大豆制品脲酶活性测定优秀课件
脲酶活性的测定
大豆制品中脲酶活性的测定定性法：酚红法一、原理：酚红指示剂在pH 6.4-8.2时由黄变红，大豆制品中所含的尿素酶在pH=7.0，T=30℃时可将尿素水解产生氨，释放的氨可使酚红指示剂变红，根据变红的时间长短来判断脲酶活性的大小。
二、仪器和试剂：粉碎机：粉碎时不产生强烈发热；分析天平；25ml纳式比色管；恒温水浴锅；0.1%酚红指示剂：0.1g苯酚红溶于100ml 95%乙醇溶液；结晶尿素；三、方法：将试样粉碎，准确称取0.05±0.001g试样于25ml纳式比色管，加入0.2g结晶尿素及5滴酚红指示剂，加入25ml蒸馏水，摇动10s，立即置于30±0.5℃水浴锅中，开始计时，观察溶液颜色变化， 5min 后，取出比色管，摇匀，观察溶液颜色。
空白试验：不加尿素，其他同上。
品质判定：如果溶液为明显的粉红色，则认为该大豆制品脲酶活性超标，为不合格产品。
•0-1min变红，活性非常强（＞1.0）；•1-2min变红，活性大概0.5-1.0；•2-5min变红，活性大概0.3-0.5。
四、注意事项：1.粉碎样品时，不应产生大量热，否则会影响结果判定；2.称量样品时，一定要将样品混合均匀，否则会造成试验误差；3.试样和空白试验同时操作，过程要迅速，防止时间影响。
尿素-酚红法一、原理：酚红指示剂在pH 6.4-8.2时由黄变红，大豆制品中所含的尿素酶可将尿素水解产生氨，释放的氨可使酚红指示剂变红，根据变红样品占所有样品的比例来判断脲酶活性的大小。
二、仪器和试剂：表面皿；0.2N氢氧化钠溶液：称取0.8g氢氧化钠溶于100ml蒸馏水；1.0N硫酸溶液：移取7.0ml浓硫酸溶于500ml蒸馏水；尿素-酚红试剂：用500ml烧杯将0.8g酚红溶于20ml 0.2N氢氧化钠溶液，用蒸馏水稀释至约300ml，加入60g尿素，并溶解之，转移至2L容量瓶，冲洗烧杯数次,加蒸馏水至约1.5L，加入9.4ml 1.0N 硫酸溶液，用蒸馏水定容至2L；此时溶液应具有明亮的琥珀色；（过段时间溶液会变为深橘红色，可滴入稀硫酸溶液搅拌之，直至溶液再次变为琥珀色）三、方法：将一满匙样品放入表面皿中，摊平，将以调好的尿素-酚红试剂滴入表面皿中的样品上，直至完全浸湿，停留5min，观察样品的颜色反应。
脲酶快速检测方法(1)
大豆制品中尿素酶活性的测定方法
方法一尿素酶活性快速测定法——酚红法（粗略法）
1. 原理：尿素酶 +
尿素 氨气（用酚红作指示剂） 2.试剂
（1） 0.1N 氧化钠：称0.4g 氢氧化钠溶于100ml 水中。
（2） 0.1N 硫酸：将1.4ml 浓硫酸溶于l000ml 水中（先加水后加入硫酸） 3.尿素—酚红溶液：
0.14g 酚红溶于35ml 水中+7ml0.1N 氢氧化钠
混合 0.1N 硫酸滴定 琥珀色 21g 尿素溶于300ml 水中
方法：将一匙粉碎过的黄豆粕放入小玻皿中，将已调好的尿素——酚红溶液加入小玻皿中的豆粕上，直至完全锦湿，停留5min ，观察豆粕的红色反应。
稀硫酸0.2N
尿素—酚红试剂：将1.2g 酚红溶解于30ml0.2N 的氢氧化钠中，用蒸馏水将之稀释至约300ml,加入90g 尿素（分析纯）并溶解之，用蒸馏水稀释至2L ，加入14ml1.0N 硫酸或70ml0.2N 的硫酸；用蒸馏水稀释至最后体积3L ；溶液应具有明亮的琥珀色。
（过段时间溶液变为深桔红色，可滴入稀硫酸溶液搅拌之，直至溶液再次成为琥珀色。
方法：将一匙粉碎过的黄豆粕放入小玻皿中，将已调好的尿素——酚红溶液加入小玻皿中的豆粕上，直至完全锦湿，停留5min ，观察豆粕的红色反应。
溶液保质期最好3个月，最好一个月内用完。
大豆制品中尿素酶活性测定方法_1
大豆制品中尿素酶活性测定方法中华人民共和国专业标准蛋白酶活力测定法ZBX66030-87Measurementofproteinaseactivity本方法适用于酿造酱油时在制品菌种、成曲的蛋白酶活力测定。
1福林法试剂及溶液:以下试剂都为分析纯福林试剂(Folin试剂):于2000mL磨口回流装置内,加入钨酸钠(Na2WO4·2H2O)100g,钼酸钠(Na2MoO4·2H2O)25g,蒸馏水700mL,85%磷酸50mL,浓盐酸100mL,文火回流10h。
