乙型肝炎病毒X基因与原发性肝癌的关系

乙型肝炎病毒X基因与原发性肝癌的关系

田小侠　陈双峰

(聊城市人民医院,聊城252000)

我国是乙型肝炎(HB V)的高流行区,占全球乙型肝炎总携带率的近50%,现患慢性乙型肝炎的病人约1000万,大量的流行病学调查显示,慢性HB-sAg携带者患肝癌的危险度比非感染人群高100倍。目前对肝癌的病因学研究虽已广泛开展,但对病毒诱导肝细胞转化的具体机制还未彻底明确。在长时间的HB V感染过程中,宿主一病毒间的相互作用在肿瘤形成过程中起着更为直接的作用。随着研究的深入,一些HB V的致癌特性逐渐被人们认识,主要包括:病毒DNA可整合到宿主染色体内;病毒反式转录激活因子(X基因产物)表达失调造成细胞生长调控障碍等。以下就乙型肝炎病毒X基因与原发性肝癌的关系做以综述。

1　HBV的基因结构

HBV基因组属环状双股DNA病毒。HB V基因组含有约3,200个核苷酸,是一不全双链的环状DNA分子。它包括两个链:一个长度固定的负链和另一长度不定的正链。其长链含有4个开放读码框架(0RF),分别为编码前S1蛋白、前S2蛋白及S蛋白的S基因,编码前C蛋白与C蛋白的C基因,编码DNA聚合酶蛋白的P基因,以及编码HBxAg的X 基因。

X基因是HB V DNA中最小的一个ORF,编码基因区位于l374～1818核苷酸之间,其编码的乙肝病毒X抗原(HBxAg)由154个氨基酸组成。Kwee等研究表明X基因至少编码Mr17000,8000和6600三种蛋白,三种蛋白在调控中的作用有所不同,只有Mrl7000HB xAg能激活NF-kB依赖性启动子序列,而对SV40的增强子/启动子序列的转录激活,Mr l7000和Mr6600蛋白均为必需。可见X基因编码的三种蛋白在功能上互相联系,具有多种转录调节活性。

2　乙肝病毒X基因与肝癌

2.1　X基因整合与原发性肝癌(PHC)的关系

在慢性活动性乙型肝炎病程中,HB V DNA以低频率随机整合入肝细胞基因组DNA。病毒整合引起的病毒和细胞DNA序列的缺失、重排、转位或扩增,最终导致染色体畸变。HB V DNA整合可能使染色体失稳而易于丢失。

关于HB V DNA整合的研究在分子水平上为HB V的致癌作用提供了进一步证据。Shermar和Shfritz提出肝细胞的癌变可能为一长期过程。认为在急性、慢性肝炎或持续携带HBsAg期间,HB V DNA整合到宿主染色体中。而含有整合HBV DNA 的肝细胞则可以逃避免疫监视而优先存活下来,随着这些细胞的不断增生,产生有异常遗传特性的肝细胞,即细胞转化,最终发展为HCC。HBV DNA整合入细胞DNA仅是一个起始过程,它不足已单独引起细胞转化;随后,整合有病毒DNA的肝细胞DNA 发生重组继而导致细胞转化,转化后的细胞在宿主内环境及外环境的多种因素作用下,最终导致癌变。在HB V相关的肿瘤组织中常可见有缺损或重排的整合病毒基因组,在宿主染色体上的整合部位呈现明显的随机性,目前还无特定的部位的报道。有报道用Southern杂交测定HB V DNA的整合状态,以斑点杂交检查整合型HCC中HB V各基因的整合,纯整合型HC C中HB V X、S、Pr e-S和C的整合率分别为87.5%(28/32),62.5%(20/32),62.5%(20/32), 25.0%(8/32),其中HB V X基因整合率明显高于其它基因片段。

2.2　X基因的转染与转基因研究　X基因的转染与转基因研究使人们对X基因的致癌作用有了突破性认识。1989年Shirakata等首先发现通过X基因片段的表达载体转染小鼠成纤维细胞系NIH3T3诱发其体外转化,经裸鼠移植可在裸鼠体内形成肿瘤。其后Luber等应用X基因转染小鼠肝细胞系FMH202,发现所有转染成功的细胞克隆在软琼脂培养中出现恶性生长,形成的细胞集落移植到裸鼠后形成瘤灶。作者认为X基因的表达及肝细胞的基因突变是导致HCC发生的主要原因。X基因转基

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因研究中最引人关注的是Koike等将X基因导CD -1小鼠系的胚胎细胞中,诱发84%的雄鼠肝脏肿瘤并伴有HB xAg的高度表达。实验小鼠在2月龄时围绕中央静脉周围的肝细胞出现胞质空泡样变,伴有HBxAg的高度表达,13月龄时小鼠出现癌灶。经5-溴脱氧尿核苷标记分析,病灶中肝细胞DNA 的合成较对照明显增加,且DNA含量分析显示在癌灶出现前转基因鼠的肝脏存在数个非整倍体峰。转基因鼠的研究为X基因在HC C发病中的作用提供了直接的证据。然而,并非所有的转基因研究均能诱发恶性转化,Reifenber g等将X基因导入C57B/6J 小鼠的胚胎中,经长期的观察后处死小鼠,组织学检查显示转基因小鼠的肝脏虽有X基因表达,但病理改变轻微,并无HCC的发生。对此,Koike认为能否在转基因鼠中诱发HCC的关键是HBxAg的持续高水平表达,而仅低水平的HB xAg表达不足以导致HCC的发生。

