铁皮石斛组培方案(材料相关)

铁皮石斛组织培养方案报告
一、实验目的
了解铁皮石斛培养的方法和步骤，熟练掌握外植体的取材、消毒、接种、初代培养的操作过程。

二、实验器材
超净工作台、高压灭菌锅、电磁炉、长镊子、培养皿、酒精灯、接种工具、烧杯、玻璃棒、移液管、培养箱、剪刀、培养瓶等。

三、实验步骤
配方：
根据不同阶段，培养基配方有所差异。

如表1
不同阶段培养基备注
愈伤组织（原球茎）的诱导MS+2.0mg/L6-BA+3%蔗糖+0.8%琼
脂
pH=5.8
原球茎的增殖MS+20%马铃薯+3%蔗糖+0.8%琼脂pH =5.8
原球茎的分化MS+20%马铃薯+2.0mg/LNAA+3%蔗
糖+0.8%琼脂
pH=5.8
幼株的生根壮苗MS+10%香蕉+2.0mg/LNAA+3%蔗糖
+0.8%琼脂
pH=5.4-5
.6
10%香蕉（w/w）+MS +3%蔗糖（w/w）+0.8%琼脂（w/w）+2.0mg/L NAA
1）量取800ml蒸馏水于洁净的大烧杯中，加热至沸腾；
2）准确称量100g香蕉果肉，切成碎片状，并倒入上述烧杯中，加热煮沸5min，其间搅拌使之充分溶解；
3）按照大量、微量、Fe2+盐、有机Ⅰ、有机Ⅱ顺序，量取MS各种母液于盛有50ml蒸馏水的烧杯，混合均匀；
4）将2）和3）的溶液混合，然后加入30g蔗糖，并移取2ml NAA（0.1mg/ml），混合均匀；
5）加热至沸腾，加入8g琼脂并煮沸5min，其间不断搅拌使之充分溶解；
6）冷却至50±5℃时，调pH至5.4—5.6。

分装于培养瓶内，33.3ml/瓶。

注意事项：
①溶解香蕉的蒸馏水尽可能多，以确保香蕉各种成分完全溶解；
②各种母液混合时，要按照大量、微量、Fe2+盐、有机Ⅰ、有机Ⅱ的顺序；
③煮沸时，小心溶液溢出；
④分装时不要污染培养瓶瓶口。

灭菌：
1）检查灭菌锅的水位、电源、排气阀、排气管、安全阀以及压力表，确保灭菌锅各指标和功能的正常，以防事故发生；
2）把带灭菌的培养基装入锅内，盖上锅盖，对称而均匀地扭紧螺丝；
3）打开电源和排气阀，调节电压至220V；
4）待排气阀排除水蒸气30s—1min后，关闭排气阀；
5）当温度上升到121℃后，调节电压至135V，保持20min；
6）关闭电源，使之自动降温至0℃。

10min后，打开排气阀和锅盖；7）5—10min后，取出培养基放于试验台上冷却，待用。

表2 灭菌时间统计
阶段单锅灭菌（耗时
64min）
多锅连续灭菌
第一锅（耗时63min）第二锅（耗时46min）
起始22:218:04 9:30
排气22:418:23 9:43
T=121℃22:508:32 9:50
关闭电源23:10 8:52 10:10
气压降至0 23:25 9:07 10:16
注意事项：
①启动灭菌前，应检查水位、电源、排气阀、安全阀、排气管等，确保正常；
②灭菌锅底部应铺垫一层报纸，以防培养瓶机械破损；
③灭菌电压不宜超过220V，否则灭菌锅会剧烈摇晃，造成不必要的损害和安全隐患；
④当温度达到121℃后，调节电压至135V，并且时不时注意温度的变化，确保温度介于121-122℃之间；
⑤气压降至0后，不宜立即揭盖；最好在5-10min后揭盖，这样才能缓和内外“气压和温度差”；
⑥揭盖5-10min后，再转移锅内培养基，以免烫伤。

⑦每锅只能灭菌18瓶
转接
转接前准备
1）培养皿、镊子、剪刀等转接用具的灭菌（可以在培养基灭菌时附带）；
2）检查超净台内各种用具，及时补充酒精灯的酒精，确保用具齐全；
3）放置待转接材料和待接入培养基，以“方便操作为宜”而陈列；
转接
1）揭去防尘膜，打开电源、通风和紫外灯，灭菌15—20min；
2）关掉紫外，打开白炽灯，用75%酒精仔细擦拭手指、指甲、材料瓶瓶盖及盖边缘、工作区等处，确保“消毒”彻底；
3）点燃酒精灯，用无菌镊子把材料夹取于无菌培养皿内，挑选生命力旺盛的植株用于转接；
4）用无菌剪刀修去多余的根系，“双镊子”法将材料转接于新的培养基中；
5）标注相关日期和品系，转至培养室培养。

注意事项
①操作时，所有用具均不能从“核心工作区”和开启的培养瓶上面晃过，防止细菌落入而导致污染；
②在打开材料瓶和培养瓶后，其盖均在酒精灯外焰灼烧3-5s，瓶口灼烧5-10s；盖瓶盖时，亦如此操作；
③转接时，确保手一直在超净台内，以免带入外界细菌。

