cDNA文库的构建

PCR基因扩增
• 目的：增加目的DNA的数量
过程：
• 1、将PCR使用的药品、试剂从冰箱取出，冰浴放置。按照 PCR反应体系加药品，加药完毕后，用微型离心机离心数秒， 使所加药品混匀。
• 2、PCR反应体系
• 在0.2ml PCR管内配制25ml反应体系
• 3、PCR反应程序： • 预变性 • 变性 • 退火 • 延伸 • 再延伸
繁殖
RNA的分离：
• 1、取大约1cm2植物叶片，在研钵中充分研磨后转移到 1.5ml离心管。加入大约1ml TotalRNAExtrzctor。
• 2、将裂解后样品和匀浆液室温放置5-10min。使得核蛋白 与核酸完全分离。(样品中如含有较多的蛋白质、多糖、脂 肪或其他细胞外基质，可以12000rpm离心10分钟，移去 漂浮的油脂，取上清。)
• 以RNA为模板在反转录酶作用下生成第一条链 • 第一链的合成 • oligo(dT)引导的DNA合成法: • 利用真核mRNA分子所具有的poly(A)尾巴的特性,加入
12-20个脱氧胸腺嘧啶核苷组成的oligo(dT)短片段,由反 转录酶合成cDNA的第一链.
缺 陷:
•因为逆转录酶无法到达mRNA分子的5'-末端,必须从3'-末端 开始合成cDNA.对于大分子量的较长的mRNA分子而言,特 别麻烦. •随机引物引导的cDNA合成法 (randomly primed cDNA synthesis) : •根据许多可能的序列,合成出6-10个核苷酸长的寡核苷酸短 片段(混合物),作为合成第一链cDNA的引物.在应用这种混合 引物的情况下,cDNA的合成可以从mRNA模板的许多位点同 时发生,而不仅仅从3'-末端的oligo(dT)引物一处开始.
cDNA文库构建原理：
• 经典cDNA文库构建的基本原理：用Oligo（dT）作逆转 录引物，或者用随机引物，给所合成的cDNA 加上适当 的连接接头，连接到适当的载体中获得cDNA文库。其基 本步骤包括：
（1）mRNA的提纯获取高质量的mRNA是构建高质量的 cDNA文库的关键步骤之一。
（2）cDNA第一条链的合成。
• 2、在锥瓶的瓶口用玻璃纸封口，留有一定空隙。然后在 微波炉中加热溶解琼脂糖。加热时，当溶液沸腾后，请 戴上防热手套，小心摇动锥瓶，使琼脂糖充分均匀溶解。
• 3、使溶液冷却至50℃-60℃左右，在此时按照1 μL / 10 mL的比例加入4S green染料，并充分混匀。
• 4、将琼脂糖溶液倒入制胶模中，凝胶厚度一般在3~5 mm之间。注意不要形成气泡。制胶模如下图所示，若需 切胶回收，凝胶可适当加厚。
第二链cDNA的合成：
第二链的合成 第一链的合成反应完成后，得到DNA/RNA 杂交分子，在DNA聚合酶的作用下，以第 一链为模版，合成cDNA的第二链。 自身引导 变性降解除去杂交分子中的RNA,单链 cDNA的3'端能够形成发夹状的结构作为引 物,在大肠杆菌聚合酶I Klenow或反转录酶 的作用下,合成cDNA的第二链. 自身引导法合成双链cDNA
cDNA文库的构建
主讲人：刘圆圆 制作者：王 卓 答 疑：栗建辉
主要内容：
1. cDNA文库构建的定义 2. cDNA文库构建原理 3. cDNA文库构建的过程
cDNA文库构建的定义：
• 定义： • (cDNA Library)某种生物基因组转录的全部mRNA经反转
录产生的cDNA片段分别与克隆载体重组，并将其引入到 相应的宿主细胞中（一般为.）繁殖和扩增，理论上此群 体就包含有该物种的全部mRNA信息，称该生物基因组 的cDNA文库。 • cDNA文库是以特定的组织或细胞mRNA为模板，逆转录 形成的互补DNA（cDNA）与适当的载体（常用噬菌体 或质粒载体）连接后转化受体菌形成重组DNA克隆群， 这样包含着细胞全部mRNA信息的cDNA克隆集合称为该 组织或细胞的cDNA文库。cDNA文库特异地反映某种组 织或细胞中，在特定发育阶段表达的蛋白质的编码基因， 因此cDNA文库具有组织或细胞特异性。
• 3、加入0.2ml氯仿，剧烈震荡15sec，室温放置3min。 12000rmp4℃离心10min。
• 4、吸取上层水相转移至干净的离心管中，加入等体积异 丙醇，混匀，市室温放置20min。
• 5、12000rpm4℃离心10min，弃上清。(离心前RNA沉淀通 常是不可见的，离心后在管侧和管低形成胶状沉淀。)
缺 点:
• 在以S1核酸酶切割cDNA的发夹状结构时,会导致对应于 mRNA 5'端的地方的序列出现缺失和重排. S1核酸酶的纯 度不够时,会偶尔破坏合成的双链cDNA分子.
