物上样后，mRNA与寡脱氧胸苷酸退火。
非poly(A)RNA不结合并很容易从柱子洗去。
用低盐缓冲液洗柱，己结合的mRNA很快洗脱出来。
·溶液杂交：本方案也用寡脱氧胸苷酸－纤维素，但不用层析柱，而是将基质直接加到总RNA溶液中。
退火和洗涤步骤通过离心含有RNA沉淀的基质在溶液中完成。
·生物素标记寡脱氧胸苷酸和链霉亲和素包被磁性球珠：本方案中，一个生物素标记的寡脱氧胸苷酸酸引物在溶液中与总RNA退火，然后加入以链霉亲和素包被的磁性球珠，用磁分离器从大量溶液中分离球珠－mRNA复全体。
移去磁分离器，加入洗脱缓冲液，并重复磁性分离步骤。
在无盐的状态下，寡脱氧胸苷酸引物从mRNA上解离。
1.2cDNA的合成与克隆1.2.1 cDNA第一条链的合成所有合成cDNA第一条链的方法都要用依赖于RNA的DNA聚合酶（反转录酶）来催化反应，有两个关键的因素，一个是mRNA模板，另一个反转录酶。
目前商业化的反转录酶主要有两种：一种是禽源反转录酶(reverse transcriptase)，另一种是鼠源反转录酶。
两种酶都无3’－5’外切酶活性，但禽源反转录酶有很强的RNAase H酶活性，鼠源的具有相对较弱的RNAaseH酶活性。
全长cDNA文库的构建方法
全长cDNA文库的构建方法全长cDNA文库的构建是基因组学研究中的重要步骤，它能够捕获一个生物体所有的转录本，为基因表达、功能研究和基因组注释提供有用的信息。
下面将介绍一种常用的全长cDNA文库构建方法。
样本准备需要准备含有目标转录本的细胞或组织样本。
这些样本可以是新鲜或冷冻的，只要它们的质量和数量能够满足后续步骤的需求。
对于一些需要特殊处理的样本，如动物组织，需要按照相关法规进行采集和处理。
RNA提取从样本中提取高质量的RNA是构建全长cDNA文库的关键步骤。
常用的RNA提取方法是Trizol法或RNAiso Plus法。
这些方法能够有效地分离出RNA，并且可以去除大部分的蛋白质和基因组DNA。
在提取RNA后，需要对其质量和浓度进行检测，以确保其适用于后续步骤。
反转录将RNA进行反转录，生成cDNA，是构建全长cDNA文库的另一个关键步骤。
常用的反转录方法是 oligo(dT)引物法和随机引物法。
oligo(dT)引物法利用了mRNA特有的poly(A)尾，能够捕获mRNA进行反转录。
随机引物法则利用了引物结合在RNA的任意位置，也能捕获全长的cRNA。
在反转录完成后，需要检测cDNA的浓度和特异性，以确保其适用于后续步骤。
文库构建在得到全长cDNA后，需要将其克隆到载体中，构建成文库。
常用的载体有质粒、噬菌体和BAC等。
这些载体都能够在细菌中进行复制和扩增，使得文库的规模得以扩大。
在构建文库时，需要确保cDNA的插入率和多样性，以避免后续步骤中的误差。
文库质量检测在构建完全长cDNA文库后，需要对其质量进行检测。
随着生物技术的不断发展，基因组学和蛋白质组学研究取得了突破性进展。
在此基础上，研究者们开始mRNA转录本的全长序列，即cDNA。
cDNA文库的构建对于基因表达、功能研究和比较基因组学等领域具有重要意义。
本文将探讨全长cDNA文库的构建方法及其应用研究。
全长cDNA文库构建的关键问题包括如何获取全长的、完整的mRNA转录本，以及如何将这些转录本有效克隆到表达载体中。
简述cDNA文库构建的方法
简述cDNA文库构建的方法简述cDNA文库构建的方法1．1 mRNA纯化构建一个cDNA文库的第一步是分离在某一给定的组织或细胞类型表达的mRNA。
mRNA仅占细胞总RNA的1%～5%，因而需要另外的纯化技术来富集mRNA。
从细胞总RNA中分离mRNA是根据实际上所有真核细胞mRNA 3’端有一长的伸展的腺嘌呤核苷，这个序列被称为poly(A)尾巴，是mRNA分子特有的而其他主要RNA 没有，poly(A)尾通常有足够的长度因而能与人工合成的互补的寡脱氧胸苷酸（oligo(dT)）杂交。
正是这种特性使得mRNA从RNA分子的混合物中分离出来。
