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原核表达操作步骤及注意事项
原核表达操作步骤及注意事项时间：2010-03-03 14:05:01 来源：作者：点击：1046次将克隆化基因插入合适载体后导入大肠杆菌用于表达大量蛋白质的方法一般称为原核表达。
这种方法在蛋白纯化、定位及功能分析等方面都有应用。
大肠杆菌用于表达重组蛋白有以下特点：易于生长和控制；用于细菌培养的材料不及哺乳动物细胞系统的材料昂贵；有各种各样的大肠杆菌菌株及与之匹配的具各种特性的质粒可供选择。
但是，在大肠杆菌中表达的蛋白由于缺少修饰和糖基化、磷酸化等翻译后加工，常形成包涵体而影响表达蛋白的生物学活性及构象。
表达载体在基因工程中具有十分重要的作用，原核表达载体通常为质粒，典型的表达载体应具有以下几种元件：（1）选择标志的编码序列；（2）可控转录的启动子；（3）转录调控序列(转录终止子，核糖体结合位点)；（4）一个多限制酶切位点接头；（5）宿主体内自主复制的序列。
原核表达一般程序如下：获得目的基因－准备表达载体－将目的基因插入表达载体中（测序验证）－转化表达宿主菌－诱导靶蛋白的表达－表达蛋白的分析－扩增、纯化、进一步检测一、试剂准备1、LB培养基。
2、100mM IPTG（异丙基硫代-β-D-半乳糖苷）：2.38g IPTG溶于100ml ddH2O中，0.22μm滤膜抽滤，-20℃保存。
二、操作步骤（一）获得目的基因1、通过PCR方法：以含目的基因的克隆质粒为模板，按基因序列设计一对引物（在上游和下游引物分别引入不同的酶切位点），PCR循环获得所需基因片段。
2、通过RT-PCR方法：用TRIzol法从细胞或组织中提取总RNA，以mRNA为模板，逆转录形成cDNA 第一链，以逆转录产物为模板进行PCR循环获得产物。
（二）构建重组表达载体1、载体酶切：将表达质粒用限制性内切酶（同引物的酶切位点）进行双酶切，酶切产物行琼脂糖电泳后，用胶回收Kit或冻融法回收载体大片段。
2、PCR产物双酶切后回收，在T4DNA连接酶作用下连接入载体。
原核表达系统pET28a(+)中抗CD20微抗体的构建和表达
原核表达系统pET28a(+)中抗CD20微抗体的构建和表达李东霞;杨振;潘少坤;周楠楠;宋菲;曹祥荣【摘要】Objective The research aimed to construct anti-CD20 minibody containing VL,VH and CH3,and to explore the best inducing condition of its soluble protein expression.Method The recombinant minibody cDNA was produced by overlap PCR.A short peptide linker was used to join VL and VH.The human IgGl hinge region was used to join VH and CH3.The recombinant minibody gene was subcloned into the expression vector of pET28a and expressed in E.coli BL21.Result SDS-PAGE and Western blot analysis showed that the recombinant protein was about 41.88 kDa and the optimized soluble protein expression condition of minibody was 1.0 mmol/L IPTG for 24 h at 20℃ ,the inclusion bodies were found in the precipitation after sonication.The soluble protein minibody was further purified Ni-NTA affinity chro- matography,the yield up to 90.25% ,the highly purity recombinant protein was obtained after a series of steps including inclusion bodies cell lysis,denaturation,purfication and renaturation.Western blot proved that the recombinant protein anti-CD20 minibody had immunologicai reactive ability against rabbit anti-human IgG,and can specific binding CD20 antigen.The successful expressed of minibody in the prokaryotic expression system was helpful for the future study of its biological function and target therapy to the B lymphoid leukemia and B lymphoma.%目的:改造Rituximab,构建包含VL、VH和CH3的抗CD20微抗体minibody,并探索诱导其可溶性表达的最佳方法.方法:首先通过overlap PCR将Rituximab的VL和VH通过Linker连接在一起,成为单链抗体ScFv,再将ScFv和人源IgG1 CH3通过人源IgG1铰链区连成minibody的cDNA.将其克隆至表达载体pET28a(+)中,并在大肠杆菌中用IPTG诱导表达.结果:SDS-PAGE和Western blot结果表明,抗CD20的微抗体基因表达产物分子量约41.88 kDa,在20℃、1.0 mmol/L IPTG诱导24 h时minibody的可溶性表达量最大,同时还有包涵体形式的蛋白.可溶性抗体蛋白通过镍柱纯化,纯度达到90.25％,包涵体经过变、复性获得了高纯度的抗体蛋白.重组蛋白minibody可特异性地被兔抗人IgGl单克隆抗体识别,并且可特异性结合靶抗原CD20.结论:抗CD20微抗体minibody基因在此原核表达系统中成功表达,为其生物学功能和更好地针对B淋巴系统恶性肿瘤的靶向治疗奠定了基础.【期刊名称】《南京师大学报（自然科学版）》【年(卷),期】2012(035)003【总页数】7页(P74-80)【关键词】CD20;minibody;原核表达;大肠杆菌【作者】李东霞;杨振;潘少坤;周楠楠;宋菲;曹祥荣【作者单位】南京师范大学生命科学学院,江苏省分子医学生物技术重点实验室,江苏南京210046;南京师范大学生命科学学院,江苏省分子医学生物技术重点实验室,江苏南京210046;南京师范大学生命科学学院,江苏省分子医学生物技术重点实验室,江苏南京210046;南京师范大学生命科学学院,江苏省分子医学生物技术重点实验室,江苏南京210046;南京师范大学生命科学学院,江苏省分子医学生物技术重点实验室,江苏南京210046;南京师范大学生命科学学院,江苏省分子医学生物技术重点实验室,江苏南京210046【正文语种】中文【中图分类】R394.4非霍奇金淋巴瘤(Non-hodgkin’s lym phoma，NHL)绝大多数来源于B细胞，是最常见的血液系统恶性肿瘤，也是威胁人类生命的十大恶性肿瘤之一.NHL还是我国目前发病率增长速度最快的血液系统恶性肿瘤［1］，每年约有3～4万人死于该病痪.NHL患者中，约85%～90%是B细胞淋巴瘤［2］.CD20是一种B细胞及B淋巴瘤细胞上广泛表达的抗原，它的作用尚未完全阐明，可能在B细胞生长、激活及钙通道形成和调节［3-4］中发挥某种功能，干细胞及髓系细胞表面无此抗原表达，故使用抗CD20抗体后不会出现明显的造血抑制现象［5］.