琼脂糖凝胶电泳检测DNA
• 目的：检测提取DNA的准确性。
过程:
胶板的制备
• 1、将有机玻璃内槽、梳子和水平制胶器洗净、晾干。晾 干后将其组装，放置于稳定平面上。
• 4、加药完成后，微型离心机离心10s左右。放置于PCR 反应孔中，设置程序后开始反应。
• 5、琼脂糖凝胶电泳分析PCR结果
• (1)PCR反应完成后，配制50ml 1％的琼脂糖凝胶。
• (2)取1微升反应完成的样品+5微升6*loading-buffer混合 均匀后点样。
• (3)利用琼脂糖凝胶电泳分析PCR结果。
蓝白斑筛选：
• 找出需构建的目的文库
• 5、在室温下使胶凝固，大约30分钟~1小时。
点样
• 1、取适量样品与6×上样缓冲液混匀（如：1 μl样品与5 μl 6×上 样缓冲液），用微量移液枪小心加入样品槽中。
• 2、上样量根据样品浓度可适当调整，若DNA含量偏低，则可依 上述比例增加上样量，但总体积不可超过样品槽容量（一般小孔 40 μl 为上限，大孔200 μl 为上限，具体和制胶膜规格相关）。
• 3、每加完一个样品要更换枪头，以防止互相污染，注意上样时 要小心操作，避免损坏凝胶或将样品槽底部凝胶刺穿。
• 三、电泳 • 1、加完样后，合上电泳槽盖，立即接通电源。控制电压保持在
110 V，电流在40 mA左右。 • 2、当条带移动到胶板2/3时（约40 min），停止电泳。 • 3、紫外下拍照并观察。
• 6、加入1mL75%乙醇洗涤沉淀。12000rpm 4℃离心3min， 弃上清室温干燥5-10min。(用1mL75%乙醇洗涤沉淀；不要 倒出沉淀，剩余少量液体短暂离心，然后用枪头吸出。)
• 7、加入20μl RNase-free ddH2O，充分溶解RNA，将所得 到的RNA溶液置于-70℃保存或用于后续实验。
• （二）琼脂糖凝胶电泳检测DNA
• 1、配制0.1的琼脂糖凝胶，取50ml0.5*TBE加入0.5g琼脂糖。 加热溶解后，再加入5μl 4s Green。
• 2、点样时，样品和6*loading buffer按照1:5的比例，混合均 匀后点样。
• 3、点样完成后，80V恒压电泳40min左右。
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第一链cDNA的合成：
方 法:
• 在mRNA反转录合成cDNA第一链后,将dA残基加到 mRNA:cDNA杂交体上,然后与带dT尾的克隆载体连接,转 化受体细胞,在宿主细胞内,mRNA被降解并代之以DNA.
缺 点:
• 克隆的效率低(为双链cDNA克隆的1/10) • 4,Okayama-Berg法合成并克隆双链cDNA
• (4)PCR反应完成后的样品4℃下短时间保存。-20℃下可 以保存数周。
双链cDNA连接到质粒或噬菌体载体并导入 大肠杆菌中繁殖
• 将合成的双链重组到质粒载体或噬菌体载体上,转化大肠 杆菌寄主细胞增殖.
• 1,同聚物加尾法 • 利用小牛胸腺末端转移酶在双链cDNA和质粒载体的3'-端
都加上一个互补的同聚片段,通过退火使两个连接片段成 重组质粒,再将重组质粒转化受体细胞. • 同聚物加尾法克隆双链cDNA • 2,接头-衔接头法 • 3,mRNA-cDNA克隆法
（3）cDNA第二条链的合成。
（4）双链cDNA的修饰。
（5）双链cDNA的分子克隆。
（6）cDNA文库的扩增。
（7）cDNA文库鉴定评价。
cDNA文库构建的过程
步骤： A. RNA的提取与分离 B. 第一链cDNA的合成 C. 第二链cDNA的合成 D. 双链cDNA连接到质粒或噬菌体载体并导入大肠杆菌中