方法有三种：·寡脱氧胸苷酸亲和层析：即分离mRNA的标准方法，将一个寡脱氧胸苷酸（12~18碱基）连接到纤维素的亲和层析柱法，总RNA混合物上样后，mRNA与寡脱氧胸苷酸退火。
非poly(A)RNA不结合并很容易从柱子洗去。
用低盐缓冲液洗柱，己结合的mRNA很快洗脱出来。
·溶液杂交：本方案也用寡脱氧胸苷酸－纤维素，但不用层析柱，而是将基质直接加到总RNA溶液中。
退火和洗涤步骤通过离心含有RNA沉淀的基质在溶液中完成。
·生物素标记寡脱氧胸苷酸和链霉亲和素包被磁性球珠：本方案中，一个生物素标记的寡脱氧胸苷酸酸引物在溶液中与总RNA退火，然后加入以链霉亲和素包被的磁性球珠，用磁分离器从大量溶液中分离球珠－mRNA复全体。
移去磁分离器，加入洗脱缓冲液，并重复磁性分离步骤。
在无盐的状态下，寡脱氧胸苷酸引物从mRNA上解离。
1.2cDNA的合成与克隆1.2.1 cDNA第一条链的合成所有合成cDNA第一条链的方法都要用依赖于RNA的DNA聚合酶（反转录酶）来催化反应，有两个关键的因素，一个是mRNA模板，另一个反转录酶。
目前商业化的反转录酶主要有两种：一种是禽源反转录酶(reverse transcriptase)，另一种是鼠源反转录酶。
两种酶都无3’－5’外切酶活性，但禽源反转录酶有很强的RNAase H酶活性，鼠源的具有相对较弱的RNAaseH酶活性。
cdna文库构建过程
cdna文库构建过程
cdna文库构建过程
cdna文库构建是一种从逆转录提取mRNA，并将其转化成可用于克隆的DNA片段的方法，并将其用于测序等分子生物学研究。
下面の流程介绍了cdna文库构建的步骤：
1. 样本准备：收集合适的活菌样本，细胞经过lysis处理，可以获得核酸提取液，用于cdna文库构建。
2. 微小RNA提取：将液体样本经过cDNA合成，利用内源Oligo dT链条的帮助，在rRNA与mRNA之间断开，就可以获得微小RNA。
3. cdna合成：将液体样本经过反转录，也就是mRNA转化为cDNA，就可以获得cdna文库。
4. 再次纯化：将cdna文库经过再次纯化，去除反转录产物及其他污染源，经过QC后，就可以开始克隆。
5. cDNA克隆：将cdna文库再次纯化的片段植入到克隆载体上，就可以获得cDNA克隆文库。
6. 测序：最后将克隆文库经过测序，就可以获得cdna序列，进行进一步的分子生物学研究。
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文库构建
cDNA基因文库的构建2009-10-11 17:56:18| 分类：||一、cDNA文库的特征和发展：cDNA (complementary DNA):以mRNA为模板，在反转录酶的作用下合成的与之反向互补的DNA链(单链cDNA，反义链)，以单链cDNA为模板还可以合成其反向互补链(取代mRNA的DNA链，正义链)，得到双链cDNA。
将生物某一组织细胞中的总的mRNA分离出来作为模板，在体外用反转录酶合成互补的双链cDNA，然后连接到合适的载体上，并转入宿主细胞。
这种方法所形成的所有克隆的集合体叫cDNA文库。
1）cDNA只含有对应于成熟mRNA的转录区，不含启动子、终止子、内含子、基因间隔区等。
2）cDNA一般较短，平均长度1.5kb左右，多数为100bp至10kb。
3）表达谱的时空动态性决定了cDNA文库的多样性。
4）不同基因的cDNA间存在丰度上的差异。
二、cDNA文库的构建：1、RNA的分离mRNA是构建cDNA文库的起始材料。
总RNA中绝大多数是tRNA和rRNA，而mRNA只占总RNA的1﹪-5﹪，平均为2%，mRNA的比例取决于细胞类型和细胞的生理状态。
由于mRNA在总RNA中所占比例很小，因此从总RNA中富集mRNA是构建cDNA文库的一个重要步骤。
通过降低rRNA和tRNA含量，可大大提高筛选到目的基因的可能性。
利用Poly(A)尾巴纯化或直接提取mRNA。
