人体外周血淋巴细胞染色体制备与观察实验方案.

实验方案

实验外周血淋巴细胞培养及染色体标本制备，染色体组型分析

一、实验目的

1、了解动物细胞培养的方法。掌握人体外周血淋巴细胞培养与染色体标本制备。

2、初步掌握人类染色体G－带的显示方法及人类染色体G－带在染色体识别中的意义。

3、熟悉人类染色体的镜下检查和核型分析方法。初步掌握人类染色体G带的特征及其识别。

二、实验原理

所谓外周血培养即是将外周血接种在适当的培培养物中加入适量的秋水仙素，使纺锤体微管解聚，这样细胞停留在中期，可以获得大量的分裂细胞。用低渗盐溶液（一般是0.075mol/L的KCl）处理，使其中的红细胞及分裂相细胞膜和一部分细胞质除去，最后以气干法制片，可获得较好的染色体养基中进行培养。人类外周血细胞本来是终末分化细胞，一般没有分裂能力，但经PHA（植物血球凝集素）或ConA等药物刺激后，转变成可分裂的转化细胞。

染色体显带是将染色体标本经过一定程序处理，并用特定染料染色，使染色体沿其长轴显现明暗或深浅相间的横行带纹――染色体带，这种技术，称为染色体显带技术。通过显带，人们可以准确地识别每一条染色体及染色体上的各个区段，并可发现染色体上较细微的结构变化。

在所有的显带技术中，G显带（G banding）是最常见的显带技术，它是将染色体标本用碱、胰蛋白酶或其它盐溶液处理后，再用Giemsa染液染色，在普通显微镜下，可见深浅相间的带纹，称G带（G band）。G显带方法简便，带纹清晰，染色体标本可以长期保存，因此被广泛用于染色体病的诊断和研究。

正常人类染色体的数目为46条(23对)，1960年的Denver会议和1963年的London会议制定了统一的人类染色体命名体制：按照染色体的相对长度、臂比和着丝粒指数，将常染色体（22对）按大小用阿拉伯数字标记，顺次排列为1～22号，性染色体用X和Y标记；并按染色体大小和着丝粒位置，把人类染色体分为七个组，用大写字母A～G表示。染色体经显带处理后，每条染色体都显示出其特定的带纹特征（见下表）。根据这些特征，可以准确地识别每条染色体，检出染色体数目或结构畸变。

表1 人染色体组型及其特征

三、实验试剂与器材

试剂：抗凝剂：肝素溶液（500U/ml）；

培养基：RPMI1640, 按照说明书配制后抽滤、分装，冻存备用。小牛血清：市售，冰冻保存，用时在56℃水浴条件灭活。植物血球凝集素（PHA）：市售，按说明书要求使用

抗菌素：青霉素：50000U/ml，链霉素：50000ug/ml，均用无菌生理盐水配制中的终浓

度均为100 U/ml

5%NaHCO3

秋水仙素：20ug/ml

低渗溶液：0.075mol/L氯化钾固定液：甲醇：冰乙酸（3：1）

胰蛋白酶溶液：用灭菌生理盐水配制成0.1%的胰蛋白酶溶液，用3%Tris溶液调节pH至7.0。

Giemsa染液：磷酸缓冲液（pH6.8）10ml加Giemsa原液0.3ml，用时配制。

器材：光学显微镜 1台，离心机 1台，恒温水浴箱 1台，恒温箱 1台，离心管3 支，量简2个，烧杯 2只，培养瓶3个，冷湿载玻片3张，玻片架 1台，注射器1支，碘酒和酒精棉球，酒精灯，1台，天平 1台，普通冰箱 1台，立式染缸 1个、染色架 1个、镊子3个，直头小吸管 3支、橡皮吸头 3个、吸水纸若干，香柏油，擦镜纸，剪子 1个，胶水。正常人类染色体G带核型图，核型报告纸四、实验方法

（一）培养液配制（在超静工作台内无菌操作）；

每个培养瓶（容积30ml）中加入5ml培养液，其中含： RPMI1640 4ml 灭活小牛血清 1ml PHA 2.5mg 青霉素 500U 链霉素 500ug

依次将上述试剂加入培养瓶中，反复吹打使其混合均匀，用5%NaHCO3调节培养基的pH值至7.2-7.4。

（二）采血与培养：先以碘酒和75%乙醇消毒皮肤。用2ml灭菌注射器吸取约0.2ml肝素,作静脉穿刺，抽取外周静脉血1ml。转动针筒以混匀肝素

常规消毒后，立即将针头插入灭菌小瓶内，送入超净工作台，在火焰旁将血液滴入2～3个盛有5ml培养液的培养瓶内，每瓶0.2～0.3ml（6号针头45度倾斜，

约20滴），盖上橡皮塞，轻轻摇动以混匀。贴好标签，将培养瓶放在37℃恒温箱内静置培养72h。（每天摇动

培养瓶一次）

（三）秋水仙素处理:

向经恒温培养68-72小时的外周血淋巴细胞培养液中加入秋水仙素，使其终浓度为0.4ug/ml,即每瓶（内装5ml培养基）中用6号针头倾斜45度角滴4滴，轻轻将液体摇匀，继续恒温培养2-3小时。

（四）标本的制备:

1、终止培养后，将培养物混匀，倒人离心管内，离心沉淀10分钟(2000r/min)，弃去上清液。

2、加入37℃预温的低渗液8m1，轻轻打匀，置37℃水浴箱中15~20分钟。（使白细胞膨胀，染色体分散、红细胞解体。）

3、低渗处理完毕后，直接加入新配的固定液1 m1进行预固定，混匀后，离心10分钟(2000r/min)。

4、弃去上清液，沿离心管壁缓慢加入固定液4m1，轻轻吹打混匀，置室温15分钟。

5、离心沉淀2000 r/min，10分钟。

6、弃去上情液，再加入固定液4m1吹打均匀重悬细胞，固定10分钟。

7、离心沉淀2000 r/min，10分钟。

8、重复固定一次。

9、尽量吸净上清液，视管底剩下的细胞多少加入适量固定液(0.3～0.6m1)，轻轻吹打成细胞悬液。

10、滴片：取保存在冰水中的冷湿载玻片1张，稍倾斜，用滴管吸取细胞悬液，从30~40cm高处滴2滴于玻片上，立即用口对准玻片吹气，使细胞在玻片上散开，然后在酒精灯上略烘一下(勿全烘干，过火3-5次)，在空气中待干。

（四）染色：

1、常规制备的染色体标本片室温放置3天（老化）后（或37℃干燥20小时），转移到80℃烤箱内干燥2～3小时，自然冷却至室温后取出；

2、将标本片放入盛有胰蛋白酶溶液（预温至37℃）的染色缸中消化（恒温）。（消化片子时，一般准备2~3张片子，第一张一般在胰酶缓冲液中浸泡消化35S,而后染色镜检，如发现细胞膨胀得不大，细胞膜没有破裂，染色体聚集一团伸展不开，可根据具体情况，将消化时间延长1~3s，而后再染色镜检）

3、将消化过的标本片立即放入Giemsa染色液中，室温染色30分钟；

4、自来水轻轻冲洗（冲洗标本片的背面）3～5秒钟，晾干；

5、镜下观察染色体分带及染色情况。

五、实验结果