取去冷凝器,加入硫酸锂(Li2SO4)50g,蒸馏水50mL,混匀,加入几滴液体溴,再煮沸15min,以驱逐残溴及除去颜色,溶液应呈黄色而非绿色。
若溶液仍有绿色,需要再加几滴溴液,再煮沸除去之。
冷却后,定容至1000mL,用细菌漏斗(No4～5)过滤,置于棕色瓶中保存。
此溶液使用时加2倍蒸馏水稀释。
即成已稀释的福林试剂。
碳酸钠溶液:称取无水碳酸钠(Na2CO3),定容至1000mL。
三氯乙酸(TCA)溶液:称取三氯乙酸(CCL3COOH),定容至1000mL。
磷酸盐缓冲液:称取磷酸二氢钠(NaH2PO4·2H2O),定容至1000mL,即成溶液(A液)。
称取磷酸氢二钠(Na2HPO4·12H2O),定容至1000mL,即成溶液(B液)。
取A液28mL和B液72mL,再用蒸馏水稀释1倍,即成的磷酸盐缓冲液。
2%酪蛋白溶液:准确称取干酪素2g,称准至,加入氢氧化钠10mL,在水浴中加热使溶解(必要时用小火加热煮沸),然后用磷酸盐缓冲液定容至100mL即成。
配制后应及时使用或放入冰箱内保存,否则极易繁殖细菌,引起变质。
100μg/mL酪氨酸溶液:精确称取在105℃烘箱中烘至恒重的酪氨酸,逐步加入6mL1N盐酸使溶解,用盐酸定容至100mL,其浓度为1000μg/mL,再吸取此液10mL,以盐酸定容至100mL,即配成100μg/mL的酪氨酸溶液。
大豆中脲酶活性的测定
5.计算
溶液PH值与试剂空白PH值之差即为脲酶活 性，公式如下:
UA=B-A B——B管的PH值 A——A管的PH值
滴定法
a.原理: 将粉碎的大豆制品与中性的尿酸缓冲液 混合，在30℃保持30min，尿酸酶催化尿素产生 氨，用过量的盐酸中和氨，再用氢氧化钠溶液回 滴。酶的活性用1克分析材料在30℃下1min 产 生氨态氮的毫克数表示。（mgN/g）
e.结果计算
UA＝14×C(V0-V)/(30×m) C——氢氧化钾标准溶液浓度, mol/L； V0——空白试验消耗氢氧化钾的体 积, ml； V——测定试验消耗的氢氧化钾的 体 积, ml； m——试验质量, g。
比色法
原理: 向含有EDTA二钠盐的PH=7的缓冲 液的分析悬浮液中加入尿素溶液，在30℃ 下保温5min，加入磷钨酸终止酶作用并沉 淀蛋白质。产生的氨在次溴酸钠和麝香草 酚作用下形成蓝色的靛麝香草酚，借以比 色。
快速测定方法2
在培养皿上放入少量的豆饼粕, 在样品上 滴入少量指示剂并搅拌, 将其平铺于培养皿中, 放置5min后观察结果。 无任何红点出现, 再放置25min仍然无红点出现, 说明豆粕过熟； 有少量红点出现, 说明脲酶活性较低, 豆粕可用； 样品表面有25％被红点覆盖, 豆粕可用； 样品表面有50％被红点覆盖, 应慎用； 样品表面有75％－100％被红点覆盖, 脲酶活性过 高, 豆粕过生, 不可用；
2.实验仪器与器皿
PH计，带玻璃的电极，甘汞电极，恒温 水浴，50ml试管
3.试剂
磷酸缓冲液: 称取3.403克磷酸二氢钾，溶 于100ml的水中。再称取4.335克的磷酸 氢二钾，溶于100ml的水中，合并两者并 配制成1000ml，用酸或者碱调节PH=7。
大豆制品中尿素酶活性测定方法
大豆制品中尿素酶活性测定方法1 适用范围本标准适用于由大豆制得的产品和副产品中尿素酶活性的测定。
本法可确认大豆制品的湿热处理程度。
2 定义本标准所指尿素酶活性定义如下：在30±0.5℃和pH7的条件下, 每分钟每克大豆制品分解尿素所释放的氨态氮的毫克数。
3 原理将粉碎的大豆制品与中性尿素缓冲溶液混合，在30℃保持30min, 尿素酶催化尿素水解产生氨的反应。
用过量盐酸中和所产生的氨，再用氢氧化钠标准溶液回滴。
4 仪器设备4.1 样品筛: 孔径200μm;4.2 酸度计: 精度0.02pH, 附有磁力搅拌器和滴定装置;4.3 恒温水浴: 可控温30±0.5℃;4.4 试管: 直径18mm, 长150mm, 有磨口塞子;4.5 精密计时器;4.6 粉碎机: 粉碎时应不生强热(例如球磨机)4.7 分析天平: 感量0.1mg;4.8 移液管: 10ml。