1）根据研究目标合理选择器官、组织和细胞类型以及合理的环境条件，用于提取RNA。
2）保持mRNA的完整性，是构建全长cDNA文库的核心。
3）选取合适的提取方法，除完整性外，mRNA还要求纯度高、DNA污染少，最好是采用无RNase的DNase去除杂质DNA。
4）RNA定量准确，保存合理。
5）根据目标和条件决定是否需要纯化mRNA或直接使用总RNA。
2、第一链cDNA的合成由mRNA到cDNA的过程称为反转录(reverse transcription,RT)，由反转录酶(reverse transcriptase, RTase)催化。
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PCR基因扩增
• 目的：增加目的DNA的数量
过程：
• 1、将PCR使用的药品、试剂从冰箱取出，冰浴放置。按照 PCR反应体系加药品，加药完毕后，用微型离心机离心数秒， 使所加药品混匀。
• 2、PCR反应体系
• 在0.2ml PCR管内配制25ml反应体系
• 3、PCR反应程序： • 预变性 • 变性 • 退火 • 延伸 • 再延伸
• (4)PCR反应完成后的样品4℃下短时间保存。-20℃下可 以保存数周。
双链cDNA连接到质粒或噬菌体载体并导入 大肠杆菌中繁殖
• 将合成的双链重组到质粒载体或噬菌体载体上,转化大肠 杆菌寄主细胞增殖.
• 1,同聚物加尾法 • 利用小牛胸腺末端转移酶在双链cDNA和质粒载体的3'-端
都加上一个互补的同聚片段,通过退火使两个连接片段成 重组质粒,再将重组质粒转化受体细胞. • 同聚物加尾法克隆双链cDNA • 2,接头-衔接头法 • 3,mRNA-cDNA克隆法
蓝白斑筛选：• 找出需构建的目的（3）cDNA第二条链的合成。
（4）双链cDNA的修饰。
（5）双链c提取与分离 B. 第一链cDNA的合成 C. 第二链cDNA的合成 D. 双链cDNA连接到质粒或噬菌体载体并导入大肠杆菌中
• 2、在锥瓶的瓶口用玻璃纸封口，留有一定空隙。然后在 微波炉中加热溶解琼脂糖。加热时，当溶液沸腾后，请 戴上防热手套，小心摇动锥瓶，使琼脂糖充分均匀溶解。
• 3、使溶液冷却至50℃-60℃左右，在此时按照1 μL / 10 mL的比例加入4S green染料，并充分混匀。
• 4、将琼脂糖溶液倒入制胶模中，凝胶厚度一般在3~5 mm之间。注意不要形成气泡。制胶模如下图所示，若需 切胶回收，凝胶可适当加厚。
• 5、在室温下使胶凝固，大约30分钟~1小时。
点样
• 1、取适量样品与6×上样缓冲液混匀（如：1 μl样品与5 μl 6×上 样缓冲液），用微量移液枪小心加入样品槽中。
• 2、上样量根据样品浓度可适当调整，若DNA含量偏低，则可依 上述比例增加上样量，但总体积不可超过样品槽容量（一般小孔 40 μl 为上限，大孔200 μl 为上限，具体和制胶膜规格相关）。
第二链cDNA的合成：
第二链的合成 第一链的合成反应完成后，得到DNA/RNA 杂交分子，在DNA聚合酶的作用下，以第 一链为模版，合成cDNA的第二链。 自身引导 变性降解除去杂交分子中的RNA,单链 cDNA的3'端能够形成发夹状的结构作为引 物,在大肠杆菌聚合酶I Klenow或反转录酶 的作用下,合成cDNA的第二链. 自身引导法合成双链cDNA
• （二）琼脂糖凝胶电泳检测DNA
• 1、配制0.1的琼脂糖凝胶，取50ml0.5*TBE加入0.5g琼脂糖。 加热溶解后，再加入5μl 4s Green。
• 2、点样时，样品和6*loading buffer按照1:5的比例，混合均 匀后点样。
• 3、点样完成后，80V恒压电泳40min左右。
第一链cDNA的合成：
• 以RNA为模板在反转录酶作用下生成第一条链 • 第一链的合成 • oligo(dT)引导的DNA合成法: • 利用真核mRNA分子所具有的poly(A)尾巴的特性,加入
12-20个脱氧胸腺嘧啶核苷组成的oligo(dT)短片段,由反 转录酶合成cDNA的第一链.
