医学免疫学- 免疫学检测技术
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抗血清吸收
1st antibody & 2nd antibody
一抗；二抗
Reversibility/invertibility:
（二）可逆性
non-covalent, surface-binding , dissociable
非共价、表面结合，可解离
complementary capacity: affinity; avidity
（1）免疫学检测法—— 夹心法ELISA FCM （2）生物学检测法—— 细胞增殖（或细胞增殖抑制）试验 细胞毒（或细胞毒抑制）试验 （3） 分子生物学检测法 RT-PCR测定mRNA 4. 皮肤试验： 测试IV型超敏反应能力
（二）B细胞功能测定
1. B细胞增殖试验 小鼠：LPS 人： SPA；抗IgM
2. Clinical application
二、免疫学检测方法的临床应用
1) Infectious diseases
（一） 感染性疾病
pathogen 病原体的特异抗原或抗体检测 2) Immunodeficiency diseases
（二）免疫缺陷病
Ig, complement, immune cells 3) Immunological supervision
4. 对流电泳： 双向免疫扩散 + 电泳
5. 火箭电泳： 单向免疫扩散 + 电泳
（抗原/抗体定性）
（抗原定量）
6. 免疫比浊： 抗体 + 递增量抗原比浊（抗原定量）
III ) Immunolabelling Techniques
（三）免疫标记技术
标记物： 荧光素、酶、放射性核素、电子致密物质、化学发光物质 标记对象：抗原或抗体 用途： 定性、定量、定位
一、免疫学检测方法的评估与选择
Reliability: true vs false
可靠性 ( gold standard*=真阴性率与真阳性率) * Specificity= 真阴性/（真阴性+假阳性）x 100% * Sensitivity= 真阳性/（真阳性+假阴性）x 100% Safety 安全性 Simplicity 简易性 Saving of time and money 经济性
*免疫组化技术：可对抗原定性、定量、定位 酶免疫组化： HRP 免疫金银组化： 胶体金颗粒 免疫电镜技术： HRP、胶体金、铁蛋白
双抗体夹心法、间接法ELISA
间接法
ELISA
ELISA操作图
可调移液器
8孔道可调移液器
3. 放射免疫测定（RIA）
常用 125I，测定微量物质 4. 化学发光免疫分析 常用 鲁米诺，测定超微量物质 5. 免疫印迹法（Western Blotting）
经典技术
中和反应
补体结合反应
凝集反应
沉淀反应
I)
Agglutination
（一）凝集反应：
颗粒性抗原或包被有可溶性抗原的颗粒 + 相应抗体肉眼可见的凝集 块
1. 直接凝集 颗粒性抗原+ 相应抗体 玻片凝集：抗原定性 （ABO血型） 试管凝集：抗体定量 （肥达反应） 2. 间接凝集 包被有可溶性抗原的颗粒 + 相应抗体
互补程度：亲和力 ； 亲合力
Visibility
（三）可见性的条件
Compatible concentrations of antigen and antibody combined in proportion at or near equivalence [Antigen: multivalent; Antibody(IgG): divalent ]
Selection as per requirement and availability
依据需要与可能选择
Screening:
避免漏诊
初筛
high sensitivity first, to avoid case missing Diagnosis:
避免误诊 确诊
high specificity first, to avoid misdiagnosis
1. 免疫荧光法（IFA ）
荧光素可双色；使免疫复合物呈荧光；可定性、定位 （1）直接荧光法 荧光素一抗 对每种抗体作标记 特异 测Ag （2）间接荧光法： 荧光素二抗 不必标记每种抗体 敏感 测Ag/Ab
免疫荧光法
2. 酶免疫测定（EIA）: ELISA与酶免疫组化
（1）双抗体夹心法ELISA：查抗原 （2）间接法ELISA： 查抗体 （3）BAS-ELISA ： Biotin-Avidin-酶放大系统 （4）ELISPOT测定法： __包被物 待测物 测定结果___ 抗CK抗体 CK分泌细胞 单一CK 已知抗原 B细胞 特异B细胞 （5）酶免疫组化* 酶标抗体 + 组织/细胞（未知抗原） + 形态学检查
1. 免疫荧光法 常用间接法测CD3/CD4/CD8、mIgM/mIgD 2. 磁珠分离法 如抗CD4抗体交联微珠可分离CD4与CD8 3. 流式细胞术（Flow Cytometry, FCM） 可分析细胞大小、核型、表面分子（多种荧光标记） 检测各类免疫细胞及其比率 白血病、淋巴瘤的免疫学分型 细胞分选
比例适合：抗原多价，抗体2价。交织成网。
Ph value; Temperature; Ionic concentration 条件适宜：酸碱度、温度、离子浓度 Adequate concentration, binding strength; reaction time 足够浓度、结合强度和反应时间
II ) Precipitation
（二）沉淀反应
可溶性抗原 + 相应抗体肉眼可见的沉淀物 使用半固体琼脂凝胶为介质——琼脂扩散/免疫扩散 1. 单向免疫扩散：抗原 的定量（Ig、C3 ）
2. 双向免疫扩散：抗原/抗体的定性、组成及Ag相关性分析
3. 免疫电泳： 电泳 + 双向免疫扩散 （抗原分析）
红细胞（间接血凝）；乳胶（间接乳凝） Coombs’ Test: 红细胞（Rh抗原）+ 不完全抗体 + 抗人球蛋白
3. 派生的试验
反向间接凝集反应：包被抗体的颗粒 + 抗原 间接凝集抑制反应： （乳胶妊娠试验） 抗体 + 未知抗原 + 包被有相应可溶性抗原的颗粒 凝集？
Haemagglutination
（三）免疫学监测
illness status, curative schema,drug effect, prognosis
病情分析，治疗方案，疗效评价，预后判定
Thank you!