5 试剂和溶液5.1 尿素(GB 696-77): 分析纯;5.2 磷酸氢二钠(GB 1263-77): 分析纯;5.3 磷酸二氢钾(GB 1274-77): 分析纯;5.4 尿素缓冲溶液(pH6.9至7.0): 4.45g磷酸氢二钠(5.2)和3.40g磷酸二氢钾(5.3)溶于水并稀释至1000ml, 再将30g尿素(5.1)溶于此缓冲溶液中, 可保存1个月。
5.5 盐酸(GB 622-77): 分析纯, 0.1M溶液;5.6 氢氧化钠(GB 629-77): 分析纯, 0.1M标准溶液, 按GB 601标准溶液制备方法的规定配制。
6 试样的制备用粉碎机(4.6)将10g试样粉碎, 使之全部通过样品筛(4.1)。
对特殊试样（水分或挥发物含量较高而无法粉碎的产品）应先在实验室温度下进行预干燥，再进行粉碎，当计算结果时应将干燥失重计算在内。
7 测定步骤称取约0.2g已粉碎的试样, 称准至0.1mg, 转入试管(4.4)中(如活性很高只称0.05g试样)移入10ml尿素缓冲溶液(5.4), 立即盖好试管并剧烈摇动, 马上置于30±0.5℃恒温水浴(4.3)中, 准确计时保持30min。
大豆制品脲酶活性测定解读
样品粉碎：至少60%通过400微米 试验筛。 （4）操作步骤 准确称取0.400±0.00lg样品2份， 分别置于2支试管中。一支试管加入 20mL磷酸缓冲液，作为空白试验（A 管），另一支加入20mL尿素缓冲液 （B管）。
盖塞混匀，在30℃恒温水浴中准 确保持30min。在此期间，每隔5min 摇匀一次。取出立即在流水中冷却， 5min内测定溶液pH值。
（4）注意事项： • 1.对于样品较粗、具有大块状的样品， 最好将其稍微粉碎，亦不可太细， 否则不容易观察； • 2.样品一定要铺平，容易观察； • 3.溶液保质期为3个月，最好1个月内 用完； • 4.此方法容易受颗粒度影响。
（二）定量法 1、 pH增值法 （1）原理： 脲酶水解尿素产生氨，使溶液的 pH值升高，通过测定样品溶液的pH 值和空白的pH值之差来计算脲酶的 活性。脲酶活性定义为：在30℃和 pH=7的条件下，每分钟每克大豆制 品分解尿素后所释放的氨态氮的毫 升数。
高温、高湿、高压，粒度小，时间 长脲酶活性低。但是，加工过度， 一些氨基酸会被豆制品质量较差。
三、测定原理： 脲酶活性测定实际上是在一定条件 下(pH=7.0，T=30℃)，测定每克试 样、每分钟分解尿素所产生的氨的 量。
脲酶 NH2CONH2→→2NH3↑+CO2
（5）计算 UA=pH(B管)-pH(A管)
2、滴定法 （1）原理： 将粉碎的大豆制品与中性尿素缓 冲溶液混合，在30℃保持30min后， 尿素酶催化尿素水解产生氨，用过 量的盐酸溶液中和氨，再用氢氧化 钠标准溶液回滴。
（2）脲酶活性定义 在30℃和pH＝7的条件下，每分 钟每克大豆制品分解尿素后，所释 放的氨态氮的毫克数。
（3）方法： 粉碎→称取0.05±0.001g→放入试 管→加入尿素0.2g、指示剂5滴→加 蒸馏水25mL→摇动10s→立即置于 30±0.5℃水浴锅→计时观察溶液变 红时间→5 min后取出试管，摇匀继 续观察
大豆制品中尿素酶活性测定方法_1
大豆制品中尿素酶活性测定方法中华人民共和国专业标准蛋白酶活力测定法ZBX66030-87Measurementofproteinaseactivity本方法适用于酿造酱油时在制品菌种、成曲的蛋白酶活力测定。
1福林法试剂及溶液:以下试剂都为分析纯福林试剂(Folin试剂):于2000mL磨口回流装置内,加入钨酸钠(Na2WO4·2H2O)100g,钼酸钠(Na2MoO4·2H2O)25g,蒸馏水700mL,85%磷酸50mL,浓盐酸100mL,文火回流10h。
取去冷凝器,加入硫酸锂(Li2SO4)50g,蒸馏水50mL,混匀,加入几滴液体溴,再煮沸15min,以驱逐残溴及除去颜色,溶液应呈黄色而非绿色。
若溶液仍有绿色,需要再加几滴溴液,再煮沸除去之。
冷却后,定容至1000mL,用细菌漏斗(No4～5)过滤,置于棕色瓶中保存。
此溶液使用时加2倍蒸馏水稀释。
即成已稀释的福林试剂。
碳酸钠溶液:称取无水碳酸钠(Na2CO3),定容至1000mL。
三氯乙酸(TCA)溶液:称取三氯乙酸(CCL3COOH),定容至1000mL。
磷酸盐缓冲液:称取磷酸二氢钠(NaH2PO4·2H2O),定容至1000mL,即成溶液(A液)。