培养：
培养条件：白炽灯12h/黑暗12h＋20℃
PDA培养基的配制方法，培养基的湿热灭菌操作
一、目的要求
1．学习并掌握配制培养基的一般方法和步骤。

2．学习并掌握棉塞的制作方法。

二、培养基的配制原理
培养基是人工配制的各种营养物质供微生物生长繁殖的基质，用以培养、分离、鉴定、保存各种微生物或积累代谢产物。

在自然界中，微生物种类繁多，营养类型多样，加上实训和研究的目的不同，所以培养基的种类很多，但不论是何种培养基，均应含有水分、碳源、氮源、能源、无机盐等。

不同微生物对pH值要求不一样，所以配制培养基时，还应根据不同微生物对pH值的要求，将培养基调到合适的pH值范围。

三、实训材料和用具
琼脂，可溶性淀粉，葡萄糖，10﹪NaOH，10﹪HCl，1mol／L NaOH，lmol／L HCl，KNO3，NaCl，K2HPO4·3H20，MgSO4·7H20，FeSO4·7H2O；试管，三角瓶，烧杯，量筒，玻璃棒，天平，牛角匙，PH试纸，棉花，牛皮纸，记号笔，纱布，
四、操作方法与步骤
(一) 培养基的配制
PDA培养基的配制其配方如下：土豆200g，葡萄糖20g，琼脂15～20g，水1000mL，pH值自然。

(1)称量和熬煮药品实际用量计算后，按培养基配方逐一称取去皮土豆。

土豆切成小块放入锅中，加水1000ml，在加热器上加热至沸腾，维持20－30min，用可用2层纱布趁热在量杯上过滤，滤渣弃取。

滤液补充水分到1000ml。

(2)加热溶解把滤液放入锅中，加入葡萄糖20g，琼脂15～20g（提前搞碎），然后放在石棉网上，小火加热，并用玻棒不断搅拌，以防琼脂糊底或溢出，待琼脂完全溶解后，再补充水分至所需量。

(3)分装按实训要求，将配制的培养基分装入试管或500ml三角瓶内。

分装时可用三角漏斗以免使培养基沾在管口或瓶口上造成污染。

分装量：固体培养基约为试管高度的1／5，灭菌后制成斜面，分装入三角瓶内以不超过其容积的一半为宜；半固体培养基以试管高度的1／3为宜，灭菌后垂直待凝。

(4) 加棉塞培养基分装完毕后，在试管口或三角烧瓶口上塞上棉塞(或泡沫塑料塞或试管帽等)，以阻止外界微生物进入培养基内造成污染，并保证有良好的通气性能。

(5)包扎加塞后，将全部试管用麻绳或橡皮筋捆好，再在棉塞外包一层牛皮纸，以防止灭菌时冷凝水润湿棉塞，其外再用一道线绳或橡皮筋扎好，用记号笔注明培养基名称、组
别、配制日期。

(二) 棉塞的制作
棉塞的作用有二：一是防止杂菌污染；二是可过滤空气，保证通气良好，并可减缓培养基水分的蒸发，所以正确地制备棉塞是培养基制备中重要的一环。

正确的棉塞是形状、大小，松紧应与试管口(或三角烧瓶)完全适合。

过紧则妨碍空气流通，操作不便；过松时，空气会毫无障碍地进入试管(或三角烧瓶)中，达不到灭菌的目的。

棉塞过小往往易掉进试管内，因此棉塞质量的优劣对实训的结果有很大的影响。

正确的棉塞头较大，加塞时，应使棉塞长度的1／3留在试管口外，2／3在试管口内（见实训图6-4）。

目前，有条件的实训室已使用坚固的塑料试管帽、金属试管帽、硅胶泡沫塞替代棉塞，制作棉塞要选纤维较长的棉花，一般不选用脱脂棉。

因为它容易吸水变湿，造成污染，而且价格也贵。

棉塞制作方法见图6-5
实图6-4棉塞实图6-5 棉塞的制作方法（三）斜面与平板培养基的制作
斜面与平面培养基是常用的琼脂固体培养基。

将熬制好的琼脂培养基趁热装入试管灭菌
后摆鞋面，凝固后即成斜面培养基。

斜面培养基常用于菌种培养、菌种保藏等工作。

将灭菌
后的琼脂培养基倾注于无菌培养皿中，凝固后即成平板培养基。

平板培养基常用于分离菌种、菌落计数、菌落形态观察及菌种鉴定等。

斜面与平板培养基的制作过程大致为：溶解原料、
融化琼脂、调PH、分装、灭菌和制斜面或平板。

1、溶解原料
为加速原料的溶解，最好用热水。

先将原料依次加入到占配制量一半的水中，待全部
溶解后在加足水量。

如配方中有马铃薯、麸皮、胡罗卜、豆芽等天然原料，需将其熬制约
30min，取出定量滤液，在将所需的其他原料加入滤液中。

2、融化琼脂
琼脂的用量可灵活掌握。

用作保藏菌种的培养基，琼脂用量可提高至 2.5%，以增加
持水性。

冬季的气温低，琼脂用量可适当减少。

琼脂用前可剪成小段，以利于融化。

待溶
液煮沸是再加入，不断搅拌至完全无琼脂块状物时再停止加热。

3、调整PH
用洁净干燥的玻璃棒沾一点培养基滴在试纸上，立即与比色板比较。

一般用10%NaOH。