细胞毒实验ppt课件

NK细胞可非特异直接杀伤靶细胞，这种天然杀伤活性既不需要预先由抗
YAC-1细胞为Moloney鼠科白血病毒(Mo-MuLV)感染的鼠T淋巴瘤细
胞，对NK细胞敏感，可用于检测NK细胞的杀伤活性。 原致敏，也不需要抗体参与，且无MHC限制。
系统中主要的效应细胞，是与T、B细胞并列的第三类群淋巴细胞。
培养YAC－1细胞 ＋10%FBS 1640培养液
死亡靶细胞 Cr释放
未死亡靶细胞
同位素释放法
• 本法结果准确、重复性好，但存在以下不足：
• ①使用放射性的51Cr不利于安全操作及废物处置，且需特殊测 定仪器； • ②51Cr自发释放率高，常因不同靶细胞标记效率变化差别大而 影响结果判定； • ③51Cr半衰期（27.8天），无法用于需多次测定的动物试验。 • ④细胞共育时间短而试验操作步骤多，不能在单个细胞水平进 行测定。
检测方法
• 血红蛋白酶释放法（HbE-Assay）
• 同位素释放法：
51Cr、125I-UdR
、3H-TdR 等
• 乳酸脱氢酶释放法 • MTT比色法 • 测定法
NK细胞介导的细胞毒试验
同位素释放法 乳酸脱氢酶释放法 MTT比色法
原理
NK（natural killer ）细胞属非特异性免疫细胞，为机体的天然免疫
淋巴因子激活的杀伤细胞（LAK）活性测 定
肿瘤浸润性淋巴细胞（TIL）活性测定
从肿瘤组织中分离到的淋巴细胞称为“肿瘤浸润性淋巴细胞” （TIL细胞），并发现这种细胞在体外经白细胞介素 2刺激后可 大量增殖。这种刺激后增殖的 TIL 细胞又称之为“肿瘤来源的 激活细胞”。它具有比 LAK 细胞更强的特异的杀瘤活性。由于 其特异高效的杀瘤活性，在实验研究及临床应用中，已展现出 用于临床治疗肿瘤的良好前景。
细胞毒实验
分类
原理
检测方法
应用
分类
细胞毒检测技术主要根据原理 不同进行区分
补体依赖细胞毒实验 细胞介导细胞毒实验 抗体依赖性细胞介导细胞毒实验（ADCC) 细胞毒性T淋巴细胞（CTL）活性测定 淋巴因子激活的杀伤细胞（LAK）活性测定
肿瘤浸润性淋巴细胞（TIL）活性测定
补体依赖的细胞毒实验
抗原与抗体结合
细胞毒性T淋巴细胞（CTL）活性测定
细胞毒T淋巴细胞 (CTL)活性测定是研究机体细胞免疫功 能的重要方法之一。传统的51 Cr释放法虽然有效 ,但也 存在某些不足。随着荧光标记、流式细胞分析和报告基 因等技术的广泛应用 ,促进了寻找灵敏可靠、简单易行 的非同位素法测定CTL活性的方法学研究。
LAK 细胞并非是一个独立的淋巴群或亚群，而是 NK 细胞或 T 细 胞体外培养时，在高剂量 IL-2 等细胞因子诱导下成为能够杀 伤NK不敏感肿瘤细胞的杀伤细胞，称为淋巴因子激活的杀伤细 胞（ lymphokine activated killer cells,LAK ）。目前应用 LAK 细胞过继免疫疗法（ adoptive immunotherapy ）与直接注 射IL-2等细胞因子联合治疗某些肿瘤，已获得一定的疗效。
NK细胞分离方法
• 密度梯度离心
Ficoll 密度梯度离心 Percoll密度梯度离心
• 磁化细胞分离器分离法
同位素释放法
同位素Βιβλιοθήκη Baidu放法
G0
Na2 51
G1
S
3 125 CrO4、 H-TdR、 I-UdR
New DNA Or Protein
cpm
试验孔 cpm 均值－自然释放孔 cpm 均值 SI 最大释放孔 cpm 均值－自然释放 cpm 均值
• 因此多年来人们一直试图寻找可以替代51Cr释放法的 CTL活性测定方法，如采用荧光标记、流式细胞分析 和报告基因等技术的灵敏可靠、简单易行的非同位素 测定法。
MTT（或MTS）还原法
本法根据细胞代谢活动与活细胞数直接成比例的原理，通过测定靶细 胞代谢活性的减少来反映效应细胞所致靶细胞的死亡。氧化型 MTT 进 入细胞后被线粒体脱氢酶还原生成蓝色 formazan颗粒，经溶剂溶解后 比色定量，其颜色深浅直接与活细胞数有关，与靶细胞对照孔比较可 计算效应细胞杀伤靶细胞 % 。本法简便易行，无需预标靶细胞，与 51Cr释放法比较相关性好，还可测定淋巴细胞增殖活性和 NK细胞活性。 MTT类似物MTS在细胞内还原的formazan产物具有水溶性，性质较稳定， 其测定简单快捷，特别适合于大批量测定。微生物污染可导致本法假 阳性结果。
+ 补体
台盼蓝染液
抗体依赖性细胞介导细胞毒实验 （ADCC）：
抗体依赖的细胞介导的细胞毒性作用是指表达IgGFc受体的 NK细胞、巨噬细胞和中性粒细胞等，通过与已结合在病毒感 染细胞和肿瘤细胞等靶细胞表面的IgG抗体的Fc段结合，而杀 伤这些靶细胞的作用，是不同效应细胞群介导的杀伤性效应机 制之一。
乳酸脱氢酶释放法-原理
乳酸脱氢酶(LDH)存在于细胞内，正常情况下，不能透过细胞膜
。当细胞受到损伤时， LDH可从细胞内释放至培养液中。释放出来的LDH在 + 催 化 乳 酸 生 成 丙 酮 酸 的 过 程 中 ， 使 氧 化 型 辅 酶 I(NAD ) 变 成 还 原 型 辅 酶 (NADH)，后者再通过递氢体-吩嗪二甲酯硫酸盐(PMS)还原碘硝基氯化氮唑蓝 (INT)或硝基氯化四氮唑蓝(NBT)形成有色的甲基化合物，在570nm波长处有一
吸收峰，利用读取的Ａ值，可测得杀伤细胞毒活性。
乳酸脱氢酶释放法
无色底物
靶细胞
YAC-1
NK
杀伤
靶细胞 膜损伤
LDH 释放到细胞外
LDH底物
还 原
有色物质
测OD570值
杀伤率( %)=
实验值-自发释放值
Max- S自发
×100
最大释放均值（Max）=最大释放孔cpm均值-最大释放对照孔cpm均值 自发释放均值（S自发）=自发释放孔cpm均值-培养基对照孔cpm均值
同位素释放法
• 应用放射性同位素（ 如51Cr）标记靶细胞， 当靶细胞受到NK细胞攻击，靶细胞被破坏， 释放出51Cr。51Cr辐射γ射线，通过测定受损 伤或死亡靶细胞释放到上清中51Cr的放射脉 冲数 （cpm)，即可计算出NK细胞活性。
同位素释放法
NK细胞
攻击
Cr标记靶细胞
利用测Cr的放射脉 冲得效应细胞活性