因此研制抗CD20的单克隆抗体就可能专一性地杀伤B淋巴瘤细胞，达到更好的治疗效果. Rituximab(C2B8)是美国基因科技公司研发的，它是以人CD20分子为靶点的人、鼠嵌合型IgG1免疫球蛋白，通过转染相关基因到中国仓鼠卵巢细胞(CHO)后表达得到的产物［6］.1997年，它被FDA批准用于治疗复发低度恶性或滤泡型淋巴瘤，也是第一个用于肿瘤治疗的抗体.由于其在非霍奇金淋巴瘤及一些自身免疫疾病的治疗中表现出较好的疗效和较低的毒副作用，C2B8已经成为美国销售额最大的抗肿瘤药物.然而，药物来源和治疗费用问题给患者带来了严重的负担，因此限制了其推广应用，针对此情况有必要探索新的抗体表达系统，并对抗体做适当的改造.Minibody是一个比较新的抗体改造形式，即抗体IgG轻链可变区(VL)、重链可变区(VH)和重链保守区(CH3)通过连接肽(Linker)和重链铰链区连接起来的单链抗体(VL-VH-CH3)，其具有中等分子量、且保留了抗体Fc受体，既能够有效地与抗原结合、介导ADCC，在体内的半衰期又相对于ScFv较长［7］，为此我们用基因工程的方法将Rituximab改造成抗CD20的minibody，并成功地在大肠杆菌中进行了构建和表达，这为更好地针对B淋巴系统恶性肿瘤的靶向治疗奠定了基础.大肠杆菌DH5α、质粒pUC19、携带抗CD20抗体重链和轻链cDNA片段的质粒pDC316-ATF均为本实验室保存;大肠菌BL21、质粒pET28a(+)由张双全老师馈赠;限制性内切酶、T4 DNA连接酶、Pyrobest DNA Polymerase、DNA marker、Taq酶为TaKaRa公司产品;割胶纯化试剂盒及质粒提取试剂盒购自BioMIGA;His 纯化柱为GE Healthcare产物;兔抗人IgG1单克隆抗体购自博士德公司;氨苄青霉素、卡那霉素购自南京生兴生物科技公司;引物由上海生工合成.1.2.1 微抗体(minibody)cDNA的合成根据轻、重链可变区基因的酶切图谱及表达载体pET28a的酶切位点，设计并合成了用于VL、VH和CH3基因拼接的引物(表1 ).提取重组质粒pDC316-ATF，用SalⅠ+EcoRⅠ双酶切消化，得到717 bp和5028 bp 2个片段，以717 bp片段为模板、AT001/AT004为引物对，高保真酶扩增抗CD20抗体轻链可变区cDNA，即VL;以5 028 bp大片段为模板，分别以AT002/AT005、AT003/AT006为引物对，扩增出抗CD20抗体重链可变区cDNA和抗CD20抗体重链恒定区cDNA，即VH和CH3;分别纯化VL、VH和CH3 3个片段.以VL和VH为模板、AT001/AT005为引物对，高保真酶扩增ScFv片段，回收ScFv片段;以ScFv片段和CH3片段为模板、AT010/AT011为引物对，用高保真酶扩增出1 147 bp特异性条带，即为Rituximab改造的minibody的cDNA(也即CDMN).1.2.2 表达载体的构建用XbaⅠ+HindⅢ分别对纯化的PCR产物(CDMN)和测序质粒pUC19进行双酶切，割胶回收酶切产物，在T4 DNA连接酶作用下连接，连接产物转入大肠杆菌DH5α感受态细胞中，在LB(Amp+)培养基中筛选培养，利用菌液电泳和PCR的方法鉴定，将重组阳性质粒送上海生工测序，并命名为pUC19-CDMN.用NdeⅠ和HindⅢ分别对表达载体pET28a(+)和携带抗CD20微抗体的测序质粒pUC19-CDMN进行双酶切，割胶回收酶切产物，在T4 DNA连接酶作用下连接.经Kan+抗性筛选，提取质粒，酶切鉴定，确定其为阳性重组质粒，命名为pET28a(+)-CDMN.1.2.3 重组基因的诱导表达及SDS-PAGE分析将重组质粒pET28a(+)-CDMN转入感受态细胞BL21中，涂在Kan+平板上，37℃过夜培养，挑取单克隆揺菌，按1%接菌，培养至OD=0.6～1.0，加入IPTG诱导.分别进行3组条件实验，先确定2个条件不变，探索重组蛋白的最优表达条件.设置IPTG浓度梯度为:0 mmol/L、0.5 mmol/L、1.0 mmol/L、1.5 mmol/L，时间梯度为12 h、24 h、36 h，温度梯度分别为:16℃、20℃、25℃，分别收集菌体，超声破碎，离心，上清和沉淀分别煮样，进行SDS-PAGE电泳.选取最适的温度、最佳时间点和IPTG浓度条件进行大量表达.1.2.4 蛋白的纯化和变复性将表达的200mL菌体重悬于20 mmol/L Tris-cl(pH=8.0)、174μg/mL PMSF中，超声破碎，13 000 rpm、4℃、6min离心，制备上清和沉淀，上清用镍柱进行纯化(步骤按说明书)，纯化后的蛋白于-20℃备用;沉淀用PBS进行重悬，超声破碎，6 000 rpm、20℃、20min离心，弃去上清，用10mL、2mol/L尿素重悬沉淀，同时加15μL TritonX-100，重悬8 min～10min，6 000 rpm、4℃、20min，如此重复5次，然后分别用4 mol/L、6mol/L尿素重悬沉淀，离心、弃上清，再用8mol/L尿素重悬沉淀，同时加15μL TritonX-100和DTT(二硫苏糖醇、1mmol/L)于4℃、30 h;6 000 rpm、4℃、20min离心，取上清，再加等体积的8 mmol/L尿素于透析袋中，将透析袋放入复性液I中复性，4℃透析复性30 h;6 000 rpm、4℃、20min离心，取上清，将透析袋放入复性液II中复性，4℃透析复性30 h;6 000 rpm、4℃、20min离心，取上清，将透析袋放入复性液III中复性，4℃透析复性3.5 h;6 000 rpm、4℃、20min离心，取上清，将透析袋放入复性液IV中复性，4℃透析复性过夜;6 000 rpm、4℃、20min离心，取上清，将透析袋放入复性液V中复性，4℃透析复性3 h，将透析袋中的液体进行浓缩，浓缩后取少量，测定蛋白的浓度，分装于合适的管中，置于-20℃中保存备用.1.2.5 Western blotting鉴定重组蛋白minibody的抗原性将纯化和变复性的蛋白样品于99℃煮5min，使蛋白变性，经SDS-PAGE电泳后，电转膜220 V、90min转移至PVDF膜上，封闭液封闭1 h，TBST洗涤3次，每次10min.与兔抗人IgG1单克隆抗体共同孵育2 h，TBST洗涤3次，每次10min，加入显色液TMB避光显色，观察并拍照.酶切质粒pDC316-ATF，获得大小分别为717 bp、5 028 bp的cDNA片段，以717 bp片段为模板、AT001/AT004为引物对，用高保真酶扩增出抗体的轻链cDNA片段，即VL;以5 028 bp片段为模板，分别以AT002/AT005、AT003/AT006为引物对扩增出抗体的重链可变区和恒定区的cDNA片段，即VH、CH3，纯化VL、VH、CH3 3个片段(如图1)，然后以VL、VH为模板、AT001/AT005为引物对，高保真酶扩增ScFv片段，回收此片段;再以ScFv片段、CH3为模板，以AT010/AT011为引物对，用高保真酶扩增出1 147 bp特异性条带，为Rituximab的cDNA(CDMN)，即minibody(如图2).