称取磷酸氢二钠(Na2HPO4·12H2O),定容至1000mL,即成溶液(B液)。
取A液28mL和B液72mL,再用蒸馏水稀释1倍,即成的磷酸盐缓冲液。
2%酪蛋白溶液:准确称取干酪素2g,称准至,加入氢氧化钠10mL,在水浴中加热使溶解(必要时用小火加热煮沸),然后用磷酸盐缓冲液定容至100mL即成。
配制后应及时使用或放入冰箱内保存,否则极易繁殖细菌,引起变质。
100μg/mL酪氨酸溶液:精确称取在105℃烘箱中烘至恒重的酪氨酸,逐步加入6mL1N盐酸使溶解,用盐酸定容至100mL,其浓度为1000μg/mL,再吸取此液10mL,以盐酸定容至100mL,即配成100μg/mL的酪氨酸溶液。
酶活性的测定PPT课件
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２、过氧化物酶活性的测定 酶活性测定的反应体系包括:2.9ml 0.05mol/L磷酸缓冲液、1.0ml
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• 方法比较：
• 研究认为，化学滴定法重复性差、紧密度低、操作繁琐、检测线低，不适于大批 量的样品测定。其优点是不需要任何特殊的仪器，适用性比较广泛。
• 紫外分光光度法具有重现性好，操作简单、快速、检测线相对较低得到优点。但 是对于测定底物或产物改变量方面不太准确。
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10mmol/LHCl 配制成 6mmol/L溶液存放于冰
箱备用。
2.仪器: 紫外分光光度计，酸度计，恒温
水浴锅
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实验步骤：
（1）.邻苯三酚自氧化速率测定：
在试管中加入4.5ml 50mmol/LTris缓冲溶液 ，于25℃保温20min,加入10～20ul 30mmol/L 邻苯三酚，立即计时并摇匀，倾于比色杯内， 于325nm下，每隔1min测吸光值一次，空白以 10mmol/L HCl代替邻苯三酚，要求自氧化速 率控制在0.070 OD/min左右。
• 式中 • • • •
A—对照KMnO4滴定毫升数； B—酶反应后KMnO4滴定毫升数； VT—酶液总量（ml）； V1—反应所用酶液量（ml）; W—样品鲜重（g）；
• 1.7mg
1.7—1ml H2O2。
0.1mol/L的KMnO4相当于
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脲酶活性的测定PPT资料(正式版)
液混合，在30℃保持30分钟，尿素酶催化 001g样品于称量瓶中，加入10ml尿素缓冲溶液，加塞混合，然后置于30℃水浴中，在混合操作时称量瓶切勿倒置。
将粉碎的大豆制品与中性尿素缓冲溶液混合，在30℃保持30分钟，尿素酶催化尿素水解产生氨，由于尿素水解释放的氨是碱性的，可 使溶液PH值升高，试样溶液与空白溶液的PH值之差，即可间接表示出氨量的多少。
勿倒置。
2、空白试验：
准确称取0.200±0.001g样品于 称量瓶中，加入10ml0.05mol/L磷 酸盐缓冲溶液，加塞混合，置于 30℃水浴中。
3、样品试验与空白试验的制备应相 隔5分钟，并且每隔5分钟搅拌内 容物一次。
4、30分钟后，相隔5分钟将样品与空 白试验的称量瓶从水浴中取出，将 上层液体移入5ml烧杯中，在从水 浴中取出刚达5分钟时，分别测定 此种上层液体的PH值。
六、结果的计算
1、计算公式：
样品试验的PH值与空白试验的PH值 两者之间的差异，则为脲酶活性的指数， 即：
脲酶活性 = 试样的PH测定值-空白的PH测定值
2、重复性：
每个样品应取两个平行样测定， 以其算术平均值为结果。
七、注意事项
1、关于酸度计的使用
2、称量瓶应塞紧
3、关于固定质量称量法
4、通常： 0.02<△PH≤0.3 加工适度 △PH<0.02 加工过度 △PH>0.3 加工不够
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准确称取0.
