实验三 果酒酵母的分离

北方民族大学

实验方案

果酒酵母的分离、纯化及选育

果酒酵母发酵

院(部)名称：生物科学与工程学院

******** 20092474

隆冬玲 20092499

马忠孝 20092526

张晶 20092475

张静艳 20092462

专业:生物工程

指导教师姓名:倪志婧

实验三果酒酵母的分离、纯化及选育

原始数据记录

1.筛出5株酵母菌

2.发酵力试验：采用CO2失重法

不同酵母菌株在发酵过程中CO2失重的动态变化

不同发酵时间（d）下三角瓶的重量/g

原重1d 2d 3d 4d 5d 6d CO2释放量

菌种

1 164.8 163.8

2 161.51 159.4

3 158.2

4 157.2

5 155.49 9.31

菌种

2 152.5 151.8

3 150.85 149.38 148.3

4 147.32 145.94 6.56

菌种

3 158.

4 156.73 154.78 152.99 152.1 151.24 150.04 8.36

菌种

4 155.1 153.97 152.04 150.34 149.42 148.66 147.7 7.4

菌种

5 156.1 155.22 152.8

6 151.02 149.95 149.28 148.15 7.95

从上表可以看出1号菌株在发酵终了时CO2释放量（g）最多，即1号菌株发酵速度最快，是发酵速度较高的酵母。

不同发酵时间（d）CO2释放量/g

1 2 3 4 5 6

菌种1 0.98 2.31 2.08 1.19 0.99 1.76

菌种2 0.67 0.98 1.47 1.04 1.02 1.38

菌种3 1.67 1.95 1.79 0.89 0.86 1.2

菌种4 1.13 1.93 1.7 0.92 0.76 0.96

菌种5 0.88 2.36 1.84 1.07 0.67 1.13

从上表可以看出1号和5号菌株在发酵开始时CO2释放量（g）最快，即1号和5号菌株发酵力最强。

3.耐受性试验

做1号菌株和5号菌株的耐受性试验：采用杜氏管发酵法测定所筛选的酵母菌对乙醇（5%、6%、7%、8% 、9%）二氧化硫（30、50、60、90、120 mg/L）的耐性。

从上表可以看出1号和5号菌株对二氧化硫耐受力基本相同，5号菌株对酒精耐受力比1号菌株强。

实验方案

果酒是利用新鲜水果为原料，在保存水果原有营养成分的情况下，利用自然发酵或人工添加酵母菌来分解糖分而制造出的具有保健、营养型酒。果酒富含多种氨基酸、维生素及矿物质等营养成分，还含有丰富的生理活性物质，经常适量饮用具有一定的保健作用。酵母品种是酿造果酒的关键因素之一，酵母性状的好坏直接影响到所酿果酒的口感和风味，决定果酒品质的优劣。果酒酵母包括醇酿酒酵母和非酿酒酵母，前者的应用提高了果酒酿造的生产效率，后者的应用则对果酒的总体风味产生积极的影响。野生型果酒酵母经分离纯化后，结合诱变、杂交、原生质体融合、基因工程及其他育种技术，其酿造性能显著提高，酿造的果酒品质明显改善，因此果酒酵母的选育研究得到了重点关注。本实验选用当季新鲜水果为原料，分离纯化3-5株酵母菌，并对其筛选使其适合果酒酿造。

一、实验目的和内容 1.学习掌握果酒酵母分离纯化的方法；2.对分离纯化得到的酵母菌进行筛选使其适合果酒酿造。

二、实验原理

酿酒酵母细胞透明，呈圆形或椭圆形，形体比较大，一般为7×12μm，含有转化酶能将葡萄汁中的糖转化成乙醇、二氧化碳和其它代谢产物。优良纯种酵母应具备下列性能：（1）除酿酒水果本身的果香外，酵母也应产生良好的果香与酒香。（2）生长速度快，有较高的发酵能力，能将糖分全部发酵完。（3）具有较高的抗S02能力，有较好的凝集力和较快的沉降速度。（4）培养基成分简单，来源广泛，价格低廉，对温度，pH，离子强度，溶氧等环境因素不敏感。（5）能在低温或果酒适宜温度下发酵，以保持果香和新鲜清爽的口味。