纯化CDMN PCR产物和测序载体pUC19，进行双酶切，T4连接酶进行连接，经菌液电泳初筛，确定9#和13#为阳性克隆(如图4)，提取9#和13#重组质粒进行酶切鉴定，在1 128 bp处均有1个释放条带，可以确定为阳性质粒(如图5).将9#重组质粒送上海生工测序，并命名为pUC19-CDMN 9#，将pUC19-CDMN9#和表达载体pET28a(+)分别进行双酶切消化，割胶回收产物，用T4连接酶连接，经Kan+抗性筛选，提取质粒，酶切鉴定，确定其为阳性重组质粒，命名为pET28a(+)-CDMN(如图6、7).重组质粒pET28a(+)-CDMN在IPTG诱导后在42 kDa处有一重组蛋白条带.在不同浓度的IPTG诱导下发现，1.0 mmol/L时可溶性蛋白的表达量是较大的，然后分别在1.0mmol/L条件下探索最适的温度和时间点.通过设置不同的温度梯度、时间梯度、IPTG浓度梯度，发现在温度为20℃、IPTG浓度为1.0mmol/L、时间为24h时可溶性蛋白的表达量最高，同时还有包涵体蛋白的表达(如图8、9).在温度为20℃、IPTG浓度为1.0 mmol/L的条件下进行大量诱导，24 h收集200mL菌体，超声破碎，制备上清和沉淀，分别进行镍柱纯化和蛋白的变复性，SDSPAGE电泳.将上清中的可溶性蛋白进行镍柱纯化，取出200μL纯化后的蛋白、煮样，进行SDS-PAGE电泳.用软件分析蛋白胶测得6#、7#蛋白最终纯度分别为90.25%、63.33%(如图10);沉淀中的包涵体形式蛋白进行变复性，复性后取出200μL煮样、进行SDS-PAGE，条带非常的单一，最终纯度达到96%(如图11).将纯化的重组蛋白进行SDS-PAGE电泳，电转移至PVDF膜上，与辣根过氧化物酶标记的兔抗人IgG1单克隆抗体共同孵育，TMB避光显色，进行蛋白印记分析，结果显示在42 kDa处有一明显的蛋白条带，从而证明minibody重组蛋白在大肠杆菌中成功表达，同时也说明minibody重组蛋白具有抗原性.收集Jurkat、NAMALWA细胞蛋白样品，进行SDS-PAGE电泳，电转移至PVDF膜上，将纯化的抗体做为一抗，辣根过氧化物酶标记的兔抗人IgG1单克隆抗体为二抗，结果显示在35 kDa左右有一条明显的条带，阴性对照无条带，表明我们纯化的抗体有抗体的活性，且可与靶抗原特异性结合.随着分子生物学、免疫学等基础研究和试验技术的不断提高，新型抗CD20单克隆抗体的出现将成为今后治疗NHL最有效的药物［8］.应用基因工程抗体进行肿瘤免疫治疗是当前的研究热点之一，生物工程类抗体美罗华的临床应用为肿瘤的生物免疫治疗开创了新的局面，研究表明联合应用美罗华及化疗对于提高B-ALL和B细胞淋巴瘤(B-NHL)患者的临床预后效果明显［9］.对NHL单药治疗或联合化疗目前在世界范围被认为是最成功的生物治疗方式之一.然而由于药物来源和治疗费用问题，给患者带来严重的负担，因而也会限制其推广应用，针对此情况有必要探索新的抗体表达系统，并对抗体做适当的改造.原核表达系统早已成为成熟的表达系统，其操作简单、成本低廉，在抗体片段的表达中已经得到了广泛的使用［10］.然而原核表达系统也存在一些缺陷，大肠杆菌不能对外源蛋白进行糖基化修饰，同时表达的蛋白也多以包涵体的形式存在.本实验在Rituximab的基础上改造构建了minibody微抗体，它是包括鼠源的VL、VH，人的CH3及Linker和人源IgG1铰链区(如图3)，它比单链抗体多了CH3，因而minibody能介导ADCC(抗体依赖的细胞介导的细胞毒作用).Linker序列是由重复的4个甘氨酸和1个丝氨酸构成的15个氨基酸序列的短肽，其中甘氨酸是分子量最小、侧链最短的氨基酸，可增加侧链的柔性;丝氨酸是亲水性最强的氨基酸，可增加其亲水性［9］;铰链区包括H链间二硫键，该区富含脯氨酸、不形成a-螺旋、易发生伸展及一定程度的转动，当VL、VH与抗原结合时此处发生扭曲，使抗体上的抗原结合位点更好地与抗原决定簇互补，由于CH3构型发生变化，活化补体结合组织细胞，介导ADCC.本研究采用了(GlySer4)3作为弹性连接短肽，包涵体经复性及透析后所得的minibody微抗体表现出良好的稳定性.本文采用了pET28a表达载体进行诱导表达，其多克隆位点的上游有一个能编码6×His-Tag序列，可与下游的表达序列形成融合蛋白，它通常不影响表达产物的生物学活性，因此不必通过酶水解来获得目的蛋白.同时该序列可作为蛋白标签用于目的蛋白的纯化和检测［9］.由于蛋白的变复性较麻烦，且变复性后蛋白的活性有可能受到影响，所以我们设置温度梯度、时间梯度和IPTG浓度梯度摸索表达可溶性蛋白的最适条件.通过研究发现，在温度为20℃、IPTG为1.0mmol/L、时间为24 h时minibody的可溶性蛋白表达量最大，同时也有包涵体形式的蛋白.上清中的可溶性蛋白足以做蛋白纯化，经过镍柱纯化后获得高纯度的minibody微抗体，纯化后蛋白浓度为643μg/mL.包涵体蛋白进行变复性处理后蛋白浓度为150μg/mL，相比上清中的可溶性蛋白浓度要小，所以诱导蛋白可溶性表达是一个可行的办法.Western blot结果进一步表明，重组蛋白在大肠杆菌中被成功诱导可溶性表达，并且纯化的重组蛋白具有抗体的活性，能与靶抗原特异性结合，而变复性的重组蛋白没有抗体活性.综上所述，我们成功构建和诱导可溶性表达了抗CD20微抗体minibody，为下一步进行minibody生物学功能的研究提供了前提，进而为B淋巴瘤和自身免疫疾病的免疫诊断、治疗奠定了基础.【相关文献】［1］Jemal A，Siegel R，Ward E，et al.Cancer statistics［J］.CA Cancer JClin，2008，58(2):71-96.［2］师明磊，胡显文，陈惠鹏，等.抗CD20嵌合抗体的表达与活性鉴定［J］.中国生物工程杂志，2005，25(7):34-39.［3］Riley JK，Sliwkowski M X.CD20:a gene in search of a function［J］.Semin Oncol，2000，27(6 Suppl 12):17-24.［4］Du J，Wang H，Zhong C，etal.Structuralbasis for recognition of CD20 by therapeutic antibody Rituximab［J］.JBiol Chem，2007，282(20):15 073-15 080.［5］赵江宁，朱雅丽.抗CD20单克隆抗体-Rituximab［J］.白血病.淋巴瘤，2004，13(2):123-125.［6］John R G，Steven SH，Jeffrey TR，et al.An afucosylated anti-CD20 monoclonal antibody with greater antibody-dependent cellular cytotoxicity and B-cell depletion and lower complement-dependent 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pET系统表达常见问题
pET系统是目前应用最为广泛的原核表达系统，已经成功地在大肠杆菌中表达了各种各样的异源蛋白。
经过与使用过和正在使用这个系统的科学家的交流，我们发现了一些在使用pET 系统的过程中以及原核表达中的一些常见问题。