与空白溶液的PH值之差，即可间接表示出 3、关于固定质量称量法
05mol/L磷酸盐缓冲液、尿素缓冲溶液等 分析天平、样品粉碎机、样品分析筛、恒温水浴、酸度计、称量瓶、移液管、角匙等
脲酶活性
随着膨化技术在饲料工业中推广普及，越来越多的饲料生产商在配方中使用膨化大豆粉，与其它蛋白资源一样，大豆的适度熟化非常重要，熟化程度低会含抗胰蛋白酶等营养抑制因子，熟化度过高又会导致氨基酸利用率低。
判断膨化大豆粉是否合格的主要指标是脲酶活性。
脲酶活性是指：在30±5℃和PH值等于7的条件下，每分钟每克膨化大豆分解尿素所释放的氨态氮的毫克数。
脲酶本身无营养意义，但它与抗胰蛋白酶的含量接近，并且遇热变性失活的程度与抗胰蛋白酶相似，因此，尿酶活性用来作为膨化大豆加热是否合适的间接估测指标。
脲酶活性没有负值，最低为0。
在我国现行的国标推荐值为0.3，在美国一般认为以不超过0.2为宜，并且针对日粮中有尿素的反刍动物而言不得超过0.12，当然对于家禽和猪0.3或稍高都可以接受。
国内很多大企业一般均采用0.2。
实验室定量测定脲酶活性的方法较复杂，有滴定法和pH增值法两种，已有研究表明两者对同一样品测得的数值也不相等。
目前国内绝大部分企业都采用快速而简单的简易判定方法定性地估测脲酶活性，一般来说，主要有如下两种方法。
一.液态法1.原理：大豆制品中的脲酶可使尿素分解成氨，会使酚红指示剂改变颜色。
2.试剂2.1尿素:GB696，分析纯。
2.2酚红指示剂2.2.1称取0.1g酚红，加1.43mL0.1mol/L氢氧化钠溶液，在研钵中研磨以促溶解；2.2.2转移至250mL定量瓶中，加蒸馏水至刻度，摇匀备用。
3.操作方法3.1取0.2g粉末样品，置于25mL比色管中。
3.2加0.02g尿素，加酚红指示剂2滴，再加水20mL，充分摇匀15s。
3.3记录粉红色出现时间，并根据时间判断尿酶活性，颜色出现时间应少于15min。
颜色出现时间脲酶活性1min 极强1～5min 强5～15min 稍有15min 无同时作空白对照试验。
样品空白(不加尿素)及试剂空白(不加样品)，只有上述空白正常时，即酚红指示剂不改变颜色，试验结果才是可靠的。
脲酶的分离纯化及比活性测定
General principles of protein purification
Complicated and specific “Black art”
SOURCE OF MATERIAL
• Concentration: choose tissue, organism with high production/concentration of target protein • Developmental stage: Does level of protein change with development? • Subcellular localization • Use of expression system
4
0.4 0.8 2.6
5
0.5 1 2.5
6
0.6 1.2 2.4
7
3
混匀
奈氏试剂 A480 0.75ml, 混匀，测A480
硫酸铵标准曲线制作
1.2 1.0 0.8 A480
NH3的μmol数 = A480 K
0.6 0.4 0.2 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 含NH3的μmol数
脲酶活性检测-2
2. 酶促反应
洗脱液 空白 粗提液 (1:20稀释)
1
3%尿素(ml) 0.5 0.1M PBS 酶液 H2O 1.0 -0.5 0.5 1.0 0.5 --
2
0.5 1.0 0.5 --
3
0.5 1.0 0.5 --
…
0.5 1.0 0.5 --
9
0.5 1.0 0.5 --
10
1
上述反应液 0.5
2
3
…
9
脲酶活性测定方法pH增值法、盐酸中和法