由此可见，酵母的品质对果酒的产量和质量影响很大。要获得优良的酿酒酵母，必须对其进行分离选育。果酒酵母的筛选应从相应的果品及其种植环境中采样分离，如成熟果实的表皮、自然腐烂发酵的果肉或果汁和果园的土壤等相关场所。根据实践经验，在果汁和自然发酵的果酒醪液中检出率较高，因为它们的基质环境与酿酒环境很相似。为使我们需要的酵母易于检出，应对采集的样品进行富集培养，通过设置较高的酒精浓度、添加SO2、调整pH 等手段抑制不需要的微生物的生长，使希望检出的微生物得到增殖。酵母检出后，应对其的发酵性能进行考察，包括酵母的一系列生理生化特性和风味物质形成的能力等，这些可通过作生理生化实验和三角瓶小型发酵实验分析和测定。

三、实验仪器与材料

样品：苹果

YEPD 培养基（富集培养基）: 蛋白胨20g，葡萄糖20g，酵母膏10g，蒸馏水定容至1000ml.

PDA培养基（酿酒酵母培养基）：马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂20g，蒸馏水定容至1000ml.（马铃薯去皮，切成块煮沸后再煮30分钟，然后用纱布过滤，再加糖及琼脂溶化后定容至1000 ml。121℃灭菌30分钟。）

器具：三角烧瓶(250 mL)、无菌试管、无菌吸管(1 mL及5 mL)、无菌滴管、接种环、冰箱、酒精灯、冰箱、玻璃涂棒，血细胞计数板，显微镜，磁力搅拌器，台式离心机，震荡混合器等。

四、实验方法与步骤

酵母菌在自然界中存在的范围非常广泛，可以从不同的陆地或海洋生物环境中分离得到。在成熟水果的果皮、果梗上存在的酵母种类十分丰富，可针对不同水果原料分离出适合其自身特点的酿酒用酵母菌。

(1)．酵母菌的分离初筛

1）菌种采样

样品土壤

叶片果实（带柄）腐果瓜根际土壤藤下方土壤垄间隙土壤

采集方法

用无菌小铲清去表层石块露出土壤后，戴

好无菌手套取500g左右的土样装入无菌

袋内。

用无菌剪

刀剪取不

同生长阶

段的叶片

装入无菌

袋内。

用无菌剪刀摘

取不同龄期的

甜瓜（幼龄期，

膨大期，成熟

期）分别装入

无菌袋内。

用无菌剪

刀摘取腐

烂的果实

装入无菌

袋内。随机选择三块样地采样，每样采三份，将采集到的样品迅速保存在低温箱内(冰块降

温)。

2）富集培养与纯种分离

方法一：配制YEPD培养基分装于100ml三角瓶内每瓶50ml高温灭菌冷却，然后分别取适量样品（土样1g，果皮5g ，果柄若干，叶片若干）各三份接种，120r/min，28℃摇床培养4天。将富集培养液用接种环划线接种在PDA培养基上，每个样品接三个平板，28℃恒温培养。待菌种长出小菌落，镜检为酵母菌后，将其挑取于PDA平板划线并标号后28℃恒温培养。待再次长出单菌落后，挑取划线于PDA培养基上，28℃恒温培养。菌种划线三到四次后基本纯化。

方法二：将腐果装无菌袋置于恒温箱内培养。腐果表面长有白色菌落，镜检为酵母菌后，用接种环将其划线至PDA培养基上，28℃恒温培养。待长出单菌落后，挑取划线于PDA培养基上，28℃恒温培养。菌种划线三到四次后基本纯化。

(2)．酵母菌种的复筛

选择果酒生产中生产性能优良的新鲜果汁液作为复筛培养基。将初选菌种接入保藏培养基。培养24 h后每支斜面接入三角瓶培养，置于23-25 ℃的培养箱中培养，测定其发酵水平及产香水平，选育出优良健壮、耐性强的适合果酒发酵的酵母菌种。

发酵力试验：采用CO2失重法，取100 mL 三角瓶(已经烘干、称重)，各加入80 mL果汁，