在此，我们选取了其中一些比较有代表性的问题，附上我们的建议改进方案，并期待和你一起分享成功的喜悦。
1.目的蛋白总是以不可溶的形式出现真是令人烦恼在大肠杆菌中表达的异源蛋白经常发生错误的折叠，并聚集成为包涵体。
经过诱导，目的蛋白通常可达细胞总蛋白的50%以上。
虽然有一定比例的蛋白以可溶的单体形式存在，而多达95%（甚至更多）的蛋白则在包涵体中。
实践中，有很多实验室采取降低诱导温度，例如25–30°C(Burtonetal.(1991)Prot.Exp.Purif.2,432-441)，或降低IPTG浓度(0.01–0.1mM)并延长诱导时间，还有采用特别的培养基(BlackwellandHorgan(1991)FEBSLett.295,10-12)等方法获得更多的可溶蛋白。
随着越来越多的蛋白折叠途径被阐明，相信会出现更多有效的增加可溶性目的蛋白的实验方法。
然而，让目的蛋白以包涵体形式聚集也并非总是坏事。
不溶态在某些情况下非常有利：a.形成包涵体是目的蛋白表达量很高的表现。
b.作为初步分离，将目的蛋白的包涵体纯化出来非常简便。
用核酸酶处理，并经简单洗涤，通常可以获得纯度达75–95%的目的蛋白。
c.存在于包涵体中的目的蛋白通常可以免于蛋白酶的水解破坏作用。
纯化的包涵体可以用多种方法重新溶解，以便进一步进行纯化和重折叠操作。
如果目的蛋白是用于制备抗原，经PBS悬浮和适当的佐剂乳化处理后，就可以直接用于注射了(参见Fischeretal1992)Science257,1392-1395)。
如果目的蛋白融合了His-Tag(r)序列，则可以在变性条件下用His?Bind(r)树脂亲和纯化。
经纯化的蛋白用变性条件从树脂洗脱，再行重折叠。
PET系统_原核表达详细总结
04
应用前景展望
在生物制品领域的应用前景
1 2
疫苗生产
利用PET系统进行原核表达，可实现疫苗抗原的 高效制备，降低生产成本和时间。
抗体药物生产
通过PET系统表达抗体，能够简化抗体药物的生 产流程，提高生产效率和产品质量。
3
生物制品质量控制
PET系统可用于生物制品质量控制，如蛋白质结 构鉴定、功能检测和残留物质检测等。
疾病机制研究
PET技术可用于研究疾病的发 生机制、发展过程和治疗方法 ，有助于深入了解疾病的本质
。
医学影像诊断
PET技术能够提供高灵敏度和特异 性的医学影像，有助于肿瘤、神 经系统疾病等疾病的早期诊断。
生物医学材料研究
通过PET技术对生物医学材料进行 标记和检测，能够提高材料的安全 性和有效性。
05
培养基
提供实验菌种生长和繁殖所需的营 养成分。
试剂和仪器
包括各种分子生物学试剂和细胞培 养设备，用于实验操作。
实验方法
活性检测
通过生物学活性检测，评估目的蛋白的功 能和效果。
目的基因克隆
将目的基因从染色体或质粒上克隆到表达 载体中。
表达载体转化
将克隆好的表达载体转化到实验菌种中。
蛋白纯化
采用各种纯化技术，将目的蛋白从细胞中 分离出来。
诱导表达
通过添加诱导剂或其他方法，启动目的基 因的表达。
02
实验结果
pet系统表达的蛋白质量分析
总结词
在利用PET系统进行原核表达的过程中，需要关注蛋白的质量和产量。
详细描述
通过SDS-PAGE和Western Blot分析，可以检测到目标蛋白的分子量标准，同时利用定量蛋白试剂盒可以测定 其浓度。
pET32a-XBP1u蛋白的原核表达、纯化及多克隆抗体的制备的开题报告
pET32a-XBP1u蛋白的原核表达、纯化及多克隆抗体的制备的开题报告一、研究背景XBP1（X-box binding protein 1）是一种在细胞内负责调节内质网（ER）应激反应的转录因子，在内质网应激（ER stress）发生时能够通过非常规剪切的方式产生活性的转录因子形式（XBP1u），并进一步调节众多靶基因的表达，以保证机体能够有效地适应外界环境的变化。
由于XBP1在疾病发生发展过程中起着重要的作用，因此对其进行深入的研究具有重要的意义。
而构建pET32a-XBP1u质粒系统并进行原核表达、纯化以及多克隆抗体制备是进行深入研究的前提和基础。
因此，本研究计划对pET32a-XBP1u蛋白的原核表达、纯化及多克隆抗体的制备进行探究。
二、研究目的1. 利用pET32a-XBP1u质粒系统成功进行XBP1u的原核表达，并进行相关酶学检测和分析；2. 通过一系列的纯化步骤，获得高纯度的XBP1u蛋白；3. 制备高效、高特异性的XBP1u多克隆抗体，并进一步验证其特异性和识别能力。
三、研究内容及方法1. 构建pET32a-XBP1u质粒系统：对XBP1u编码区域的序列进行合成、克隆和验证，构建成pET32a-XBP1u质粒系统。
2. 原核表达和酶学活性检测：将pET32a-XBP1u质粒转化到大肠杆菌BL21（DE3）中，利用IPTG诱导蛋白表达，通过SDS-PAGE和Western blot检测蛋白表达情况，并通过酶学检测法分析蛋白的酶活性。
3. 蛋白的纯化：通过多步纯化，如亲和层析、离子交换层析、凝胶过滤层析等，获得高纯度的XBP1u蛋白。
4. 抗体制备：利用高纯度的XBP1u蛋白免疫小鼠，产生多克隆抗体。
通过酶联免疫吸附实验（ELISA）和Western blot验证抗体特异性和识别能力。
四、研究意义1. 通过pET32a-XBP1u的构建和蛋白的表达，为深入研究XBP1u的分子机制提供了基础；2. 通过纯化获得高纯度的XBP1u蛋白，为后续的酶学研究、体外结合实验和晶体结构分析提供了可靠的物质基础；3. 成功制备出高效、高特异性的XBP1u多克隆抗体，为进一步研究XBP1u在疾病发生发展过程中的作用提供了可靠的试剂基础。
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Novagen的母公司是德国默克（Merck）公司，它是国际著名的化学及制药公司总部位于德国的Darm stadt，已有300多年的历史。
已在全世界55个主要国家设立了分公司，其中在28个国家建有62个生产基地。
Novagen公司出品的系列载体是目前应用最为广泛的原核表达系统，已经成功地在大肠杆菌中表达了各种各样的异源蛋白。
系列载体是利用大肠杆菌T7噬菌体转录系统进行表达的载体，其表达原理见下图。
T7噬菌体具有一套专一性非常强的转录体系，利用这一体系中的元件为基础构建的表达系统称为T7表达系统。
T7噬菌体基因编码的T7RNA聚合酶选择性的激活T7噬菌体启动子的转录。
它是一种高活性的RNA聚合酶，其合成m RNA的速度比大肠杆菌RNA聚合酶快5倍左右。
并可以转录某些不能被大肠杆菌RNA聚合酶有效转录的序列。
在细胞中存在T7 RNA聚合酶和T7噬菌体启动子的情形下，大肠杆菌宿主本身基因的转录竞争不过T7噬菌体转录体系，最终受T7噬菌体启动子控制的基因的转录能达到很高的水平。
T7噬菌体启动子的转录完全依赖于T7 RNA聚合酶，因此T7 RNA聚合酶的转录调控模式就决定了表达系统的调控方式。
噬菌体DE3是λ噬菌体的衍生株，一段含有lacⅠ，lacUV5启动子和T7 RNA聚合酶基因的 DNA片段倍插入其int基因中，用噬菌体DE3的溶源菌，如BL21(DE3)、 HMS174(DE3)等作为表达载体的宿主菌，调控方式为化学信号诱导型，类似于Lac表达系统。
原核表达宝典
默克中国
操作手册 TB055 第 10 版
3
免费技术咨询热线 800-820-8872
上海代表处 021-62483388
北京代表处 010-85802406
广州代表处 020-83634531