MM_FS_CNJ_0315出口大豆饼粕脲酶活性 pH增值法盐酸中和法MM_FS_CNJ_0315出口大豆饼粕脲酶活性测定方法pH增值法、盐酸中和法1.适用范围本方法适用于大豆饼粕类脲酶活性的测定。
2.方法一2.1.术语脲酶活性：在规定的操作条件下，使试样中的脲酶分解尿素释放出氨基氮，以溶液pH值的变量表示。
2.2.原理概要将研细的试样与缓冲尿素溶液混合，在30℃作用30min后，测定溶液的pH值。
2.3.主要试剂和仪器2.3.1.主要试剂磷酸缓冲溶液：将3.403g KH2PO4和4.355g K2HPO4溶解并稀释至1000mL。
临用前，以强酸或强碱调节其pH至7.0，其使用期限不超过90d；缓冲的尿素溶液：溶15g尿素（NH2CONH2）于500mL磷酸缓冲溶液中。
加入5mL甲苯，用于防腐和防止霉菌生长。
按上法调节其pH至7.0。
2.3.2.仪器分析天平：感量0.1mg；研磨器：易于清理，研磨过程中不发热，并能达到要求的磨粉细度；恒温水浴：能控制于30±0.5℃；pH计：备有玻璃电极和甘汞电极，灵敏度不低于±0.02pH单位，同时附有温度补偿；试管：直径22mm，长150mm，具橡胶塞；烧杯：容量10mL；单刻度移液管：10mL；精密计时器；标准筛。
2.4.试样的制备用研磨器将约10g的样品，在不升高温度的条件下尽可能研细，使其通过60目标准筛的量不少于60％。
收集全部磨碎物于广口瓶中，小心混合并立即进行分析。
2.5.过程简述准确称取试样0.200g，放入试管内，加10mL缓冲的尿素溶液，塞好橡胶塞，混匀。
置于30±0.5℃水浴中，记下时间。
隔5min放入第二个与此相同的试管作重复试验。
另称试样0.200g，放另一试管内，加10mL磷酸缓冲溶液，塞好橡胶塞，混匀，作为空白试验。
与上管间隔5min置于同一水浴中。
在消化过程中，每隔5min将试管内容物都摇匀一次。
大豆制品脲酶活性测定 PPT
（4）注意事项： • 1.粉碎样品时，不应产生大量热，
否则会影响结果判定； • 2.称量样品时，一定要将样品混合
均匀，否则会造成试验误差； • 3.试样和空白试验同时操作，过程
要迅速，防止时间影响。
2、尿素酚红法 （1）原理：酚红指示剂在pH 6.4-8.2
时由黄变红，大豆制品中所含的尿 素酶可将尿素水解产生氨，释放的 氨可使酚红指示剂变红，根据变红 样品占所有样品的比例来判断脲酶 活性的大小。
（2）仪器和试剂： • 粉碎机：粉碎时不产生强烈发热 • 分析天平：感量0.01g • 25ml纳式比色管 • 恒温水浴锅 • 0.1%酚红指示剂：0.1g苯酚红溶于
100ml 95%乙醇溶液 • 结晶尿素：分析纯
（3）方法：
粉碎→称取0.05±0.001g→放入试 管→加入尿素0.2g、指示剂5滴→加 蒸馏水25mL→摇动10s→立即置于 30±0.5℃水浴锅→计时观察溶液变 红时间→5 min后取出试管，摇匀继 续观察
大家有疑问的，可以询问和交流
可以互相讨论下，但要小声点
空白试验：不加尿素，其他同上。
品质判定：如果溶液为明显的粉红 色，则认为该大豆制品脲酶活性超 标，为不合格产品。
•0-1min变红，活性非常强（＞ 1.0）；
•1-2min变红，活性大概0.5-1.0； • 2-5min变红，活性大概0.3-0.5。
（4）注意事项： • 1.对于样品较粗、具有大块状的样品，
最好将其稍微粉碎，亦不可太细， 否则不容易观察； • 2.样品一定要铺平，容易观察； • 3.溶液保质期为3个月，最好1个月内 用完； • 4.此方法容易受颗粒度影响。
大豆制品脲酶活性测定教学内容
盐酸：分析纯，0.1mol/L溶液 氢氧化钠：分析纯，0.1mol/L标推溶液，
按GB 601-77《标准溶液制备方法》的规 定(guīdìng)配制。
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（5）操作方法 称取0.2g试样→转入试管→加入10mL 尿素缓冲液→立即盖塞、剧烈摇动→马上 置于30±0.5℃恒温水浴→准确计时 30min→加入10mL0.1mol/L盐酸→迅速冷 却(lěngquè)到20℃→内容物全都转入烧杯 →立即用氢氧化钠标淮溶液滴定到pH4.70。
