第四篇 基因的功能分析

4）分子标记的种类
(1) 限制性片段长度多态性
限制性片段长度多态性(restriction fragment length polymorphism，RFLP)是发展最早的 分子标记技术。
RFLP技术的原理是检测DNA在限制性 内切酶酶切后形成的特定DNA片段的大 小。
4）分子标记的种类
(1) 限制性片段长度多态性
物理图谱的用途：
第二，目前基因的物理图的DNA构成片 段一般为1-200kb（如水稻BAC克隆平 均长度为120kb），有利于直接测序， 从而“拼接”整个基因组的序列，为研 究者在核苷酸不平上解开遗传之谜提供 了可能；
物理图谱的用途：
第三，利用如荧光原位杂交等技术通过 对特定DNA序列特别是编码序列在染色 体上的分布位置的研究，对研究基因组 进化、起源以及结构和功能方面具有重 要的理论意义。
用不同生物杂交测出的遗传距离很可能 是不同的。
2、分子标记技术
1） 分子标记 (molecular marker)的概念
广义的分子标记是指可遗传的并可检测 的DNA序列或蛋白质。蛋白质标记包括 种子贮藏蛋白和同工酶及等位酶。
狭义的分子标记概念只是指DNA标记， 而这个界定现在被广泛采纳。
2、分子标记技术
植物基因的功能分析
一、前言
基因的含义：体现在三个方面
基因是突变单位，突变为进化 提供选择材料。 基因是结构单位，基因结构是 遗传的物质基础。
植物基Байду номын сангаас的功能分析
一、前言
基因的含义：体现在三个方面 基因是功能单位，基因功能的 发挥产生了生物性状。 基因功能的研究是分子生物学 研究的最主要目的之一。
什么是“基因的功能”？ 基因的功能是如何发挥作用？
基因功能研究路线：
正向遗传学 ↓
突变表现型 ↓↑
突变位点 ↓↑
基因克隆 ↑
逆向遗传学
二、遗传图谱与连锁分析
1. 遗传图谱与物理图谱
遗传图谱又称连锁图谱，是指 遗传标记在染色体上的相对位 置或“遗传距离”。
遗传距离用遗传标记在染色体 交换过程中分离的频率来表示， 单位是cM（厘摩）。
二、遗传图谱与连锁分析
物理作图主要有四种类型：
(4) 顺序标签位点（sequence tagged site, STS）作图。
通过PCR或分子杂交将基因组中单一的 小片段DNA顺序定位在基因组的DNA区 段中。是目前最有效的物理作图技术， 能对大基因组作出快速的最详尽图谱的 技术。
物理图谱的用途：
第一，根据遗传学研究提供的信息，可 在物理图谱上把基因定位在一定的范围 内，通过对该范围内DNA片段的确定并 结合图位克隆技术，可达到分离基因的 目的；
1996年水稻遗传图DNA标记已增至2300 个，其中1800个为从愈伤组织、根以及 茎尖中分离的cDNA，标记间平均间距达 到300kb。
1998年，Harushima等发表了包含2275 个分子标记的高密度RFLP连锁图，这是 水稻的第5张遗传图谱。
2001年3月，日本基因组计划在此基础上 又发展了1000个新的RFLP标记，公布了 包含3267个RFLR标记的高密度水稻分子 标记连锁图。
识别序列为8bp，几率是48=65536；
RFLP技术有两个要点：
② 探针的选择
选择探针时既要考虑探针的长度，又要 考虑探针之间的相互位置。
探针越长，得到多态性的可能越大，但 分析难度增加；探针太短很可能检测不 到多态性。
RFLP探针一般选择单拷贝探针。
对于因相同或相近序列的拷贝数变化和 分布不同所引起的多态性，可选择重复 序列探针：
将荧光标记的探针与染色体杂交确定分子标记 的所在位置，作出探针分子的染色体物理图。
ISH能直观地反映基因或DNA序列在染色体上的 分布情况，构成细胞遗传图。这对基因间的真实 连锁关系和染色体结构认识、染色体结构改造、 研究基因结构和功能关系及基因工程育种、检查 遗传图中基因次序与臂区划分的准确性都具有很 重要的意义。
形态学标记（表现型） 细胞学标记（表现型） 生物化学标记（表现型） DNA分子标记（基因型）
二、遗传图谱与连锁分析
1. 遗传图谱与物理图谱 衡量遗传图谱质量的指标：