2.3　X基因的反式激活作用　1987年Twu等发现与PUC9重组的X基因在猴肾细胞中可激活人β-干扰素基因的调控序列,使受此调控序列调控的氯霉素乙酰转移酶转录增加,从而揭开了X基因反式激活作用研究的序幕。现已明确X基因的反式激活作用具有明显广谱性,HBxAg作为一种非特异性反式激活因子,对多种细胞与病毒的多种靶基因均具有反式激活作用。

目前已知HB xAg对多种癌基因具有反式激活作用,其中包括c-m yc,ras,c-fos及c-jun等。此外,HBxAg亦能激活胰岛素样生长因子受体I,II及多药耐药基因。因此,X基因通过其反式激活作用改变宿主基因的表达,导致HCC的发生。HBxAg的反式激活机制非常复杂,主要是以细胞因子作为桥梁,通过复杂的信号传导间接发挥其广谱转录激活功能。与HBxAg反式激活有关的细胞因子有AP-1,AP-2,NF-kB,EF-C及ATF/CREB等。目前已知HBxAg可引起内源性蛋白激酶C(PKC)活性物质DAG增加,激活PKC后引起AP-1,AP-2及NF-kB等细胞因子活化,从而对靶序列发挥激活作用。另一方面,HBxAg亦可通过激活Ras-Rafi-MAP激酶链锁反应,引起AP-1及NF-kB活化,继而发挥转录激活作用。此外,亦有研究显示HBxAg可直接作用于核内组分引发转录激活,或者与细胞内蛋白酶、蛋白酶复合物组分或DNA修复蛋白发生作用,从而发挥其反式激活作用。可见HB xAg的反式激活存在多种途径与方式。虽然目前对HBx Ag反式激活的途径及功能结构有所了解,但由于其作用机制的复杂性,人们尚缺乏统一的认识。

2.4　X基因与p53基因p53基因是一种肿瘤抑制基因,野生型p53具有维持细胞正常生长,抑制细胞恶性转化的作用。当细胞因物理或化学因素作用发生DNA损伤时,可通过p53启动细胞凋亡过程,使有癌变倾向的细胞不再存活。p53基因的丢失或突变失活不但使其失去野生型p53的作用,而且可能具有癌基因的功能。1991年Hsu等研究人员分别报道了中国启东和南非地区的HCC,发现在p53的249编码区第三密码子有一特征性点突变G※T颠换(249ser),使原先的精氨酸被丝氨酸所代替,其突变率高达50%,这一结果曾被视为肝癌与p53关系研究中的重大突破。在HB V与p53基因关系研究中引人注目的结果是发现了HB xAg有与P53蛋白结合的作用。由于HB xAg与P53蛋白的结合可在蛋白水平上使靶细胞中抑癌基因及其产物的功能发生改变,破坏了p53基因的负调节作用,从而导致细胞的恶性转化。现已证实HBxAg能有效阻断p53介导的细胞凋亡,其机制可能为通过p53功能的丧失,抑或干扰阻断p53与TBP亚基TFI I H及p62亚基TF I I D的联系。然而,Oguey等对鼠肝细胞系AMLl 2进行X基因与p53246ser突变基因的共转染研究,结果并未发现明显的恶性转化,这或许与AML12细胞系对p53突变及HBxAg的作用不甚敏感有关。

2.5　X基因及其表达　统计分析表明HBV DNA整合多发生在HBV基因组的X基因区域,因此X基因及其产物HBxAg的表达研究引人注目。在肝癌组织中,X基因与HB xAg表达的阳性率约为50%～90%,HBxAg主要位于胞质内,部分位于胞核内,且癌周组织的阳性率与癌内相近,但HB xAg在肝癌的表达远较乙肝后肝硬变及慢性乙肝为高,在分离培养的人肝癌细胞仍保持表达HBxAg的特性。此外,约有40%～60%表达X基因或HBxAg的肝癌,其HBsAg的表达为阴性,提示部分血清HBsAg阴性患者其肝癌组织中仍有X基因的整合。HBxAg在肝癌的表达亦常伴有p53的突变。由于X基因的整合与HBx Ag的表达既可见于癌细胞,也可见于部分尚无明显癌变的肝细胞或无症状HBV携带者的肝细胞中,因此整合本身仅可能为致癌的起始因素。通过整合可使DNA结构异常,在有辅助致癌因素的作用下可启动癌基因的调节顺序,或通过X基因的反式激活作用,使癌基因转录活性增强而最终导致肝细胞恶性转化。有鉴于此,有学者认为HBxAg的表

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