Prozone phenomenon
前带现象
二、抗原-抗体反应的应用
Terms Serological reaction Qualitative analysis Quantitation Orientation Titration Titer
术语
血清学反应 定性 定量 定位 滴定 效价/滴度
三、常用的抗原-抗体反应技术
免疫学检测技术 Immunodiagnosis
I. Detection of antigens or antibodies
第一节 抗原或抗体检测
一、抗原-抗体反应的特点
Specificity
（一）高度特异性
Cross-reaction: common antigen
交叉反应：共同抗原
Antiserum absorption
2. 抗体形成细胞检测 溶血空斑试验 ELISPOT试验
（三）吞噬细胞功能的测定
1. 趋化功能测定 Boyden 小室
2. 吞噬功能测定
第三节 补体及循环免疫复合物的测定
III. Application of immunological
techniques 第四节 免疫学检测方法的应用 1. Assessment and selection
二、淋巴细胞功能测定
（一）T细胞功能测定 1. T细胞增殖试验： 丝裂原/抗CD3刺激/特异抗原细胞增殖 （1）同位素掺入法 （2）MTT法 （3）形态观测法 2. 细胞毒试验 CTL、NK细胞杀伤靶细胞 （1）51Cr 释放法 （2）凋亡细胞检查法 阶梯状酶切图谱 TUNEL法 FCM
wk.baidu.com
3. 细胞因子检测
先做凝胶电泳将蛋白质分区 再将蛋白质转移至固相载体 后用酶免疫、放射免疫等技术加以测定
第二节 免疫细胞的测定
一、淋巴细胞的分离与类型鉴定
（一）血细胞分离
外周血 密度梯度离心法 外周血单个核细胞（淋巴细胞+单核细胞） 吸附培养分离法
淋巴细胞
尼龙毛，抗CD3单抗，E花结
T细胞
B细胞
（二）淋巴细胞鉴定
1st antibody & 2nd antibody
一抗；二抗
Reversibility/invertibility:
（二）可逆性
non-covalent, surface-binding , dissociable
非共价、表面结合，可解离
complementary capacity: affinity; avidity
（1）免疫学检测法—— 夹心法ELISA FCM （2）生物学检测法—— 细胞增殖（或细胞增殖抑制）试验 细胞毒（或细胞毒抑制）试验 （3） 分子生物学检测法 RT-PCR测定mRNA 4. 皮肤试验： 测试IV型超敏反应能力
（二）B细胞功能测定
1. B细胞增殖试验 小鼠：LPS 人： SPA；抗IgM
2. Clinical application
二、免疫学检测方法的临床应用
1) Infectious diseases
（一） 感染性疾病
pathogen 病原体的特异抗原或抗体检测 2) Immunodeficiency diseases
（二）免疫缺陷病
Ig, complement, immune cells 3) Immunological supervision
4. 对流电泳： 双向免疫扩散 + 电泳
5. 火箭电泳： 单向免疫扩散 + 电泳
（抗原/抗体定性）
（抗原定量）
6. 免疫比浊： 抗体 + 递增量抗原比浊（抗原定量）
III ) Immunolabelling Techniques
（三）免疫标记技术
标记物： 荧光素、酶、放射性核素、电子致密物质、化学发光物质 标记对象：抗原或抗体 用途： 定性、定量、定位
一、免疫学检测方法的评估与选择
Reliability: true vs false
可靠性 ( gold standard*=真阴性率与真阳性率) * Specificity= 真阴性/（真阴性+假阳性）x 100% * Sensitivity= 真阳性/（真阳性+假阴性）x 100% Safety 安全性 Simplicity 简易性 Saving of time and money 经济性
*免疫组化技术：可对抗原定性、定量、定位 酶免疫组化： HRP 免疫金银组化： 胶体金颗粒 免疫电镜技术： HRP、胶体金、铁蛋白
双抗体夹心法、间接法ELISA
间接法
ELISA
ELISA操作图
可调移液器
8孔道可调移液器
3. 放射免疫测定（RIA）
常用 125I，测定微量物质 4. 化学发光免疫分析 常用 鲁米诺，测定超微量物质 5. 免疫印迹法（Western Blotting）
经典技术
中和反应
补体结合反应
凝集反应
沉淀反应
I)
Agglutination
（一）凝集反应：
颗粒性抗原或包被有可溶性抗原的颗粒 + 相应抗体肉眼可见的凝集 块
1. 直接凝集 颗粒性抗原+ 相应抗体 玻片凝集：抗原定性 （ABO血型） 试管凝集：抗体定量 （肥达反应） 2. 间接凝集 包被有可溶性抗原的颗粒 + 相应抗体
互补程度：亲和力 ； 亲合力
Visibility
（三）可见性的条件
