PCR突变技术方法概览

PCR突变技术方法概览

1基于PCR 的体外诱变技术

定点突变的方法很多，而基于PCR 的定点突变技术由于其突变效率高，操作简单，耗时短，成本低廉等优点而倍受瞩目。近十年来，基于PCR 的定点突变技术获得了长足的发展，目前运用此技术已能实现各种类型的基因突变。

基因突变实验包括以下几个步骤:1目的基因全序列变异文库的构建;2利用高通量表达筛选载体从变异文库中筛选表达突变体;3表达突变体的鉴定和表达研究。

1.1 重叠延伸PCR（over-lap extension PCR OE-PCR）

这种方法运用非常广泛、灵活，不受突变位置及突变类型的限制，利用OE-PCR不仅能实现基因点突变，还能便利地实现大片段的插入及删除及插入。

其基本原理如图（1）所示。首先设计两个PCR 反应以产生两个含突变位点的DNA 片段，随后将上述两个PCR 产物混合，二者通过末端互补区结合并在适宜的温度下互引物延伸得到完整的含突变的基因，对第一次PCR 产物进行纯化处理可显著提高突变效率。

OE-PCR 不足之处在于：○1一个突变需要两对引物，3次PCR，并且需对中间产物进行纯化。相对而言步骤较烦琐，不经济；○2由于DNA 二级结构及互补链的竞争等因素的影响，有时两个中间产物难于有效地相互结合导致目的产物得率很低；○3当利用Taq 聚合酶进行PCR 反应时，经常在PCR 产物末端加上腺苷酸，这一多余的腺苷酸一方面导致两个中间产物难于有效地相互结合，另一方面可能会插入基因中导致产生非预期的移码突变。针对这些不足，后来许多学者对OE-PCR 进行了改进。1997年，Urben等提出一步重叠延伸PCR 法（one-step overlap extension PCR），使得三个PCR 反应得以在一个试管里进行，并且省略了烦琐的中间产物纯化过程。其原理是首先将待突变的DNA 以相反的方向克隆到两个载体中，这两个载体除了多克隆位点相反外其余均相同（例如pUC18,19）。这样便得到两个模板。将这两个模板，两个突变引物及一个与载体互补的通用引物置于一个试管中进行一次PCR 反应即可得到含突变的目的基因。1997年，Warrens等利用不对称PCR 反应产生单链中间产物，消除了互补链的竞争性影响，显著提高了目的产物的得率。1990年,Horton等用T4DNA聚合酶处理中间产物，降低了移码突变的发生率。由于OE-PCR几乎没有任何特殊条件的限制，而且成功率很高，因此运用非常广泛。

1.2 大引物PCR 法(megaprimer PCR)

OE-PCR虽然突变成功率很高，但一次突变需要两对引物，进行三个PCR 反应，还需对中间产物进行纯化。因此，相对而言成本偏高，操作较烦琐。大引物PCR 法是OE-PCR 的改进版，利用大引物PCR 法只需三个引物，两个PCR 反应，而且无需中间产物纯化等步骤。其方法是先设置一个PCR 反应产生一个含突变的DNA 片段，然后再以此DNA片段作为引物与原模板退火进行PCR 扩增得到含突变的完整的基因。因为作为引物使用的DNA 片段较通常的引物要大许多通常有上百碱基，所以命名为大引物PCR 法。最初采用的大引物PCR 法突变效率较低，只有约50%终产物符合预期的要求，因此后续的筛选鉴定工作量较大。后来许多学者通过对引物进行巧妙设计或对模板进行巧妙处理，从而使得大引物PCR 法达到类似OE-PCR 的突变效率。例如，有学者等对模板进行适当的酶切处理遏制了野生型模板的扩增，提高了突变效率。Te等在设计引物时使第一轮PCR 的引物和第二轮PCR的引物长度相差较大，相应它们的解链温度Tm值也产生显著差异.这样第一轮PCR 采用低的退火温度,之后在无需纯化的情况下直接加入高Tm值引物,同时相应提高退火温度,与大引物一起引发第二轮PCR 扩增。基于这一设计,不仅排除低Tm值的引物的干

扰,使野生型模板不致被扩增,而且省略了大引物的纯化步骤,使整个反应能在一个反应管内进行。

1.3特殊位置碱基的定点突变

如上所述，进行一次突变一般需要经历1 到3次PCR 及中间产物的纯化等步骤。但当需突变的碱基位于某些特殊位置时，就可以简单地运用一次PCR 实现定点突变，下面讨论这样两种特殊情况。

（1）需突变碱基位于基因的末端

当需突变碱基位于基因的末端时，定点突变便非常简单易行。只需设计一对引物，其中一个为突变引物，含有欲突变的碱基，另一个引物则完全与模板互补。此二引物在5’端均含有适宜的限制性酶切位点及“夹子”序列，以便将扩增产物克隆入载体中，如图 2 所示。

（2）唯一限制性位点删除法(unique site elimination technique USE）

当需突变的碱基附近含唯一的限制性酶切位点时，如图3 所示，可以设计一对引物，其中突变引物含有上述限制性酶切位点及欲突变的碱基。以野生型基因为模板进行PCR 扩增。随后用限制性内切酶将野生型基因的待突变区切除，并将PCR 扩增产物与野生型基因的残留片段连接，从而得到完整的含突变基因。但利用该方法必须注意：突变碱基附近必须含有一限制性酶切位点，并且这一位点在整个基因的其他位置不能有。实际运用中符合这一条件的情况不多见，因此这一方法受到很大限制；然而，一旦条件具备，运用这一方法，较其他方法都要省时省力。

1.4 扩增环状质粒全长的突变方法

前述几种方法都既适用于线性DNA 也适用于环状DNA，然而当待突变的基因已经克隆入环状质粒时，只能选择另一类方法进行突变，既：利用一对含突变的引物扩增整个环状质粒，从而得到含突变的线性DNA，随后将线性DNA 环化便得到完整的含突变的质粒。由于引物设计策略的不同，这一方法又可以分为两种：一种方法是一步PCR法（single step PCR , S-PCR），两个引物反向、紧邻但没有重叠区，利用高保真聚合酶扩增产物是平末端的线性DNA，需用末端磷酸化和T4连接酶环化处理，从而获得具有定点突变的重组子。原理如图4 所示。另一种方法，以Stratagene 公司开发的定点突变试剂盒为代表，两个引物也是反向的并且其5’端有15个碱基以上的重叠区，扩增产物为带黏性末端的线性DNA，可自行环化。其原理及步骤见图5。上述两种方法理论上说既简单又经济，应该成为首选。但事实上要扩增出完整的质粒并非易事，尤其是当质粒较大时，这对聚合酶的质量提出较高的要求，另外循环参数也需精确调节，而且模板质粒要求至少有80%以上是超螺旋的，带切口的质粒不能作为模板。