Novagen 网站 bioteam@
单独提供的组分和相关产品： 参见 Novagen目录或 Novagen 网站()pET 载体系 统和感受态细胞完全列表。
D. 选择合适的 pET 载 体
p ET 载体最初由 Studier 及其同事构建(Studier and Moffatt, 1986; Rosenberg et al., 1987; Studier et al.,
54
XI. 附录：基因蛋白功能研究产品
基因突变产品大全
蛋白质相互作用双杂交系统
T7 噬菌体展示系统 基因沉默研究产品
• 关于 pET 系统的所有产品的专利、商标信息请参考 Novagen 原版目录。 • Novagen 是德国 Merck KgaA 集团子公司 EMD 公司的品牌之一。 • 所有 Novagen 出售的产品仅供科研之用。
43
BugBuster®试剂处理后的包涵体纯化
43
机械性裂解细胞的包涵体纯化
43
G. 用 PopCulture™ 试剂制备抽提物
44
2
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内容提要
内容提要
1
I. 系统介绍
4
IPTG 诱导表达
实验步骤
融合蛋白的表达
（பைடு நூலகம்）重组表达质粒转化DH5α 感受态细胞。
（2）分别挑取单菌落接种于5 ml LB ( 0.1 g·L-1 氨苄 青
霉素)中，37℃培养过夜。
（3）以2 %体积比转接于200 ml LB( 0.1 g·L-1 氨苄青 霉
素)中，37℃继续培养2.5 hr，至细菌对数生长期 ，
IPTG 诱导表达
原核表达系统
将外源基因引入原核细胞， 并使其在原核细胞中高效地表 达、合成基因产物的体系。
原核生物基因表达特点
原核生物中功能相关的基因串联在一 起，形成操纵子。
操纵子（operon）是一组功能上相关， 受同一调控区控制的基因组成的一个 遗传单位
原核基因的表达调控
原核生物绝大多数基因按功能相关性成簇地 串联、密集于染色体上，共同组成一个转录单位 ──操纵子（元），如乳糖（lac）操纵子、阿拉 伯糖（ara）操纵子及色氨酸（trp）操纵子（元） 等。操纵子（元）机制在原核基因调控中具有较 普遍的意义。
受λ 噬菌体CI基因负调控。温 度诱导。
原核表达载体
适用于在原核细胞中表达外源基因的载体。 pET系列质粒及PGEX-4T。
•主要元件：强启动子 SD顺序 筛选标志 其它调控基因
IPTG 诱导PGEX-4T-2重组质粒的表达
原核表达载体PGEX-4T 带有一个“tac”强启动子，载体上 还携带Laclq 基因，编码Lac抑制因子，当无IPTG存在时， Lac抑制因子能抑Ptac转录，保持低水平表达。加入诱导物 IPTG时它可与阻抑物结合，导致阻抑物构象变化，起到去 阻抑作用，起动转录，高效表达。
真正的诱导剂并非乳糖本身。乳糖进入细胞，经b －半乳糖苷酶催化，转变为半乳糖。后者作为一 种诱导剂分子结合阻遏蛋白，使蛋白构象变化， 导致阻遏蛋白与O序列解离、发生转录。
pET原核表达系统简介
优化表达条件： 优化表达条件：
A. 增加蛋白溶解性及折叠
在 E.coli中表达的重组蛋白经常以聚集的形式表达，被称作包涵体 包涵体。 包涵体 即使在形成包涵体时，还是有一部分目的蛋白是溶解的。由于PET 系统的高表达水平，即使有大量的目的蛋白聚集形成包涵体，也会 有相当多的可溶性目的蛋白存在。在通常情况下，降低蛋白合成速 率，如降低诱导培温度及在基本培养基中生长都会使目的蛋白的可 溶性增加。在许多应用中需要目的蛋白以可溶及活性形式存在。
B.稀有密码子 B.稀有密码子
多数氨基酸都有一个以上的密码子，对E.coli密码子应用情况的分析表明一些密码 子很少使用。尤其是Arg密码子AGA,AGG,CGG,CGA,Ile密码子AUA,Leu密码子 CUA,Gly密码子GGA和Pro密码子CCC很少被用到。当异源目的基因的mRNA在E.coli 中过表达时，tRNA的数量直接反映了mRNA的密码子偏倚性。由于一个或多个tRNA的 稀有或缺少可能导致翻译的停止。不充足的tRNA库可能导致翻译延迟、成熟前翻译终 止、翻译移码和氨基酸错配。RosettaTM菌株被用来增加含有稀有Arg密码子AGG和 AGA，Ile密码子AUA，Leu密码子CUA,Pro密码子CCC和Gly密码子GGA目的蛋白的表 达。tRNA由一个与pET载体相容的氯霉素抗性质粒(以pACYC为骨架)带有的自身启动 子所表达。含有pLysS的Rosetta菌株在带有T7溶菌酶相同骨架上带有编码稀有密码子 的基因。Rosetta菌株是lon和ompT蛋白酶缺陷型的一个B-衍生菌。RosettaBlueTM和 Rosetta-gamiTM菌株分别衍生于K-12 NovaBlue菌株和Origami菌株。RosettaBlue还具 有高转化效率，以及由高水平lac阻遏子(lacIq)所带来的严紧性控制。Rosetta-gamiTM 菌株是trxB/gor突变株，通过形成二硫键促进蛋白折叠（二硫键形成及可溶性增强）。 Rosetta菌株相当适合用于表达那些含有E.coli稀有密码子基因的目的蛋白。
默克密理博pET原核表达工具简介
多亚基蛋白表达、目的蛋白-辅因子共表达 变得灵活、简便可控
11
16/05/2014
pET系列载体：满足各种表达要求
Strep•Tag ® II：pET-51,-52；提高纯度，>95% HRV 3C： pET-47,-48,-49,-50；低温切割保护蛋白 NusA： pET-43.1, -44, -50b；提高可溶性 GST： pET-41,-42；提高可溶性，纯化，活性检测 Trx： pET-32；提高可溶性 site-specific 32P-labeling： pET-33；目的蛋白标记 Peptide Expression： pET-31，小肽表达
5
16/05/2014
重要原则：选择合适的载体
• 提高产量和稳定性 • 蛋白定位与分泌 • 可溶性
• 特异性亲和纯化
• 检测**
pET系列
融合标签：
• 不同大小的C-或N-端 标签的不同功能与对 后续操作的影响 • 是否需要或容忍标签 的存在
6
16/05/2014
重要原则：选择合适的载体
pET系列
强势而可控
pET系列
T7Lac启动子 加强严紧控制 以获得更稳定 的表达
4
16/05/2014
重要原则：选择合适的载体
pET系列
终止子：转录水平的
终止，也可考虑翻译 水平的终止
重要原则：选择合适的载体
pET系列
多克隆位点：
• pET系列共同的设计 便于亚克隆
• 决定了载体来源序列 在蛋白产物上的位置 和应用
Submit Query Reset