Compatible concentrations of antigen and antibody combined in proportion at or near equivalence [Antigen: multivalent; Antibody(IgG): divalent ]
Selection as per requirement and availability
依据需要与可能选择
Screening:
避免漏诊
初筛
high sensitivity first, to avoid case missing Diagnosis:
避免误诊 确诊
high specificity first, to avoid misdiagnosis
1. 免疫荧光法（IFA ）
荧光素可双色；使免疫复合物呈荧光；可定性、定位 （1）直接荧光法 荧光素一抗 对每种抗体作标记 特异 测Ag （2）间接荧光法： 荧光素二抗 不必标记每种抗体 敏感 测Ag/Ab
免疫荧光法
2. 酶免疫测定（EIA）: ELISA与酶免疫组化
（1）双抗体夹心法ELISA：查抗原 （2）间接法ELISA： 查抗体 （3）BAS-ELISA ： Biotin-Avidin-酶放大系统 （4）ELISPOT测定法： __包被物 待测物 测定结果___ 抗CK抗体 CK分泌细胞 单一CK 已知抗原 B细胞 特异B细胞 （5）酶免疫组化* 酶标抗体 + 组织/细胞（未知抗原） + 形态学检查
1. 免疫荧光法 常用间接法测CD3/CD4/CD8、mIgM/mIgD 2. 磁珠分离法 如抗CD4抗体交联微珠可分离CD4与CD8 3. 流式细胞术（Flow Cytometry, FCM） 可分析细胞大小、核型、表面分子（多种荧光标记） 检测各类免疫细胞及其比率 白血病、淋巴瘤的免疫学分型 细胞分选
比例适合：抗原多价，抗体2价。交织成网。
Ph value; Temperature; Ionic concentration 条件适宜：酸碱度、温度、离子浓度 Adequate concentration, binding strength; reaction time 足够浓度、结合强度和反应时间
II ) Precipitation
（二）沉淀反应
可溶性抗原 + 相应抗体肉眼可见的沉淀物 使用半固体琼脂凝胶为介质——琼脂扩散/免疫扩散 1. 单向免疫扩散：抗原 的定量（Ig、C3 ）
2. 双向免疫扩散：抗原/抗体的定性、组成及Ag相关性分析
3. 免疫电泳： 电泳 + 双向免疫扩散 （抗原分析）
红细胞（间接血凝）；乳胶（间接乳凝） Coombs’ Test: 红细胞（Rh抗原）+ 不完全抗体 + 抗人球蛋白
3. 派生的试验
反向间接凝集反应：包被抗体的颗粒 + 抗原 间接凝集抑制反应： （乳胶妊娠试验） 抗体 + 未知抗原 + 包被有相应可溶性抗原的颗粒 凝集？
Haemagglutination
（三）免疫学监测
illness status, curative schema,drug effect, prognosis
病情分析，治疗方案，疗效评价，预后判定
Thank you!
Prozone phenomenon
前带现象
二、抗原-抗体反应的应用
Terms Serological reaction Qualitative analysis Quantitation Orientation Titration Titer
术语
血清学反应 定性 定量 定位 滴定 效价/滴度
三、常用的抗原-抗体反应技术
免疫学检测技术 Immunodiagnosis
I. Detection of antigens or antibodies
第一节 抗原或抗体检测
一、抗原-抗体反应的特点
Specificity
（一）高度特异性
Cross-reaction: common antigen
交叉反应：共同抗原
Antiserum absorption
2. 抗体形成细胞检测 溶血空斑试验 ELISPOT试验
（三）吞噬细胞功能的测定
1. 趋化功能测定 Boyden 小室
2. 吞噬功能测定
第三节 补体及循环免疫复合物的测定
III. Application of immunological
techniques 第四节 免疫学检测方法的应用 1. Assessment and selection
二、淋巴细胞功能测定
（一）T细胞功能测定 1. T细胞增殖试验： 丝裂原/抗CD3刺激/特异抗原细胞增殖 （1）同位素掺入法 （2）MTT法 （3）形态观测法 2. 细胞毒试验 CTL、NK细胞杀伤靶细胞 （1）51Cr 释放法 （2）凋亡细胞检查法 阶梯状酶切图谱 TUNEL法 FCM
wk.baidu.com
3. 细胞因子检测
先做凝胶电泳将蛋白质分区 再将蛋白质转移至固相载体 后用酶免疫、放射免疫等技术加以测定
第二节 免疫细胞的测定
一、淋巴细胞的分离与类型鉴定
（一）血细胞分离
外周血 密度梯度离心法 外周血单个核细胞（淋巴细胞+单核细胞） 吸附培养分离法
淋巴细胞
尼龙毛，抗CD3单抗，E花结
T细胞
B细胞
（二）淋巴细胞鉴定