生化实验报告

生化实验报告

实验一过氧化物酶同工酶的分离提取

一、实验目的

1、初步掌握蛋白质分离纯化的一般步骤，熟悉离心的使用及蛋白质提取中的注意事项。

2、了解过氧化物酶的作用。

二、原理：

过氧化物酶是植物提内普遍存在、活性较高的一种酶，它与呼吸作用、光合作用及生长素的氧化等都有密切关系，在植物生长发育过程中，它的活性不断发生变化，因此测定这种酶的活性，可以反映某一时期植物体内代谢的变化。

本实验以苜蓿种子为材料，低速离心去除细胞碎片，上清用丙酮或硫酸铵沉淀得过氧化物酶同工酶粗品。

三、实验材料、器材及试剂：

（一）材料：苜蓿种子

（二）器材：研钵、超声波粉碎仪、高速冷冻离心机酸度计

（三）实验试剂：

1．丙酮

2．提取缓冲液PBS。

四、实验步骤

1．精确称取4g左右植物样品（若是苜蓿种子，提前用水溶胀好，）加15ml提取缓冲液匀浆；[先将种子称好研碎，再逐渐加入提取缓冲液，匀浆用去10ml，最后洗涤用5ml]

2．13000g离心10min；

3．取清液（量体积），沉淀弃去（清液少许低温保存测定酶活和含量样1）；

蛋白质浓度范围内（1～1000μg），蛋白质与色素结合后在595nm吸光值的大小与蛋白质的浓度呈正比，故可用于蛋白质的定量测定。

考马斯亮蓝G-250与蛋白质的结合十分迅速，2min左右即可达到平衡，其结合物在室温下1小时内保持稳定。此法灵敏度高，易于操作，干扰物较少，是一种比较好的定量方法。其缺点是在蛋白质浓度太高时线形偏低，且不同来源蛋白质与色素的结合状况有一定差别。

三、实验材料、试剂和仪器设备

（一）材料

苜蓿种子

（二）仪器设备

722分光光度计烧杯量筒移液管具塞刻度试管

（三）试剂

1．标准牛血清白蛋白溶液（100μg/ ml）。

2．考马斯亮蓝G-250：

四、实验步骤

（一）标准曲线的绘制

取6支具塞刻度试管，按下表依次加入标准蛋白，向各管中加入考马斯亮蓝G-250溶液5ml，

摇匀，放置5min 左右，用1cm 的比色皿在595nm 处测定吸光值，以蛋白的μg 作纵坐标，吸光值为横坐标绘制标准曲线。

表 绘制标

准曲线各试剂加入量

管号 1 2 3 4 5 6

标准蛋白质（ml ） 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5

蒸馏水（ml ） 1.0 0.9 0.8 0.7 0.6 0.5 换算出的每管的标准蛋白质(μg)（不用加） 0

10 20 30 40 50

(二) 样品的测定

取7支具塞刻度试管，空白1支，其它6支分别加入实验一的3、5、6步骤中的样品(每一样品2个平行样

)0.1ml,各加用蒸馏水0.9ml ，向各管中加入考马斯亮蓝G-250溶液5ml ，充分摇匀，放置2min 左右，用1cm 的比色皿在595nm 处测定吸光值，从标准曲线上查得样品中蛋白的含量。 五、结果计算

式中：C为标准曲线上查得样品中蛋白的含量，μg；V T为提取液的总体积，ml；W F为样品的鲜重，g；V S为样品测定体积，ml。

样品1 样品2 样品3 OD值0.754 0.761 0.717 0.723 0.682 0.632

0.7575 0.720 0.657 OD值平

均值

蛋

37.6985 35.8322 32.6969 白含量

（μg）

由下面标曲图可知，标准曲线的回归方程是直线方程：y=49.767x。

标准曲线图

y = 49.767x R 2 = 0.9942

01020304050600

0.5

1

1.5

系列1

线性 (系列1)

实验三 过氧化物酶的活性测定

一、实验目的

掌握愈创木酚法测定过氧化物酶活性原理与方法。 二、实验原理

在过氧化物酶的催化下，H 2O 2将愈创木酚氧化成茶褐色产物。此产物在470nm 处有最大吸收值，故可通过测定470nm 处的吸光值的变化可以测定过氧化物酶的活性。 三、实验材料、试剂和仪器设备 （一）材料

菠菜叶片（或苜蓿种子） （二）仪器设备

722型分光光度计烧杯量筒移液管试管研钵离心机

（三）试剂

1．pH5.5 0，05M PBS；

2．0.05M愈创木酚溶液100 ml；

3．2% H2O2；

4．20%的三氯乙酸。

四、实验步骤

1．样品液：以实验一的3、5、6步（稀释10倍后）中低温保存的酶样液进行测定.

2．过氧化物酶活性测定

按以下表格依次加入各试剂。

表测活体系中各试剂加入量

管号样

1

样2

样

3

对照

pH5.5 0.05M PBS

（ml）

2.9 2.9 2.9 2.9 0.05M愈创木酚溶

液（ml）

1.0 1.0 1.0 1.0 2% H2O2（ml） 1.0 1.0 1.0 1.0

酶样液（ml）0.1 0.1 0.1 0.1(灭活酶液)

37℃保温15min, 迅速冰浴20%三氯乙酸（ml）2 2 2 2

然后离心5000g10min,取清液，适当稀释后，470nm处测吸光值。

五、结果计算

以每分钟内A470变化0.01为1个过氧化物酶活性单位(u)。

式中：ΔA470为反应时间内吸光值的变化；W为所称样品重，g；t为反应时间，min；V T 为提取酶液总体积，ml；V S为测定时取用酶液体积，ml。

对照组的OD值为0.0000。

样1 样2 样3

测得的OD值0.1525 0.1446 0.1380

酶活性（U/g）0.38 0.34 0.24

[U