Type (or cut and paste) your protein sequence below, click on the "Submit" button, and the solubility probability of your protein will be calculated. The statistical model predicts protein solubility assuming the protein is being overexpressed in Escherichia coli. If there are numbers, spaces, or other characters in your sequence, don't worry, they won't affect the calculation. For more information on the solubility model used here, see the references below. References: •R.G. Harrison. 2000. Expression of soluble heterologous proteins via fusion with NusA protein. inNovations. 11:4-7. PDF file •Davis, G.D., Elisee, C., Newham, D.M. and R.G. Harrison. 1999. New fusion protein systems designed to give soluble expression in Escherichia coli. Biotechnol. Bioeng. 65(4):382-8. PubMed Abstract •Wilkinson, D.L. and R.G. Harrison. 1991. Predicting the solubility of recombinant proteins in Escherichia coli. Bio/Technology. 9: 443-448. PubMed Abstract
奶山羊乳铁蛋白的原核表达及其多克隆抗体的制备
奶山羊乳铁蛋白的原核表达及其多克隆抗体的制备钟玉玲;代邦国;杜伟伟;张华文;李纯;史怀平【期刊名称】《家畜生态学报》【年(卷),期】2022(43)2【摘要】为了制备奶山羊乳铁蛋白的多克隆抗体,为进一步的试验提供材料,该研究运用软件分析并选取最适合原核表达的LF序列进行扩增,将扩增出的序列与pET-32a(+)质粒连接,形成原核表达质粒pET-32a-LF,将质粒转化入大肠杆菌,在最适条件(37℃、0.5 mmol/L IPTG、4 h)下诱导表达出大量蛋白。
通过Ni-NTA Resin 法将蛋白纯化后皮下注射4月龄新西兰大耳兔,免疫注射结束后采集抗体血清,并用间接酶联免疫吸附法和免疫印迹法检测多抗的效价及特异性。
结果显示克隆得到适合原核表达的279 bp的LF CDS片段,pET-32a(+)-LF原核表达载体成功构建并顺利表达(未形成包涵体),表达的截短蛋白大小为10 kD。
抗体效价达到1:10^(7);免疫印迹试验结果显示,原核表达的LF蛋白和山羊乳腺上皮细胞中的LF蛋白能够被该抗体特异性识别。
【总页数】7页(P13-19)【作者】钟玉玲;代邦国;杜伟伟;张华文;李纯;史怀平【作者单位】西北农林科技大学动物科技学院【正文语种】中文【中图分类】Q78;S827.2【相关文献】1.奶山羊EGFR蛋白胞外区的原核表达及其多克隆抗体的制备2.人睾丸特异表达基因PIAS-NY原核表达和多克隆抗体的制备3.棉铃虫激活增强子结合蛋白AP-4基因的原核表达、多克隆抗体制备、表达谱分析及功能鉴定4.猪源IKKγ在原核和真核表达系统中的表达及其多克隆抗体制备5.猪源IKKγ在原核和真核表达系统中的表达及其多克隆抗体制备因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
PET系统_原核表达详细总结
PET-MRI能够用于研究肿瘤生长和转移、药物代谢和疗效评估等科研项目，为新药研发和 疾病治疗提供帮助。
药物研发
PET-MRI能够用于监测药物在体内的分布、活化度和代谢过程，有助于药物研发和优化治 疗方案。
pet系统的发展历程
1970年代
PET技术开始发展并应用于临床诊 断。
1990年代
MRI技术开始应用于临床诊断，并 开始出现将PET和MRI技术结合的研 究。
加强质控和安全性
通过建立完善的质控体系和加强产品安全性评估 ，提高产品的质量、安全性和可靠性。
THANKS
2000年代初
第一台PET-CT问世，随后PET-MRI 技术也开始进入临床试验阶段。
2010年代
PET-MRI技术逐渐成熟并开始广泛 应用于临床诊断、科研和药物研发 等领域。
02
原核表达系统概述
原核表达系统的定义
原核表达系统是一种在原核生物中利用基因 工程技术表达特定基因产物的技术平台。
原核表达系统以原核生物的基因组、质粒或 噬菌体为载体，通过基因重组将目的基因插 入表达元件，转化原核细胞并表达目的蛋白
白的生物学活性。 • 安全性：原核表达载体可能含有致病基因，对人类和环境存在潜在危害。 • 蛋白纯化：原核细胞表达的蛋白质可能存在不稳定性，需要纯化以消除杂质影响。
03
pet系统与原核表达系统的关系
pet系统中原核表达系统的应用
01
生产重组蛋白
通过原核表达系统，生产具有生物活性的重组蛋白药物，如胰岛素、
存在毒性
某些原核表达系统生产的重组蛋白可能存在毒性，需进行去除毒性处理。
04
原核表达系统的下游应用
基因鉴定
基因序列验证
pET表达载体
表达载体pETA.pET系统是有史以来在E.coli中克隆表达重组蛋白的功能最强大的系统。
目的基因被克隆到pET质粒载体上，受噬菌体T7强转录及翻译(可选择)信号控制；表达由宿主细胞提供的T7 RNA聚合酶诱导。
T7 RNA 聚合酶机制十分有效并具选择性：充分诱导时，几乎所有的细胞资源都用于表达目的蛋白；诱导表达后仅几个小时，目的蛋白通常可以占到细胞总蛋白的50%以上。
尽管该系统极为强大，却仍能很容易地通过降低诱导物的浓度来削弱蛋白表达。
降低表达水平可能可以提高某些目的蛋白的可溶部分产量。
该系统的另一个重要优点是在非诱导条件下，可以使目的基因完全处于沉默状态而不转录。
用不含T7 RNA聚合酶的宿主菌克隆目的基因，即可避免因目的蛋白对宿主细胞的可能毒性造成的质粒不稳定(详见I. F.部分)。
如果用非表达型宿主细胞克隆，可以通过两种方法启动目的蛋白的表达：用带有受λpL 和pI 启动子控制的T7 RNA聚合酶的λCE6噬菌体侵染宿主细胞，或者将质粒转入带有受lacUV5 控制的T7 RNA聚合酶基因的表达型细胞。
在第二种情形下，可以通过在细菌培养基中加入IPTG 来启动表达。
尽管有时(例如非毒性目的蛋白) 可以直接将目的基因克隆到表达型宿主细胞中，但这种策略并不是通用做法。
两种T7启动子以及多种拥有不同抑制本底表达水平的宿主细胞共同构成了一个极为灵活而有效的系统，使各种目的蛋白得以最优化表达。
所有pET载体以及相关产品均以试剂盒形式提供，用户可以很方便地进行克隆、表达检测以及纯化目的蛋白的所有操作。
pET 表达系统包括质粒和宿主菌。
您可参考系统组成部分，选择符合具体需要的载体/宿主菌最佳组合。
B.使用许可及协议Novagen的T7表达系统，包括细菌、噬菌体和带有T7 RNA 聚合酶基因的质粒，均依照非商业用户应用声明相应条款有条件提供。
详情请垂询。
C. 系统组成pET表达系统提供目的基因克隆和表达所需的核心试剂。
pET表达系统
pET表达系统pET 原核表达pET 载体中，目标基因克隆到T7 噬菌体强转录和翻译信号控制之下，并通过在宿主细胞提供T7 RNA 聚合酶来诱导表达。
Novagen 的pET 系统不断扩大，提供了用于表达的新技术和选择，目前共包括36 种载体类型、15 种不同宿主菌和设计用于有效检测和纯化目标蛋白的许多其它相关产品。
优点·是原核蛋白表达引用最多的系统·在任何大肠杆菌表达系统中，基础表达水平最低·真正的调节表达水平的“变阻器”控制·提供各种不同融合标签和表达系统配置·可溶性蛋白生产、二硫键形成、蛋白外运和多肽生产等专用载体和宿主菌·许多载体以LIC 载体试剂盒提供，用于迅速定向克隆PCR 产物·许多宿主菌株以感受态细胞形式提供，可立即用于转化阳性pFORCE TM 克隆系统具有高效克隆PCR 产物、阳性选择重组体和高水平表达目标蛋白等特点。