尿素缓冲液：称取15g尿素，溶于 500mL磷酸缓冲液中，调节pH=7.0。
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样品粉碎：至少60%通过400微米试验 (shìyàn)筛。 （4）操作步骤
准确称取0.400±0.00lg样品2份，分别 置于2支试管中。一支试管加入20mL磷酸 缓冲液，作为空白试验(shìyàn)（A管）， 另一支加入20mL尿素缓冲液（B管）。
将粉碎的大豆制品与中性尿素缓冲溶 液(róyè)混合，在30℃保持30min后， 尿素酶催化尿素水解产生氨，用过量的 盐酸溶液(róngyè)中和氨，再用氢氧化钠 标准溶液(róngyè)回滴。
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（2）脲酶活性定义 在30℃和pH＝7的条件下，每分钟每
克大豆制品分解(fēnjiě)尿素后，所释放 的氨态氮的毫克数。
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空白试管→加入10mL尿素缓冲液→ 加入10mL0.1mol/L盐酸→称取0.2g试样加 入试管→立即盖塞、剧烈摇动→马上置 于30±0.5℃恒温水浴→准确计时30min→ 迅速冷却到20℃→内容物全都(quándōu) 转入烧杯→立即用氢氧化钠标准溶液滴 定到pH4.70。
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（4）注意事项： • 1.对于样品较粗、具有大块状的样品，
最好将其稍微粉碎，亦不可太细， 否则不容易观察； • 2.样品一定要铺平，容易观察； • 3.溶液保质期为3个月，最好1个月内 用完； • 4.此方法容易受颗粒度影响。
（二）定量法
1、 pH增值法
（1）原理：
脲酶水解尿素产生氨，使溶液的 pH值升高，通过测定样品溶液的pH 值和空白的pH值之差来计算脲酶的 活性。脲酶活性定义为：在30℃和 pH=7的条件下，每分钟每克大豆制 品分解尿素后所释放的氨态氮的毫 升数。
•
四、测定方法： （一）定性法： 1、酚红法 （1）原理：
酚红指示剂在pH 6.4-8.2时由黄变 红，大豆制品中所含的脲酶pH=7.0， T=30℃时可将尿素水解产生氨，释 放的氨可使酚红指示剂变红，根据 变红的时间长短来判断脲酶活性的 大小。
（2）仪器和试剂： • 粉碎机：粉碎时不产生强烈发热 • 分析天平：感量0.01g • 25ml纳式比色管 • 恒温水浴锅 • 0.1%酚红指示剂：0.1g苯酚红溶于
高温、高湿、高压，粒度小，时间 长脲酶活性低。但是，加工过度， 一些氨基酸会被破坏。所以脲酶活 性过高（豆制品过生）或过低（豆 制品过熟）都表明豆制品质量较差。
三、测定原理： 脲酶活性测定实际上是在一定条件
下(pH=7.0，T=30℃)，测定每克试 样、每分钟分解尿素所产生的氨的 量。
脲酶 NH2CONH2→→2NH3↑+CO2
100ml 95%乙醇溶液 • 结晶尿素：分析纯
（3）方法：
粉碎→称取0.05±0.001g→放入试 管→加入尿素0.2g、指示剂5滴→加 蒸馏水25mL→摇动10s→立即置于 30±0.5℃水浴锅→计时观察溶液变 红时间→5 min后取出试管，摇匀继 续观察
空白试验：不加尿素，其他同上。
品质判定：如果溶液为明显的粉红 色，则认为该大豆制品脲酶活性超 标，为不合格产品。
此时溶液应具有明亮的琥珀色； （过 段时间溶液会变为深橘红色，
可滴入稀硫酸溶液搅拌之，直至溶 液再次变为琥珀色）
（3）方法：
将一满匙样品放入表面皿中， 摊平，将以调好的尿素-酚红试剂滴 入表面皿中的样品上，直至完全浸 湿，停留5min，观察样品的颜色反 应。