①标记覆盖的广度，即指标 记覆盖整个基因组的程度。
②标记的密度，即指标记物 之间的平均距离。
1988年McCouch等首张水稻RFLP分子图 谱共有135个标记，覆盖基因组1389cM， 平均图距10cM；
1） 分子标记 (molecular marker)的概念
DNA分子标记是指基因组中任何一段独 特的DNA序列，但由于分子标记主要用 于构建遗传图谱，而遗传图谱的依据是 生物杂交，所以分子标记特指两个亲本 间DNA序列的差异之处，即所谓的多态 性。
2） DNA分子标记的优点 ① 可以在各发育时期的个体、组织、器 官甚至细胞水平作检测，不受环境的影 响，也不受基因表达与否的限制； ② 数量丰富； ③ 遗传稳定；
(7)检测手段简单、快速（如实验程序易 自动化）； (8)开发成本和使用成本尽量低廉；
(9)在实验室内和实验室间重复性好。
但是，目前发现的任何一种分子标记均 不能满足以上所有要求。
4）分子标记的种类
分子标记主要是指多态性，与亲缘关系 有密切的联系。DNA的多态性主要有两 类：
一类是DNA序列中碱基构成发生变化， 以单核苷酸多态性（SNP）最为普遍；
对线粒体和叶绿体DNA进行的这种多态 性差异检测在1980年之前就已出现，从 理论上说，这种多态性也可称为RFLP
RFLP技术有两个要点：
① 限制性内切酶的选择
酶切位点的数量与限制性酶识别的碱基 序列有关： 识别序列为4bp，出现的几率是44=256， 酶切片断的平均长度为300bp左右； 识别序列为6bp，几率是46=4096；
遗传距离与物理距离之间的关系：
遗传距离与物理距离大致呈正相关，但 不能完全等同。
不同生物之间，遗传距离和物理距离的 相对大小是不同的。
人类： 1cM≈1000kb； 拟南芥： 1cM≈25kb； 番茄： 1cM≈510kb； 玉米： 1cM≈2140kb；
遗传距离与物理距离之间的关系：
同一生物中，遗传距离和物理距离的关 系也因标记物在不同性别的个体、同一 个体的不同染色体、同一染色体上的不 同位置而异。
AFLP主要用于DNA指纹分析、基因组 作图。
4）分子标记的种类
(3) 扩增片段长度多态性
基本步骤：DNA用限制性酶酶切，在所 有的酶切片段两端加上带有特定序列的 “接头”，选择与接头互补但3’端有几 个随机选择的核苷酸的片段作引物，进 行特异PCR扩增（只有那些与3’端严格 配对的片段才能得到扩增），再在高分 辨力的测序胶上分开这些扩增产物，用 放射性法、荧光法或银染染色法检测。
④ 对生物的影响表现“中性”；
⑤ 操作简便。
3）理想的分子标记 (1)具有高的多态性； (2)共显性遗传，即利用分子标记可鉴别 二倍体中杂合和纯合基因型； (3)能明确辨别等位基因；
(4)遍布整个基因组；
(5)除特殊位点的标记外，要求分子标记 均匀分布于整个基因组；
3）理想的分子标记 (6)选择中性（即无基因多效性）；
DNA的提取、限制性内切酶酶切DNA、 用凝胶电泳分开DNA片段、把DNA片段 转移到滤膜上、利用放射性标记的探针 显示特定的DNA片段（通过Southern杂 交）、分析结果。
4）分子标记的种类
(1) 限制性片段长度多态性
由于线粒体和叶绿体DNA较小，前三个 步骤就完全可能检测出DNA片段的差异， 所以往往不必要后面的几个步骤；
基因的功能可体现在三个层次：
基因水平的功能： 如转录因子、RNA代谢、信号 转导等。
生物化学水平的功能： 如甲基转移酶、ATP酶、蛋白 质降解等。
基因的功能可体现在三个层次：
生理学与生物学水平的功能： 如参与抗逆、控制花期、控制 株高等。 基因的功能不是孤立、单一的。
根据基因的功能分类：
控制细胞分裂的基因； 控制细胞分化的基因； 影响植物发育的基因； 负责信号转导的基因； 参与生物大分子合成的基因； 抗逆境的基因；
⑤成本较低，因为随机引物可在公司买 到，其价格不高；
⑥RAPD标记一般是显性遗传（极少数 是共显性遗传的），这样对扩增产物的 记录就可记为“有/无”，但这也意味着 不能鉴别杂合子和纯合子；
RAPD特点：