pET 系统概述pET 系统是在大肠杆菌中克隆和表达重组蛋白的最强大系统。
根据最初由Studier 等开发的T7 启动子驱动系统，Novagen 的pET 系统已用于表达成千上万种不同蛋白。
控制基础表达水平pET 系统提供6 种载体- 宿主菌组合，能够调节基础表达水平以优化目标基因的表达。
没有单一策略或条件适用于所有目标蛋白，所以进行优化选择是必要的。
宿主菌株质粒在非表达宿主菌中构建完成后，通常转化到一个带有T7 RNA 聚合酶基因的宿主菌（λDE3 溶原菌）中表达目标蛋白。
在λDE3 溶原菌中，T7 RNA 聚合酶基因由lacUV5 启动子控制。
未诱导时便有一定程度转录，因此适合于表达其产物对宿主细胞生长无毒害作用的一些基因。
而宿主菌带有pLysS 和pLyE 时调控会更严紧。
pLys 质粒编码T7 溶菌酶，它是T7 RNA 聚合酶的天然抑制物，因此可降低其在未诱导细胞中转录目标基因的能力。
pET原核表达系统
举例：lac操纵子 • 阻遏（repression）： 阻遏（ ）：在特定环境信号刺激下，相应基因被抑 ）： 制，从而使基因的表达产物减少。这类基因称为可阻遏基因。 可阻遏基因表达产物水平降低的过程称为阻遏 (repression）。 举例：trp操纵子
协调表达（ 协调表达（coordinate expression） ）
诱导和阻遏表达（ 诱导和阻遏表达（ Induction & Repression） ） • 诱导（induction）： 诱导（ ）：在特定的环境信号刺激下，相应基因被激 ）： 活，从而使基因的表达产物增加。这类基因称为可诱导基因。 可诱导基因在特定环境中表达增强的过程，称为诱导 （induction）。
IPTG
P Lac T7 RNA聚合酶
mRNA
﹏﹏﹏﹏﹏﹏
T7 RNA聚合酶 T7启动子 启动子 mRNA
利用IPTG进行 诱导表达，成本 高，不利于大规 模生产。 pET质粒 质粒
目的基因
﹏﹏﹏﹏﹏﹏
目的蛋白
BL21(DE3)
八、pET系统操作流程 系统操作流程
参考文献： 参考文献： • [1]谢磊,孙建波,张世清,黄俊生. 大肠杆菌表达系统及其研究进展 [J]. 华南热带农业大学学报,2004,(2). • [2]孙柏欣,刘长远,陈彦,赵华,赵彤华,李柏宏,. 基因表达系统研究 进展[J]. 现代农业科技,2008,(2). • [3]pET System Manual, 10th edition, Novagen. 2002,(7) • [4]Benjamin Lewin, Gene IX, Chapter 12, The Operon. Jones and Bartlett Publishers. 2008:304-308
pET原核表达
pET 原核表达—问答篇eeflying ：原核表达系统中，哪种载体最好？原核表达没有最好，可以说一般都是在碰，和你要表达蛋白的性质有关，也和你表达后的用途，及因此而选择的表达策略有关。
比如，１。
你是否介意有亲和标签，亲和纯化当然纯化相对容易，但有时亲和标签的存在会影响蛋白的功能，２。
如果用亲和标签，用什么亲和纯化策略，his 或GSH还是染料抑或是IgG-ProteinA亲和，LAB的IMPAC-TWIN,还是别的如转铁蛋白等，亲和层析的策略也有很多，３。
最终产物是否有必要将亲和标签去掉，如用蛋白酶切掉标签，或 IMPAC-TWIN 会自己切掉，用因子X切掉HIS,4。
表达的部位，是可溶性表达还是包涵体表达，是周质表达还是分泌表达还是分泌表达。
５。
是否加入开关诱导、或是加入IPTG诱导噬菌体T7系统。
６。
你表达的蛋白质是否会与细菌内某些蛋白相互作用而致表达失败。
７。
如果不用亲和标签，纯化用什么方法纯化？８。
即使都考虑全了，表达也未必成功，换载体是很常见的是。
９。
载体选好后，表达条件的优化，如培养温度，培养时间，IPTG浓度等，我们一般在这部用正交设计或析因设计决定。
１０。
蛋白纯化条件的优化，用均匀设计或球面设计或正交设计作曲线拟合，通过导数求极值的方法优化蛋白纯化条件。
这些问题是相互关联的，在实践中可得有一段时间去摸索了。
YONG:原核表达系统中，哪种载体最好？载体没有最好，看哪一种最合适你的实验目的。
这几年新发展的载体一般具有下列特点的一个或多个：1）更多的融合标签选择（提供多种亲和纯化方便）2）严紧的表达调控，更低的渗漏表达3）分子伴侣蛋白，促进折叠和可溶性表达此外，具有更好的质粒稳定性并能够纠正遗传密码偏爱的新的蛋白酶缺陷的宿主细胞也是一个很好的工具。
最新的不一定是最好的，pBV220经常可以给出不错的表达，虽然多半是包含体。
YONG:关于表达载体不同的载体的特点不同，主要的差别有启动子类型，质粒拷贝数等，基因本身的因素基因5’非编码区的二极结构，密码子的偏爱性等，宿主菌的特点也很重要（BL21是蛋白酶缺陷的菌株），融合表达策略也有利于顺利表达外源蛋白。
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Novagen的母公司是德国默克（Merck）公司，它是国际著名的化学及制药公司总部位于德国的Darm stadt，已有300多年的历史。
已在全世界55个主要国家设立了分公司，其中在28个国家建有62个生产基地。
Novagen公司出品的系列载体是目前应用最为广泛的原核表达系统，已经成功地在大肠杆菌中表达了各种各样的异源蛋白。
系列载体是利用大肠杆菌T7噬菌体转录系统进行表达的载体，其表达原理见下图。
T7噬菌体具有一套专一性非常强的转录体系，利用这一体系中的元件为基础构建的表达系统称为T7表达系统。
T7噬菌体基因编码的T7RNA聚合酶选择性的激活T7噬菌体启动子的转录。
它是一种高活性的RNA聚合酶，其合成m RNA的速度比大肠杆菌RNA聚合酶快5倍左右。
并可以转录某些不能被大肠杆菌RNA聚合酶有效转录的序列。
在细胞中存在T7 RNA聚合酶和T7噬菌体启动子的情形下，大肠杆菌宿主本身基因的转录竞争不过T7噬菌体转录体系，最终受T7噬菌体启动子控制的基因的转录能达到很高的水平。
T7噬菌体启动子的转录完全依赖于T7 RNA聚合酶，因此T7 RNA聚合酶的转录调控模式就决定了表达系统的调控方式。
噬菌体DE3是λ噬菌体的衍生株，一段含有lacⅠ，lacUV5启动子和T7 RNA聚合酶基因的 DNA片段倍插入其int基因中，用噬菌体DE3的溶源菌，如BL21(DE3)、 HMS174(DE3)等作为表达载体的宿主菌，调控方式为化学信号诱导型，类似于Lac表达系统。
从开始涉及表达的时候可以根据是否要用基因本身的起始密码子进行选择，Novagen公司仅提供三个载体：-21(+)，-24(+)和-23(+)。
如果你打算利用载体的起始密码子，那么就有许多选择。
根据是否要可溶性表达，选择加有不同标记的载体。
一般说来在大肠杆菌中不加标记外源蛋白都会以不溶的包涵体形式表达。
为了让外源蛋白融合表达一般说来有三个策略：1. 与一个高度可溶的多肽联合一起表达，比如：谷胱甘肽S转移酶（glutathione S transferase, GST）、硫氧还蛋白（thioredoxin, Trx）和N利用质A（N utilization substanceA, NusA）。
2. 转入一个酶催化二硫键的形成，如：硫氧还蛋白，DsbA，DsbC。
3. 插入一个定位到周质空间的信号序列。