如果红斑面积多于20%，则认为 该样品脲酶活性超标，为不合格产 品。
（5）计算 UA=pH(B管)-pH(A管)
2、滴定法
（1）原理：
将粉碎的大豆制品与中性尿素缓 冲溶液混合，在30℃保持30min后， 尿素酶催化尿素水解产生氨，用过 量的盐酸溶液中和氨，再用氢氧化 钠标准溶液回滴。
（2）脲酶活性定义
在30℃和pH＝7的条件下，每分 钟每克大豆制品分解尿素后，所释 放的氨态氮的毫克数。
要迅速，防止时间影响。
2、尿素酚红法 （1）原理：酚红指示剂在pH 6.4-8.2
时由黄变红，大豆制品中所含的尿 素酶可将尿素水解产生氨，释放的 氨可使酚红指示剂变红，根据变红 样品占所有样品的比例来判断脲酶 活性的大小。
（2）仪器和试剂：
表面皿；
0.2N氢氧化钠溶液：称取0.8g氢氧化 钠溶于100ml蒸馏水；
(3)仪器与设备 ❖样品筛：孔径200μm ❖酸度计：精度0.02pH，附有磁力搅
拌器和滴定装置
❖恒温水浴：可控温30±0.5℃ ❖试管：直径18mm，长150mm，有磨
口塞子
❖精密计时器
❖粉碎机：粉碎时应不生强热（如球 磨机）
❖分析天平：感量0.1mg ❖移液管：10m1
（4）试剂 尿素：分折纯。 磷酸氢二钠：分析纯。 磷酸二氢钾：分析纯。 尿素缓冲液（pH 6.9至7.0）：4.45g
（2）仪器与器皿
❖酸度计（pH计）：具有玻璃电极、 甘汞电极
❖恒温水浴：须能保持温度30±0.5℃ ❖试管：20×150mm并配有橡皮塞
（50mL）
（3）试剂
磷酸缓冲液0.05mol/L：称取 3.403gKH2PO4溶于100mL蒸馏水中。 再称取4.355gK2HPO4溶于100mL蒸馏 水中，合并两者并配成1000mL，用 强酸或强碱调节pH=7.0。
大豆制品脲酶活性测定
一、测定的原因：
生大豆含有多种能被热破坏的抗营 养因子（如抗胰蛋白酶）。大豆中脲酶 的含量与抗胰蛋白酶成正相关，且能很 快、很经济地予以测定。所以，测定脲 酶的活性（UA），就可以预测大豆饼 粕的加工程度是否适当及营养品质的优 劣。
二、影响大豆制品脲酶活性的因素：
• ①大豆加热过程中的温度； • ②大豆原料最初的水分含量； • ③大豆粒度的大小； • ④加热时所用压力的大小； • ⑤大豆加热时间的长短。
尿素缓冲液：称取15g尿素，溶于 500mL磷酸缓冲液中，调节pH=7.0。
样品粉碎：至少60%通过400微米 试验筛。
（4）操作步骤
准确称取0.400±0.00lg样品2份， 分别置于2支试管中。一支试管加入 20mL磷酸缓冲液，作为空白试验（A 管），另一支加入20mL尿素缓冲液 （B管）。
盖塞混匀，在30℃恒温水浴中准 确保持30min。在此期间，每隔5min 摇匀一次。取出立即在流水中冷却， 5min内测定溶液pH值。
•0-1min变红，活性非常强（＞ 1.0）；
•1-2min变红，活性大概0.5-1.0； • 2-5min变红，活性大概0.3-0.5。
（4）注意事项： • 1.粉碎样品时，不应产生大量热，
否则会影响结果判定； • 2.称量样品时，一定要将样品混合
均匀，否则会造成试验误差； • 3.试样和空白试验同时操作，过程
磷酸氢二钠和3.40g磷酸二氢钾溶于 水并稀释至1000mL，再将30g尿素 溶于此缓冲溶液中，
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
盐酸：分析纯，0.1mol/L溶液
氢氧化钠：分析纯，0.1mol/L标推溶液， 按GB 601-77《标准溶液制备方法》的规 定配制。
1.0N硫酸溶液：移取14.0ml浓硫酸溶 于500ml蒸馏水；
尿素-酚红试剂：用500ml烧杯将 0.8g酚红溶于20ml 0.2N氢氧化钠溶 液，用蒸馏水稀释至约300ml，加入 60g尿素，并溶解之，转移至2L容量 瓶，冲洗烧杯数次,加蒸馏水至约 1.5L，加入9.4ml 1.0N硫酸溶液，用 蒸馏水定容至2L；