缺 陷:
•因为逆转录酶无法到达mRNA分子的5'-末端,必须从3'-末端 开始合成cDNA.对于大分子量的较长的mRNA分子而言,特 别麻烦. •随机引物引导的cDNA合成法 (randomly primed cDNA synthesis) : •根据许多可能的序列,合成出6-10个核苷酸长的寡核苷酸短 片段(混合物),作为合成第一链cDNA的引物.在应用这种混合 引物的情况下,cDNA的合成可以从mRNA模板的许多位点同 时发生,而不仅仅从3'-末端的oligo(dT)引物一处开始.
• 4、加药完成后，微型离心机离心10s左右。放置于PCR 反应孔中，设置程序后开始反应。
• 5、琼脂糖凝胶电泳分析PCR结果
• (1)PCR反应完成后，配制50ml 1％的琼脂糖凝胶。
• (2)取1微升反应完成的样品+5微升6*loading-buffer混合 均匀后点样。
• (3)利用琼脂糖凝胶电泳分析PCR结果。
• 6、加入1mL75%乙醇洗涤沉淀。12000rpm 4℃离心3min， 弃上清室温干燥5-10min。(用1mL75%乙醇洗涤沉淀；不要 倒出沉淀，剩余少量液体短暂离心，然后用枪头吸出。)
• 7、加入20μl RNase-free ddH2O，充分溶解RNA，将所得 到的RNA溶液置于-70℃保存或用于后续实验。
繁殖
RNA的分离：
• 1、取大约1cm2植物叶片，在研钵中充分研磨后转移到 1.5ml离心管。加入大约1ml TotalRNAExtrzctor。
• 2、将裂解后样品和匀浆液室温放置5-10min。使得核蛋白 与核酸完全分离。(样品中如含有较多的蛋白质、多糖、脂 肪或其他细胞外基质，可以12000rpm离心10分钟，移去 漂浮的油脂，取上清。)
缺 点:
• 在以S1核酸酶切割cDNA的发夹状结构时,会导致对应于 mRNA 5'端的地方的序列出现缺失和重排. S1核酸酶的纯 度不够时,会偶尔破坏合成的双链cDNA分子.
琼脂糖凝胶电泳检测DNA
• 目的：检测提取DNA的准确性。
过程:
胶板的制备
• 1、将有机玻璃内槽、梳子和水平制胶器洗净、晾干。晾 干后将其组装，放置于稳定平面上。
• 3、加入0.2ml氯仿，剧烈震荡15sec，室温放置3min。 12000rmp4℃离心10min。
• 4、吸取上层水相转移至干净的离心管中，加入等体积异 丙醇，混匀，市室温放置20min。
• 5、12000rpm4℃离心10min，弃上清。(离心前RNA沉淀通 常是不可见的，离心后在管侧和管低形成胶状沉淀。)
方 法:
• 在mRNA反转录合成cDNA第一链后,将dA残基加到 mRNA:cDNA杂交体上,然后与带dT尾的克隆载体连接,转 化受体细胞,在宿主细胞内,mRNA被降解并代之以DNA.
缺 点:
• 克隆的效率低(为双链cDNA克隆的1/10) • 4,Okayama-Berg 卓 答 疑：栗建辉：
• 定义： • (cDNA Library)某种生物基因组转录的全部mRNA经反转
录产生的cDNA片段分别与克隆载体重组，物种的全部mRNA为模板，逆转录 形成的互补DNA（cDNA）与适当的载体（常用噬菌体 或质粒载体）连接后转化受体菌形成重组DNA克隆群， 这样包含着细胞全部mRNA信息的cD中，在特定发育阶加完一个样品要更换枪头，以防止互相污染，注意上样时 要小心操作，避免损坏凝胶或将样品槽底部凝胶刺穿。
• 三、电泳 • 1、加完样后，合上电泳槽盖，立即接通电源。控制电压保持在
110 V，电流在40 mA左右。 • 2、当条带移动到胶板2/3时（约40 min），停止电泳。 • 3、紫外下拍照并观察。