不同载体提供不同的标记，有的可以同时带有多个标记。
如果你不希望在蛋白的N末端加入任何的多肽，你也可以选择用NdeⅠ直接从起始密码子后插入外源片断，或者在得到表达产物后利用蛋白氨基酸的酶切位点把多余的多肽切除。
在重组技术上，Novagen除了传统的酶切、连接方式外，还有不需要连接的克隆方式：Ligation-Independent cloning，简称LIC。
采用LIC方法的载体是线性化的，在末端有12-15个突出的碱基以在退火时和目的片断互补。
在设计PCR扩增引物时加入与LIC载体互补的序列，PCR产物用3’→5’的内切酶消化出单链与载体互补的序列。
通过这种方式就可以把目的片断定向、高效地插入LIC载体上。
一般的载体是先在不含DE3片段的菌株中进行克隆筛选，之后再把阳性克隆转化进入表达菌株，如BL21（DE3）中，通过IPTG诱导进行表达。
而coco载体它引入了低拷贝控制元件，F附加体上的oriS和 repE元件与parABC 共同作用下使质粒在细菌中保持单拷贝，这样即可以使质粒在细菌内稳定存在又可以减少外源蛋白对细胞的毒害作用。
当我们需要大量表达时加入树胶醛醣诱导trfA基因表达，质粒在细胞内的拷贝数就可以增加到25-50。
coco载体同时兼容了DE3调控模型，在加入IPTG后诱导表达量达升高2500倍。
在保证质粒稳定性这一点上除了coco的方法还有另一种方法就是将重组质粒转化进入含有T7 RNA聚合酶抑制剂的T7溶菌酶表达基因的菌株中，在含有pLysS的pLysE宿主菌内重组质粒的本底表达被进一步抑制，质粒可以更稳定地存在。
Novagen提供多种表达使用的菌株，为了提高表达量做出了各种改造，它们大致分为以下几个种类：1. 蛋白酶缺陷型所有B菌株的衍生株都是lon蛋白酶和om pT蛋白酶缺陷型的，这包括有B834, BL21, BLR, Origam i™ B, Rosetta™和Tuner™。
因此在纯化时可以保持蛋白的稳定不被降解。
BL21(DE3)是应用最多的表达的表达菌株。
另外它的衍生株BLR(DE3)是recA－，RecA是大肠杆菌中介导同源重组的重要蛋白之一。
它的缺失，可以保证质粒的稳定。
2. 保证所有细胞以同样量进行表达Tuner™株及它的衍生株（Origam i™ B和Rosetta™）是BL21菌株的lacY1缺失突变型，在这些菌株中可以使蛋白以同样水平在所有细胞中表达。
Lac渗透酶的突变使进入每个细胞的IPTG量都是一致的，这样使蛋白表达浓度可以随着IPTG浓度而改变。
通过对 IPTG浓度的控制可以使细胞微量表达或者大量表达。
一般说来，低浓度表达有利于蛋白的可溶性和活性。
3.二硫键形成与溶解性增强二硫键的形成对某些蛋白的可溶性起到重要的作用，而Novagen也专门设计了一些菌株是谷胱甘肽还原酶（gor）和/或硫氧还蛋白还原酶（trxB）缺陷型的，包括AD494，BL21trxB，Origam i，Origam i B和Rosetta-gam i™。
在这些菌株中表达蛋白，可以更大程度促进二硫键的形成，并使蛋白以可溶形式和有活性形式出现的可能增加。
4. 稀有密码子的补给不同物种有不同的密码子偏爱性，如果外源蛋白中含大量大肠杆菌的稀有密码子，特别当这些稀有密码子呈连续分布的时候，就会造成蛋白表达量极低，或者翻译提前终止。
Rosetta™是为了表达真核蛋白而特别设计的，它含有大肠杆菌稀有的密码子tRNA，包括AUA，AGG，AGA，CUA，CCC和GGA。
它们以氯霉素抗性的质粒形式存在。
Rosetta系列是来自BL21lacY1，所以它具有 BL21lacY1的所有特性。
5. 硒蛋氨酸标记 B834是来源于BL21的蛋氨酸（m et）营养缺陷型菌株。
它在高度特异活性35S-m et标记和晶体成像蛋氨酸标记中非常有用。
我们常用的培养基有LB、TB、M9、M9ZB，LB因为其成本低廉所以应用最为广泛，而Novagen有提供特殊的培养基Overnight Express™ Autoinduction System。
使用这种培养基不需要按照传统方法先培养一段时间再加IPTG进行诱导，它可以直接进行过夜培养。
在这种培养基中含有痕量金属，可以满足合成蛋白时对金属的需求。
同时提供除了各种氨基酸，这其中蛋氨酸是另外加入的。
这样培养基可以满足细菌生长的各种需求，使细菌密度更高；可以自动诱导无需自己加IPTG；使蛋白更加容易溶于培养基中；并且如果需要的话，可以对蛋氨酸进行硒标记。
同时Novagen还有表达双外源蛋白的载体pCDFDuet-1 DNA 、Duet™-1 DNA 、pRSFDuet-1 DNA。
这些载体含有两个不同多克隆位点，可以插入两个外源蛋白基因，利用单独的T7 启动子, 乳糖操纵子和核糖体结合位点进行表达。
载体转化进入合适的菌株中最多可以同时表达8个外源蛋白。
红色法拉利2006-06-01 21:57人们合成与生物相关的物质是从尿素开始的，1828年，德国化学家维勒人工合成了存在于生物体的这种有机物。
在1960年我国科学家采用化学方法首次成功地合成了具有生物活性的蛋白质——胰岛素。
随着内切酶的发现和基因工程技术的发展，人们发现用各种不同的载体在原核、真核系统中进行蛋白表达更为行之有效。
而这其中大肠杆菌表达系统发展得最为迅速、成熟。
原核表达具有操作方便、快捷，需时较短，表达量大，适合工业化生产等优点。
虽然也有缺少糖基化和表达后加工等问题，当有了其它多种表达系统后，原核系统仍是我们合成外源蛋白的首选。
在网上看到有人把原核表达技术分成四个等级：初次尝试扫盲、乱棍打枣入门、系统优化中级和自成一体高手，觉得十分有意思。
但是根据笔者自己的经验以及耳闻目睹的一些经历告诉我：做表达？那是谋事在人，成事在天。
有时候你把克隆做出来了，双酶切鉴定没问题，测序没问题，可是就是看不到表达带。
原因当然可以分析，实验也是可以改进，但是窜改一下戈尔泰的话：“成功的实验都是一样的，失败的实验各有各的不幸。
”在实验遇到瓶颈的时候要如何进行分析，找到问题的症结是我们的实验关键所在。
在准备进行原核表达的时候需要考虑的因素很多，市面上可供选择的载体、菌株也很多，要如何进行正确的选择，找到适合自己的载体是十分重要的。
所以，现在要对目前常用的一些载体进行介绍，让我们对其相关产品及其表达原理进行了解，以方便实验设计。
首先来一些大肠杆菌表达的基本概念：一个完整的表达系统通常包括配套的表达载体和表达菌株，如果是特殊的诱导表达还包括诱导剂，如果是融合表达还包括纯化系统或者Tag检测等等。
选择表达系统通常要根据实验目的来考虑，比如表达量高低，目标蛋白的活性，表达产物的纯化方法等等。
主要归结在表达载体的选择上。
表达载体：我们关心的质粒上的元件包括启动子，多克隆位点，终止密码，融合Tag（如果有的话），复制子，筛选标记/报告基因等。
通常，载体很贵，我们可以通过实验室之间交换得到免费的载体。
但是要小心，辗转多个实验室和多个实验室成员之手的载体是否保持原来的遗传背景？MCS是否还是原来那个MCS？是我们要特别注意的。
复制子：通常表达载体都会选用高拷贝的复制子。
pSC101类质粒是严谨方式复制，拷贝数低，pCoE1，pMBI(pUC)类的复制子的拷贝数高达500以上，是表达载体常用的。
通常情况下质粒拷贝数和表达量是非线性的正相关，当然也不是越多越好，超过细胞的承受范围反而会损害细胞的生长。
如果碰巧需要2个质粒共转化，就要考虑复制元是否相容的问题。
筛选标记和报告基因：氨苄青霉素抗性是最常见的筛选标记，卡那霉素或者是新霉素次之，通常是另一个载体的筛选标记用。
四环素，红霉素和氯霉素等已经日渐式微。