⑦最大问题是重复性不太高，条件的变化 会引起一些扩增产物的改变；但是，如果 把条件标准化，还是可以获得重复结果的;
⑧存在共迁移问题，在不同个体中出现相 同分子量的带后，并不能保证这些个体拥 有同一条（同源）的片段； 同时，在胶上看见的一条带也有可能包含 了不同的扩增产物，即片段大小相同，但 碱基序列不同。
4）分子标记的种类
(3) 扩增片段长度多态性
扩增片段长度多态性(Amplified Fragment Length Polymorphism，AFLP)：其特点是 把RFLP和PCR结合了起来。
造成RFLP的原因点突变（新产生和去除 酶切位点，即SNP）和一段DNA的重新 组织（如插入和缺失造成酶切位点间的 长度发生变化，即InDel）。
凡是引起酶切位点变异的SNP 、InDel等 均可导致RFLP的产生。
4）分子标记的种类
(1) 限制性片段长度多态性
此技术及其从中发展出来的一些变型均 包括以下基本步骤：
(2) 随机扩增多态性
随机扩增多态性DNA(random amplified polymorphic DNA，RAPD) 原理是用一 个（有时用两个）随机引物（一般8-10 个碱基）非定点地扩增DNA片段，然后 用凝胶电泳分开扩增片段。
RAPD检测的多态性主要是InDel，有时 可检测到碱基突变造成的多态性。
物理作图主要有四种类型：
(2)依靠克隆的作图(clone-based mapping)。
即根据克隆的DNA片段之间的重叠顺序 构建重叠群（contig），绘制重叠克隆的 物理连锁图。
物理作图主要有四种类型：
(3) 荧光标记原位杂交（fluorescent in situ hybridization, FISH）作图。
物理图谱是指DNA序列上两点之间的绝 对距离。单位是碱基对。
物理图谱所用的标记是分子标记，称为 “序列标记位点（STS）”。
物理图谱主要有三种类型：
（1）限制性酶切图谱 根据限制性酶切染色体片段的重叠序列，
把酶切染色体片段连接成染色体，绘制物 理图谱。
（2）连续片断图谱 根据连续DNA片段之间的重叠顺序构建
另一类是DNA序列发生插入或剔除变化 （insertion/deletion，InDel）。
4）分子标记的种类
分子标记是伴随着分子标记检测技术而 产生的。分子标记的检测技术主要有两 类：
① 以分子杂交为基础的分子标记，如 RFLP；
② 以PCR检测技术为基础的分子标记， 包括单引物PCR标记和双引物PCR标记
(1) 小卫星序列：重复单位含有10-60个 碱基。
(2) 微 卫 星 或 简 单 重 复 序 列 (simple sequence repeats, SSR)：重复单位含有15个碱基。
RFLP的特点：重复性好，结果可靠。
RFLP的不足： 需要大量的DNA； 需要放射性同位素； 费时、技术复杂。
4）分子标记的种类
重叠群(contig)，绘制物理连锁图。
（3） DNA序列图谱 是物理图谱中最精细的图谱。
物理作图主要有四种类型：
(1)限制性作图(restriction mapping )。
利用限制性内切酶将染色体切成数个片 段，再根据重叠序列把片段连接成染色 体，确定遗传标志之间的物理距离(bp、 kb或Mb)，它可以将限制性酶切位点标 定在DNA分子的一定位置上。
1. 遗传图谱与物理图谱
相距1cM的2个遗传标记在姐 妹染色单体发生重组中，具有 1%相互分离的机会。
遗传图谱的用途：分析基因组 结构、遗传育种、研究生物进 化关系。
二、遗传图谱与连锁分析
1. 遗传图谱与物理图谱
构建遗传图谱的主要基础是拥 有足够多的遗传标记。
二、遗传图谱与连锁分析 1. 遗传图谱与物理图谱 遗传标记主要有4种类型：
RAPD特点：
①不需DNA探针，设计引物也不需要知 道序列信息；
②用一个引物就可扩增出许多片段（一 般一个引物可扩增6-12条片段，但对某 些材料可能不产生扩增产物），是一种 检测多态性快速的方法；
③技术简单，不涉及Southern杂交、放 射自显影或其它技术；
RAPD特点：
④不象RFLP分析，RAPD分析只需少量 DNA样品；